全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(6): 984−990 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

基金项目: 国家高技术研究发展计划(863 计划)项目(2007AA10Z130, 2006AA10Z115); 国家自然科学基金项目(30700504)
作者简介: 鲁燕(1980−), 女, 河北唐山人, 硕士, 研究方向为生物技术。
*
通讯作者(Corresponding authors): 马有志(1963−), 男, 吉林梅河口人, 研究员, 博士生导师, 研究方向为分子生物学。Tel: 010-68918789;
E-mail: mayouzhi@yahoo.com.cn; 徐兆师(1976−), 男, 山东青岛人, 助理研究员, 博士, 研究方向为分子生物学。Tel: 010-68918789; E-mail:
xuzhaoshi@yahoo.com.cn
Received(收稿日期): 2007-05-29; Accepted(接受日期): 2008-01-27.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.00984
W6基因的过表达提高转基因烟草的耐盐性
鲁 燕 1,2 徐兆师 2,* 张瑞越 2,3 刘 丽 2 李连城 2 陈 明 2 叶兴国 2
陈耀锋 1 马有志 2,*
(1 西北农林科技大学农学院, 陕西杨凌 712100; 2 中国农业科学院作物科学研究所 / 国家农作物基因资源与遗传改良重大科学工程 /
农业部作物遗传育种重点开放实验室, 北京 100081; 3 淮阴师范学院生物系, 江苏淮安 223300)
摘 要: W6基因是由普通小麦地方品种小白麦 cDNA文库中克隆获得的 ERF类转录因子, 属于 ERF IV家族。将 W6
基因构建在由组成型 CaMV35S 强启动子控制的双子叶转化载体 pBI121 上, 通过农杆菌介导法将其转入烟草新华 1
号。利用 RT-PCR 技术分析 W6 基因的过量表达对下游抗性基因表达水平的影响, 并测定高盐胁迫下转基因烟草的
SOD酶活性和叶绿素含量。结果显示, 所检测的转基因烟草阳性株中 W6基因均有不同程度的表达, 其耐盐性明显提
高。W6基因的表达诱导并增强了含有 GCC box的 PR(pathogenesis-related)基因和含有 DRE/CRT元件的 COR/RD基
因的表达。在高盐胁迫下, 转基因烟草的 SOD酶活性和叶绿素含量明显高于对照。W6基因既能诱导抗病相关的 PR
基因表达又能诱导与提高非生物胁迫能力的 COR/RD 基因表达, 可能与生物胁迫和非生物胁迫相关, 证实转录因子
W6参与了耐盐胁迫相关基因的调节, W6基因的过表达提高了转基因烟草的耐盐性。
关键词: ERF; 转基因; 耐盐性; 烟草
Overexpression of W6 Gene Increases Salt Tolerance in Transgenic To-
bacco Plants
LU Yan1,2, XU Zhao-Shi2,*, ZHANG Rui-Yue2,3, LIU Li2, LI Lian-Cheng2, CHEN Ming2, YE Xing-Guo2,
CHEN Yao-Feng1, and MA You-Zhi2,*
(1 College of Agriculture, Northwest A&F University, Yangling 712100, Shaanxi; 2 Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sci-
ences / National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement / Key Laboratory of Crop Genetics and Breeding, Ministry of Ag-
riculture, Beijing 100081; 3 Department of Biology, Huaiyin Normal College, Huai’an 223300, Jiangsu, China)
Abstract: Ethylene responsive factors (ERFs) are important plant-specific transcription factors. Some of them have been identi-
fied to interact with the ethylene-responsive GCC box and the dehydration responsive element (DRE). They usually play very
important regulatory roles in response to biotic and abiotic stresses in plants. In our study, an ERF gene W6 was isolated from
wheat (Xiao baimai) cDNA library, which belongs to ERF IV subfamily. Full-length W6 cDNA encoded an ERF protein contain-
ing a conserved ERF DNA-binding motif, two putative nuclear localization sequences and a C-terminal acidic transcription acti-
vation domain. W6 expression in wheat can be induced by various treatments such as cold, drought, salt, ABA and fungal patho-
gens. We constructed transgenic vector (35S::pBI121::W6) containing CaMV 35S promoter and then obtained W6-overexpresed
tobacco plants by Agrobacterium-mediated transformation in order to identify the function of W6. Under the treatment with 200
mmol L-1 NaCl for 50 d, the transgenic plants grew well but the control plants nearly died. The root length of transgenic tobacco
plants was between 1.40 cm and 3.93 cm, while that of the control only 0.20 cm. The root weight of transgenic tobacco plants was
between 2.41 g and 7.79 g, while that of the control only 0.06 g. SOD activity and chlorophyll content in transgenic plants in-
creased markedly compared to the control. All results the above showed that the overexpression of W6 improved tobacco’s salt
tolerance, and W6 may act as a connector among different signal transduction pathways. The overexpression of W6 activated the
expression of GCC box-containing genes PR2, PR3, PR5, and DRE/CRT genes NtERD10A and NtERD10C under normal growth
第 6期 鲁 燕等: W6基因的过表达提高转基因烟草的耐盐性 985


