全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(7): 1179−1187 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

基金项目: 中国-荷兰国际合作项目; 中国农业科学院基本科研业务费支持项目
作者简介: 杜海(1981−), 男, 贵州贵阳人, 在读博士研究生, 研究方向: 作物遗传育种。E-mail: superduhai@126.com
*
通讯作者(Corresponding authors): 黄玉碧, E-mail: yubihuang@sohu.com; 唐益雄, E-mail: tangyx@mail.caas.net.cn; Tel: 010-62121506
Received(收稿日期): 2007-09-11; Accepted(接受日期): 2007-12-16.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.01179
大豆MYB转录因子基因 GmMYBJ6和 GmMYBJ7的克隆及表达分析
杜 海 1,2 杨文杰 2 刘 蕾 1,2 唐晓凤 1,2 吴燕民 2 黄玉碧 1,∗ 唐益雄 2,∗
(1 四川农业大学玉米研究所, 四川雅安 625014; 2 中国农业科学院生物技术研究所, 北京 100081)
摘 要: MYB 转录因子以保守的 DNA 结合域为共同特征, 是植物最大的转录因子家族之一, 广泛参与植物代谢调
控。本文根据植物中 MYB转录因子的 DNA保守结构域, 通过 RT-PCR和 RACE的方法从大豆品种吉林 3号的叶片
中分离得到了 2 个 MYB 基因 GmMYBJ6 和 GmMYBJ7, 并对其结构特征和表达特性进行了分析鉴定。基因组 DNA
序列分析表明, 两个基因都含有两个内含子; 酵母系统检测表明, 两个基因均具有转录激活活性; β-半乳糖甘酶活性
分析表明, 内含子的存在使两个基因的转录激活活性明显降低; 实时荧光定量 PCR检测结果显示, GmMYBJ6在大豆
中的表达受 ABA、GA3和 NAA的诱导, 而 GmMYBJ7的表达则受 ABA和 NAA的诱导; 半定量 RT-PCR分析表明, 两
个基因在大豆的根、茎、叶、花和未成熟种子中均有表达。GmMYBJ6 和 GmMYBJ7 为典型的 R2R3-MYB 转录因子
新基因; 他们在大豆中的表达可能与 ABA和 NAA的信号转导途径有关。
关键词: MYB转录因子; 基因表达调控; 内含子; 转录激活活性
Cloning and Functional Identification of the Two MYB Transcription
Factors GmMYBJ6 and GmMYBJ7 in Soybean
DU Hai1,2, YANG Wen-Jie2, LIU Lei1,2, TANG Xiao-Feng1,2, WU Yan-Min2, HUANG Yu-Bi1,*, and
TANG Yi-Xiong2,*
(1 Maize Research Institute, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, Sichuan; 2.Biotechnologe Research Institute, Chinese Academy of Agri-
cultural Sciences, Beijing 100081, China)
Abstract: Plant R2R3-myb genes are widely distributed in higher plants and comprise one of the largest known families of regu-
latory proteins. In the past decades, its biochemical and molecular characteristics were extensively studied and reported to be in-
volved in many physiological and biochemical processes. On the based of its conserved DNA-binding domain, two MYB-like
genes from soybean cultivar Jilin 3 were cloned by RT-PCR and RACE methods, named GmMYBJ6 and GmMYBJ7 (GenBank
accession No. DQ902863 and DQ902864), which contained an ORF of 786 bp and 969 bp encoding 261 and 322 amino acids
respectively. Genomic DNA sequences analysis showed that both the two genes contained two introns. Meanwhile, the transcrip-
tion level of the two genes was investigated by semi-quantitative RT-PCR, and the result showed that the two genes were ex-
pressed in root, stems, leaves, flowers and immature seeds of soybean. Furthermore, the yeast one-hybrid assay showed that the
two MYB proteins had transcriptional activation functions. But the levels of their transcriptional activity were lower when the
introns existed. Fluorescence real-time quantification PCR analysis indicated that the expression of GmMYBJ6 and GmMYBJ7
genes could be induced by ABA and NAA, respectively. And their expressions were changed with the inducible time. In conclu-
sion, GmMYBJ6 and GmMYBJ7 genes isolated from soybean are new members of MYB transcription factor family, which may
play key roles in the signal transduction related to ABA and NAA in soybean.
Keywords: MYB transcription factor; Gene expression and regulation; Intron; Transcriptional activity
转录因子也称反式作用因子, 是能够与靶基因
启动子中的顺式作用元件发生特异性相互作用的
DNA 结合蛋白, 可通过他们之间以及与其他相关蛋
白之间的相互作用激活或抑制基因的转录。典型的
转录因子一般具有 4 个功能区, DNA 结合区、转录
调控区、核定位信号区和寡聚化位点。通常根据保
1180 作 物 学 报 第 34卷

守性较