conditions, and the tolerance to salt stress was improved in transgenic tobacco plants, which suggested that W6 regulates osmotic
tolerance by activation of downstream gene expression through interaction with the GCC box or DRE.
Keywords: ERF; Transgenic plants; Salt tolerance; Tobacco
据不完全统计, 目前世界盐渍土壤面积约为 10
亿公顷, 占世界土地总面积的 10%。我国有各种类
型的盐渍土近 1 亿公顷, 且随着人口的不断增长、
环境污染、不合理灌溉, 过量施用化肥等因素使土
壤愈发严重盐碱化, 农业生产与可利用耕地间的矛
盾日益加剧。因此, 培育和利用耐盐作物品种对于
扩大种植面积, 提高产量都具有重要意义。
在耐盐育种中, 通过导入功能基因获得耐盐转
基因作物品种的研究已取得了一定的成果[1]。如将
BADH(甜菜碱乙醛脱氢酶)基因转入烟草和番茄中
能明显提高转基因植株的甜菜碱含量和耐盐性[2-3]。
转 P5CS(砒咯琳-5-羧酸合成酶)基因的小麦在盐胁
迫下能大量积累脯氨酸 , 耐盐性也明显提高 [4]。
mtlD(1-磷酸甘露醇脱氢酶)和 gutD(6-磷酸山梨醇脱
氢酶)基因分别对甘露醇和山梨醇合成起关键作用,
将其单独或共同转入烟草、水稻、玉米等多种作物,
均不同程度地提高转基因植株的耐盐性[5]。LEA 蛋
白是种子发育晚期胚胎中大量积累的一类蛋白质 ,
主要参与植物对干旱和渗透胁迫的调节[6]。将 LEA
蛋白家族中的 HVA1 基因转入燕麦, 使其耐盐性提
高[7]; 导入LEA蛋白ME-leaN4基因的莴苣也获得了
更强的耐盐性和耐旱性[8]。
近年来, 抗逆基因工程的研究重点逐步转向与
逆境胁迫相关的调控基因[9]。转录因子大多与生物
和非生物胁迫下抗逆基因的表达调控相关, 已成为
逆境胁迫信号调控网络研究的重点之一 [10]。
AP2/EREBP 类转录因子广泛存在于植物, 在拟南芥
中已发现 145个成员, 一般分为 AP2、RAV、DREB、
ERF和 AL079349 5个亚族。其中, ERF亚族包括 65
个基因 , 大都参与生物和非生物胁迫信号的传导 ,
调控下游功能基因的表达[11]。例如, Cao等分离得到
3个水稻 ERF类转录因子 OsBIERF1、OsBIERF3和
OsBIERF4, 其表达受病原菌、盐、低温, 干旱等胁
迫诱导[12]。Tang 等[13]将麻疯树的 JcERF 基因在拟
南芥中过量表达 , 提高了拟南芥的抗盐性和抗冻
性。最近的研究表明, 马铃薯 StEREBP1基因的过量
表达可诱导下游抗性基因表达, 并提高转基因马铃
薯对高盐和低温胁迫的耐受力[14]。植物在遭受逆境
胁迫时会发生一系列生理生化变化。长期盐胁迫将
导致叶片中盐分积累 , 增加植物叶绿素酶的活性 ,
促进叶绿素分解, 使叶片变黄, 光合作用下降[15]。因
此, 叶绿素的破坏程度可以作为植物在盐胁迫下组
织受损程度的判定标准之一[16]。此外, 盐胁迫会导
致细胞内活性氧累积, 产生氧化胁迫。SOD、CAT、
POD 等活性氧清除酶能调节细胞内的活性氧水平,
减弱细胞内因活性氧大量积累而造成的伤害[17]。研
究发现 , 活性氧清除酶系统活性较高的植物对高
盐、干旱, 低温等环境胁迫的耐受性也较强[18]; 其中
SOD在氧化胁迫反应早期起主要调节作用[17]。
本实验室从普通小麦农家种小白麦的 cDNA 文
库中分离到一个 ERF 类转录因子 W6 基因, 属于
ERF IV 家族。该基因具有一个由 59 个氨基酸组成
的 AP2 保守域, 第 14 位和第 19 位的氨基酸分别是
丙氨酸和天冬氨酸, 是典型的 ERF转录因子[11]。与
W6 基因同源性较高的 JERF1 基因能够明显提高转
基因番茄的耐盐性[19]。CaERFLP1 基因与 W6 基因
属于同一家族, 它能提高转基因烟草的耐盐性和抗
病性[20]。因此, 推测 W6基因可能与抗生物和非生物
胁迫相关, 我们将该基因构建在 pBI121载体上并转
化烟草新华 1号, 分析了W6基因在烟草中的过量表
达对下游抗性基因的影响, 及高盐胁迫下的 SOD酶
活性和叶绿素含量, 筛选了耐盐转基因烟草株系。
1 材料和方法
1.1 材料和试剂
烟草品种新华 1 号, 转基因载体 pBI121, 均由
本实验室保存; 农杆菌菌株 C58C1 和辅助菌株为
pRK2013。热激转化感受态细胞(DH5α)购自北京天
为时代公司 , 反转录试剂盒购自 TaKaRa 公司 ,
DL2000 DNA Marker购自法特捷公司, Taq酶、连接
酶及各种内切酶购自 Promega 公司和 TaKaRa 公司,
引物和测序工作由北京奥科生物技术公司完成。
1.2 转化载体的构建
将含有 W6 基因的 pGEM-T easy-W6 质粒和
pBI121载体用 Spe I和 Sal I双酶切, 1.2%琼脂糖电
泳确认后分别切胶回收 (凝胶回收试剂盒购自
TaKaRa公司)获得 W6基因和酶切载体的目的片段。
然后将 W6片段和载体片段按照摩尔比 3 1∶ 进行连
接, 热激转化(参考天为时代公司的 DH5α 感受态细
胞热激转化方法), 获得转化载体 pBI121-W6, 该载
986 作 物 学 报 第 34卷

体中W6基因的表达受 CaMV35S组成型启动子调控,
该质粒载体上还含有标记基因 nptII(Kana 抗性基
因)。经测序鉴定转基因载体正确性, 通过三亲杂交
法获得含有 W6基因的农杆菌转化用菌株。
1.3 农杆菌介导法转化烟草及再生苗的获得
将烟草新华 1 号的无菌苗叶片在 MS 固体培养
基上预培养 3 d。农杆菌(C58C1)培养至对数生长期
(OD600至 0.5~0.6 之间)侵染烟草叶片, 在含 0.2 mg
L−1 IAA和 2.0 mg L−1 6-BA的 MS固体培养基上共
培养 2 d, 然后转入含 0.2 mg L−1 IAA、2.0 mg L−1
6-BA、500 mg L−1羧苄青霉素和 200 mg L−1卡那霉
素的 MS固体筛选培养基上培养。待不定芽长至 0.5
cm时, 转移到含 500 mg L−1羧苄青霉素和 100 mg
L−1卡那霉素的 MS培养基上生根。
1.4 转基因烟草的鉴定
用 CTAB 法[2]提取烟草叶片基因组 DNA 作为
PCR反应模板。用筛选标记基因 nptII的特异引物进
行 PCR检测。nptII基因引物 NpIIF为 5′-TGTTCCG
GCTGTCAGCG-3′, NpIIR 为 5′-TCGGCAAGCAGG
CATCG-3′。PCR程序为: 94℃变性 50 s, 68℃退火 45
s, 72℃延伸 60 s, 40个循环。PCR产物经 1.0%琼脂
糖凝胶电泳, EB染色后利用紫外凝胶成像系统拍照,
目的条带大约为 476 bp。
随机选取 5个 PCR检测阳性的转基因株系, 进
行 W6 基因的转录表达分析。采用 Trnzol 试剂盒方
法(天为时代)提取叶片总 RNA。采用 TaKaRa 公司
反转录试剂盒方法将 RNA反转录为 cDNA, 作为进
一步 PCR 扩增的模板。用烟草 Actin 基因的特异引
物进行模板均一化调整 , Actin 基因的特异引物
ActinF 为 5′-TACCTAGGAGTCGTTCGC-3′; ActinR
为 5′-ATGGCAACTTAATTACGG-3′。PCR 程序为:
94℃变性 45 s, 62℃退火 45 s, 72℃延伸 50 s, 24个循
环。PCR产物经 1.0%琼脂糖凝胶电泳, EB染色后利
用紫外凝胶成像系统采集图片。
1.5 转基因烟草下游基因的表达分析
以均一化的 cDNA 为模板, 利用胁迫相关基因
的特异引物进行 PCR 扩增, PCR 程序为: 94℃变性
45 s, 62℃退火 45 s, 72℃延伸 50 s, 24~26个循环。
扩增产物经 1.0%琼脂糖电泳, EB染色后利用紫外凝
胶成像系统采集图片。含有 GCC box 的 PR 基因
GLA(PR2)的特异引物 NPR2F为 5′-GAATGAAATCA
GCCCTGT-3′; NPR2R为 5′-CCAAACTCCACCAGA
GAC-3′; CHN50 (PR3)的特异引物 NPR3F: 5′-GCTG
GCTTAGAGAACAAG-3′; NPR3R: 5′-TGTCACCAG
GACTAACA-3′; osmotin(PR5)的特异引物 NPR5F为
5′-TGGTGGAGTCCTACAATG-3′; NPR5R为 5′-TGT
AGGATCATCTTGTGG-3′。DRE/CRT基因 NtERD10A
的特异引物 N10AF 为 5′-TGAGAAGAAGGGAATTA
T-3′; N10AR为 5′-TGTAAGACACTGCTTCCA-3′。
NtERD10C的特异引物 N10CF为 5′-CGGTCTTTGA
GTGATATCC-3′; N10CR 为 5′-AGAAGAAAGAGG
AGCACA-3′。
1.6 烟草盐胁迫处理方法
选取已鉴定有 W6 基因表达的 T0代转基因阳性
株系, 取 1 cm 左右的芽尖组织(每个株系做 10~20
个重复), 在 200 mmol L−1 NaCl的MS固体培养基上
光照培养(25 , 120 ℃ μmol m−2 s−1, 12 h光照, 8 h黑
暗)。50 d后测定各株系的平均根长、根重和地上部
分净增鲜重。测定鲜重后将样品烘至恒重测定其干
重, 并计算叶片的含水量。
1.7 叶绿素含量和 SOD活性测定
采用分光光度法测定叶绿素含量 [13], 每株取
0.2 g 叶片加少许碳酸钙和石英砂及少量 100%丙酮
迅速研磨, 用 80%的丙酮将其过滤并完全洗脱, 定
容至 25 mL。以 80%的丙酮作为空白对照在 663 nm
和 645 nm下测定吸光值并计算叶绿素 a和叶绿素 b
和总叶绿素含量。
采用氮蓝四唑(NBT)法测定 SOD 活性[17], 以抑
制 NBT光氧化还原 50%的酶量为 1个活力单位。取
0.5 g 叶片加磷酸缓冲液 (pH 7.8), 冰浴研磨提取
SOD酶液。2.95 mL磷酸缓冲液反应体系[NBT (75
μmol L−1)、Met (13 mmol L−1)、EDTA-Na (10 μmol
L−1), 核黄素(2.0 μmol L−1)]中加入 0.05 mL酶液, 于
80 μmol m−2 s−1 光强下反应 10 min, 温度控制在
25~30℃之间, 以黑布遮盖终止反应。用蒸馏水代替
提取的酶液, 分别做见光和避光对照。以避光对照
作为空白对照, 在 560 nm下测定吸光值并计算 SOD
总活性。
2 结果与分析
2.1 转 W6基因植株的获得和鉴定
W6 基因与载体 CaMV35S-pBI121 重组, 获得
CaMV35S-pBI121-W6基因表达载体(图 1-A)。酶切鉴
定确认后导入农杆菌菌株 C58C1 中, 利用农杆菌介
导法转入烟草新华 1号。经过 2~3周的分化培养, 烟
草的叶盘边缘开始出现抗性再生芽, 待再生苗长至
第 6期 鲁 燕等: W6基因的过表达提高转基因烟草的耐盐性 987


0.5~1.0 cm 时转入生根培养基中生根, 共获得再生
苗 63株。

图 1 W6基因的载体构建(A)与转化烟草的 PCR检测(B)
Fig. 1 Construction of vector (A) and PCR identification (B)
of W6 transgenic tobacco plants
A: 35S启动子构建的 W6基因表达载体图。B: 利用 nptII基因的
引物对转基因株系进行 PCR检测。M: DL2000 DNA marker; CK+:
35S::W6质粒对照; CK−: 受体新华 1号。
A: the construction map of 35S::W6 in a binary vector. B: PCR
amplification of the transgenic plants using a pair of primers of
nptII gene. Lanes 1−5: independent lines of T0 plants; M: DL2000
DNA marker; CK+: 35S::W6 plasmid; CK−: Xinhua 1.

用标记基因 nptII的特异引物对转基因烟草进行
PCR 检测, 共有 12 株扩增出预期大小(490 bp)的片
段, 非转基因对照没有扩增出该片段(部分结果见图
1-B), 初步证明 W6基因已成功地转入烟草。
挑选 5 个阳性 T0代转基因烟草, 利用 W6 的特
异引物进行 RT-PCR 分析。结果发现 W6 基因在转
基因烟草中都有一定量的表达。其中, 6-32、6-37和
6-41 的表达量较高, 6-31 和 6-47 的表达量较低; 而
对照中没有发现 W6基因的表达。表明 W6基因已整
合到转基因烟草基因组中并在转录水平上表达(图
2)。推测烟草内其他抗性基因的表达水平可能会由
于外源 W6基因的导入和过量表达引起改变。我们

图 2 转基因烟草中 W6基因的表达
Fig. 2 The expression of W6 gene in transgenic tobacco plants
CK−: 受体新华 1号; 1~5泳道为不同的转基因株系。
CK−: Xinhua 1; lane 1: 6–31; lane 2: 6–32; lane 3: 6–37; lane 4:
6–41; lane 4: 6–47.
利用无性繁殖获得这 5 个阳性植株的 T0代株系, 群
体都应含有W6基因, 且都有一定量的表达, 因此可
用这 5 个转基因株系材料进行进一步的基因表达分
析和功能验证。
2.2 W6 基因的过量表达诱导烟草下游抗性基因
表达
以非转基因烟草作为对照, 对正常生长下的转
基因烟草(6~37)的下游基因表达情况进行 PCR 检
测。结果表明 W6 基因的过量表达可以诱导含有
DRE/CRT 元件的 COR/RD 基因 NtERD10A 和
NtERD10C 在正常生长状态下大量表达(图 3), 而对
照中 W6基因无表达, NtERD10A和 NtERD10C在表
达量也很低。因此推测 W6 基因可能具有诱导非生
物胁迫相关的 COR/RD基因表达的能力。

图 3 RT-PCR分析 W6基因的过表达对下游基因的影响
Fig. 3 Effect of W6 gene on the downstream genes’ expressions
by RT-PCR analysis
1: 非转基因对照烟草; 2: 转基因烟草。
1: non-transgenic tobacco; 2: transgenic tobacco.

许多 PR 基因, 如 PR1、PR2、PR3 和 PR5, 其
启动子区具有 GCC box序列, 它们能够增强植物对
病原菌的抗性和对非生物胁迫的抗性[22-23]。在正常
生长情况下 W6基因过量表达的转基因烟草中 PR2、
PR3 和 PR5 基因的表达量明显高于无 W6 基因表达
的对照组。因此 W6 基因可能还参与调节含有 GCC
box 基因的表达。结合以上结果, W6 基因可能与植
物体内的生物胁迫和非生物胁迫响应都相关。
2.3 烟草在 200 mmol L−1 NaCl胁迫下的生长
取上述 5 个转基因株系的幼苗 (各株系选择
10~20个重复), 分别在正常 MS和含 200 mmol L−1
NaCl的 MS固体培养基上光照培养 50 d, 观察地上
和地下部分的生长情况。结果显示, 非转基因对照
新华 1 号和转基因烟草在正常 MS 培养基上的生长
状态基本相似, 转 W6 基因烟草的叶片颜色更为浓
绿(图 4-A, B)。在含有 NaCl的培养基上非转基因对
照几乎完全不能生长 , 叶片卷曲变形 , 严重失绿 ,
幼叶完全不能够正常伸展 , 根部基本褐化坏死(图
4-C)。在盐胁迫下转基因烟草的叶片面积虽然也有
988 作 物 学 报 第 34卷

一定程度的缩小 , 但是仍然能够较为正常的生长 ,
叶片也依然浓绿, 根部能够生成较为丰富的根系(图
4-D)。而转基因烟草各株系的根长、根重, 地上部分
的净增鲜重明显高于对照(图 5)。

图 4 转 W6基因烟草的耐盐性鉴定
Fig. 4 Salt tolerance identification of W6 transgenic tobacco
and Xinhua 1 under 200 mmol L−1 NaCl treatment
A: 非转基因对照在正常 MS培养基上生长 50 d; B: 转基因烟草
在正常 MS培养基上生长 50 d; C: 非转基因对照在含有 200
mmol L−1 NaCl MS培养基上生长 50 d; D: 转基因烟草在含有
200 mmol L−1 NaCl MS培养基上生长 50 d.
A: control growing on normal MS for 50 days; B: transgenic tobacco
plants growing on normal MS for 50 days; C: control growing on MS
with 200 mmol L−1 NaCl for 50 days; D: transgenic tobacco plants
growing on MS with 200 mmol L−1 NaCl for 50 days.

转基因烟草的根长在 1.40~3.93 cm范围内, 平均
2.09 cm; 根重在 2.41~7.79 g范围内, 平均 4.28 g; 而
对照平均根长 0.20 cm, 平均根重 0.06 g (图 5-A, 图
5-B)。地上部分的生长差异也很明显, 转基因烟草的
光合面积是对照的几十倍(图 4-C, D), 地上部分净增
鲜重最高的株系达 13.03 g, 最低的株系也达到 5.18 g;
而对照的光合面积很小, 相应的增重仅有 0.55 g(图
5-C)。表明 200 mmol L−1 NaCl胁迫条件下, 受体对照
的生长受到强烈抑制 , 而转基因烟草的耐盐性得

图 5 盐(200 mmol L−1 NaCl)胁迫对烟草地上部分和根部生长
的影响
Fig. 5 Effect of 200 mmol L−1 NaCl stress on the growth of
aboveground and belowground parts of tobacco
A: W6转基因烟草盐(200 mmol L−1 NaCl)处理 50 d的根长; B: W6
转基因烟草盐(200 mmol L−1 NaCl)处理 50 d的根重; C: W6转基
因烟草盐(200 mmol L−1 NaCl)处理 50 d的净增鲜重。
A: the root length of W6 transgenic tobacco under 200 mmol L−1
NaCl stress for 50 days; B: the root weight of W6 transgenic to-
bacco under 200 mmol L−1 NaCl stress for 50 days; C: the increased
fresh weight of W6 transgenic tobacco under 200 mmol L−1 NaCl
stress for 50 days.

到明显改善, 在高盐培养基上能够良好生长。
2.4 耐盐性相关生理指标
2.4.1 在盐胁迫下转基因烟草保持较高水平的叶绿
素含量 烟草幼苗在含 200 mmol L−1 NaCl的 MS
固体培养基上光照培养 50 d。对照烟草的叶片严重
失绿, 总叶绿素含量仅为 0.55 mg g−1 FW。转基因烟
草各株系的叶片颜色基本正常 , 总叶绿素含量在
5.18~13.03 mg g−1 FW范围内, 平均达 8.97 mg g−1
FW, 比对照高出十几倍(表 1)。
2.4.2 在盐胁迫下转基因烟草的 SOD 酶活性显著
提高 在含 200 mmol L−1 NaCl的MS固体培养基
上光照培养 50 d, 转基因烟草的 SOD 酶活性在
184.11~225.76 U g−1 FW 范围内 , 平均酶活性为
206.63 U g−1 FW; 对照烟草的 SOD酶活性为 119.91
U g−1 FW, 是转基因烟草酶活性的 1/2(表 1)。在长期
的盐胁迫处理下, 转基因烟草的 SOD活性明显高于
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表 1 盐胁迫对烟草叶绿素含量、SOD酶活性和含水量的影响
Table 1 Effect of NaCl stress on the chlorophyll content, SOD activity, and water content in the overground parts of tobacco plants
株系
Line
绝对含水量
Absolute water content (%)
叶绿素含量
Chlorophyll content (mg g−1)
SOD活性
SOD activity (U g−1 FW)
CK 0.911±0.021 abc 0.545±0.248 d 119.913±3.830 e
6-31 0.931±0.002 a 8.371±3.052 ab 225.758±3.694 a
6-32 0.936±0.005 a 13.031±2.352 a 208.671±15.205 bc
6-37 0.944±0.006 a 11.799±2.609 a 184.112±10.407 d
6-41 0.910±0.006 abc 6.471±4.259 bc 198.030±10.417 cd
6-47 0.929±0.002 ab 5.182±2.601 bc 216.559±2.611 bc

对照, 有利于保护细胞内的蛋白和膜系统免受氧化
胁迫的伤害, 增强烟草在高盐环境下的适应能力。
3 讨论
植物在高盐胁迫环境下会发生一系列的生理生
化变化。其伴随产生的氧化胁迫对细胞的伤害是影
响植物生长的重要原因之一[17]。正常生长条件下产
生的活性氧(ROS)能够被体内活性氧清除系统的各
种酶(SOD、POD、CAT等)及时清除, 不会对细胞造
成伤害。但盐、干旱或病害胁迫会诱导细胞内迅速
产生大量活性氧, 活性氧的累积可使细胞膜脂不饱
和脂肪酸过氧化, 破坏生物膜整体流动性、通透性
和完整性, 导致细胞膜透性增大、细胞液外渗, 甚至
导致细胞内膜系统的破坏及诱发细胞凋亡。SOD是
避免细胞免受氧化胁迫的关键酶, 其活性直接影响
到活性氧的生成和代谢[17-18]。同时, SOD 还能减少
活性氧对叶绿体的破坏, 提高植物的耐盐性[18]。转
W6 基因的烟草在长期盐胁迫下的 SOD 酶活性几乎
为对照的两倍, 更为有效地减弱氧化胁迫带来的伤
害。研究显示, 将酵母线粒体 Mn-SOD 基因转入水
稻中 , 在盐胁迫下转基因水稻的叶绿素含量和总
SOD活性均有所增加, 耐盐性显著提高[21]。Vannini
等[22]发现水稻 Osmyb4 基因的过量表达可明显增强
拟南芥对盐、干旱和病原菌的耐受能力, Osmyb4的
表达不但激活了下游 PR 基因的表达, 还提高了内
部清除活性氧的能力, 并认为保持较高的活性氧清
除酶活性有利于提高植物对各种生物及非生物胁迫
的耐受性。本研究将 W6基因转入烟草中, 提高了转
基因植株在盐胁迫下的 SOD活性和叶绿素含量, 及
根长、根重和净增鲜重, 表明转基因烟草植株的耐
盐性明显增强[7]。
综上所述, W6基因的导入提高了烟草的耐盐性,
令其在高盐胁迫下能够较好地生长。PR 基因
(pathogenesis-related)启动子区具有 GCC box 序列,
能够增强植物对病原菌的抗性和对非生物胁迫的抗
性[22-23]。DRE/CRT元件是与干旱和低温胁迫相关基
因所共有的启动子区域元件。包含该元件的基因一
般会在植物受到逆境胁迫时被大量诱导表达, 目前
的研究发现在正常条件下能够大量表达此类基因的
植株, 在逆境胁迫下往往具有较好的抗逆性。ERF
亚族中与 W6 相似能够同时诱导含有 GCC 元件和
DRE/CRT 元件的基因还有很多, 如 Park 等[23]发现
Tsi 基因可诱导 PR 基因 SAR8.2、PR1、PR2、PR3
和 PR4 的表达 , 提高转基因烟草的抗病性和耐盐
性。大麦的 HvRAF 基因不受 ABA 诱导, 但可同时
诱导包含 DRE/CRT元件的 KIN2、GSH1以及 PR基
因的表达, 其转基因拟南芥的耐盐性和抗病性也有
明显提高[24]。番茄 JERF1、JERF3 基因的过量表达
能提高 PR基因和COR/RD基因的转录, 并增强转基
因烟草的耐盐性[19,25]。PR基因和 COR/RD基因属于
不同的信号调控途径, 但都受 ERF 类转录因子调
控。对正常生长下的转 W6 基因烟草进行下游基因
的 RT-PCR分析, 发现W6基因的过量表达能强烈诱
导 PR 基 因 (PR2/PR3/PR5) 和 COR/RD 基 因
(NtERD10A / NtERD10C)的表达。因此推测, W6基因
可能通过交互作用将生物胁迫和非生物胁迫信号通
过相同的 W6 进行传导, 对下游抗性基因的表达作
出适当的调控。
4 结论
W6 基因的过表达诱导了抗逆相关 PR 基因和
COR/RD 基因的表达, 明显提高了转基因烟草的耐
盐性和在盐胁迫环境下的 SOD 酶活性和叶绿素含
量。耐盐性与 W6基因的表达呈一定的正相关, 表达
量较高的转基因烟草(6-32、6-37和 6-41)株系也正是
我们所要筛选获得的抗盐性较好的转基因株系。
References
[1] Wang W, Vinocur B, Altman A. Plant responses to drought,
salinity and extreme temperatures: towards genetic engineer-
990 作 物 学 报 第 34卷

ing for stress tolerance. Planta, 2003, 218: 1−14
[2] Jia G X, Zhu Z Q, Chang F Q, Li Y X. Transformation of to-
mato with the BADH gene from Atriplex improves salt toler-
ance. Plant Cell Rep, 2002, 21: 141−146
[3] Li Q L, Gao X R, Yu X H, Wang X Z, An L J. Molecular
cloning and characterization of betaine aldehyde dehydro-
genase gene from Suaeda liaotungensis and its use in im-
proved tolerance to salinity in transgenic tobacco. Biotechnol
Lett, 2003, 25: 1431−1436
[4] Sawahel W A, Hassan A H. Generation of transgenic wheat
plants producing high levels of the osmoprotectant proline.
Biotechnol Lett, 2004, 24: 712−725
[5] Prabhavathi V, Yadav J S, Kumar P A, Rajam M V. Abiotic
stress tolerance in transgenic eggplant (Solanum melongena
L.) by introduction of bacterial mannitol phosphodehydro-
genase gene. Mol Breed, 2002, 9: 137−147
[6] Swire-Clark G A, Marcotte Jr W R. The wheat LEA protein
Em functions as an osmoprotective molecule in Saccharomy-
ces cerevisiae. Plant Mol Biol, 1999, 39: 117−128
[7] Oraby H F, Ransom C B, Kravchenko A N, Sticklen M B.
Barley HVA1 gene confers salt tolerance in R3 transgenic oat.
Crop Sci, 2005, 45: 2218−2227
[8] Park B J, Liu Z, Kanno A, Kameya T. Increased tolerance to
salt-and water-deficit stress in transgenic lettuce (Lactuca sa-
tiva L.) by constitutive expression of LEA. Plant Growth
Regul, 2005, 45: 165−171
[9] Zhu J K. Salt and drought stress signal transduction in plants.
Ann Rev Plant Biol, 2002, 53: 247−273
[10] Chen W J, Zhu T. Networks of transcription factors with roles
in environmental stress response. Plant Sci, 2004, 9: 591−597
[11] Sakuma Y, Liu Q, Dubouzet J G, Abe H, Shinozaki K, Yama-
guchi-Shinozaki K. DNA-binding specificity of the ERF/AP2
domain of Arabidopsis DREBs, transcription factors involved
in dehydration- and cold-inducible gene expression. Biochem
Biophys Res Commun, 2002, 290: 998−1009
[12] Cao Y, Song F, Goodman R M, Zheng Z, Molecular charac-
terization of four rice genes encoding ethylene-responsive
transcriptional factors and their expressions in response to bio-
tic and abiotic stress. J Plant Physiol, 2006, 163: 1167−1178
[13] Tang M, Sun J, Liu Y, Chen F, Shen S. Isolation and func-
tional characterization of the JcERF gene, a putative
AP2/EREBP domain-containing transcription factor, in the
woody oil plant Jatropha curcas. Plant Mol Biol, 2007, 63:
419−428
[14] Lee H E, Shin D, Park S R, Han S E, Jeong M J, Kwon T R,
Lee S K, Park S C, Yi B Y, Kwon H B, Byun M O. Ethylene
responsive element binding protein 1 (StEREBP1) from So-
lanum tuberosum increases tolerance to abiotic stress in
transgenic potato plants. Biochem Biophys Res Commun, 2007,
353: 863−868
[15] Meloni D A, Oliva M A, Martinez C A, Cambraia J. Photo-
synthesis and activity of superoxide dismutase, peroxidase
and glutathione reductase in cotton under salt stress. Environ
Exp Bot, 2003, 49: 69−76
[16] Jimenez M S, Gonzalez-Rodriguez A M, Morales D, Cid M C,
Socorro A R, Caballero M. Evaluation of chlorophyll fluo-
rescence as a tool for salt stress detection in roses. Photosyn-
thetica, 1997, 33: 291−301
[17] Wang R, Chen S, Ma H, Liu L, Li H, Weng H, Hao Z, Yang S.
Genotypic differences in antioxidative stress and salt toler-
ance of three poplars under salt stress. Frontiers For China,
2006, 1: 82−88
[18] Sairam R K, Srivastava G C, Agarwal S, Meena R C.
Differences in antioxidant activity in response to salinity
stress in tolerant and susceptible wheat genotypes. Biol Plant,
2005, 49: 85−91
[19] Zhang H, Huang Z, Xie B, Chen Q, Tian X, Zhang X, Zhang
H, Lu X, Huang D, Huang R. The ethylene-, jasmonate-, ab-
scisic acid- and NaCl-responsive tomato transcription factor
JERF1 modulates expression of GCC box-containing genes
and salt tolerance in tobacco. Planta, 2004, 220: 262−270
[20] Lee J H, Hong J P, Oh S K, Lee S, Choi D, Kim W T. The
ethylene-responsive factor like protein 1 (CaERFLP1) of hot
pepper (Capsicum annuum L.) interacts in vitro with both
GCC and DRE/CRT sequences with different binding affini-
ties: possible biological roles of CaERFLP1 in response to
pathogen infection and high salinity conditions in transgenic
tobacco plants. Plant Mol Biol, 2004, 55: 61−81
[21] Tanaka Y, Hibino T, Hayashi Y, Tanaka A, Kishitani S, Takabe
T, Yokota S, Takabe T. Salt tolerance of transgenic rice over-
expressing yeast mitochondrial Mn-SOD in chloroplasts.
Plant Sci, 1999, 148: 131−138
[22] Vannini C, Iriti M, Bracale M, Locatelli F, Faoro F, Croce P,
Pirona R, Maro D A, Coraggio I, Genga A. The ectopic
expression of the rice Osmyb4 gene in Arabidopsis increases
tolerance to abiotic, environmental and biotic stresses.
Physiol Mol Plant Pathol, 2006, 69: 26−42
[23] Park J M, Park C J, Lee S B, Ham B K, Shin R, Paek K H.
Overexpression of the tobacco Tsi1 gene encoding an
EREBP/AP2-type transcription factor enhances resistance
against pathogen attack and osmotic stress in tobacco. Plant
Cell, 2001, 13: 1035−1046
[24] Jung J, Won S Y, Suh S C, Kim H R, Wing R, Jeong Y, Hwang
I, Kim M. The barley ERF-type transcription factor HvRAF
confers enhanced pathogen resistance and salt tolerance in
Arabidopsis. Planta, 2007, 225: 575−588
[25] Wang H, Huang Z, Chen Q, Zhang Z, Zhang H, Wu Y, Huang
D, Huang R. Ectopic overexpression of tomato JERF3 in to-
bacco activates downstream gene expression and enhances
salt tolerance. Plant Mol Biol, 2004, 55: 183−192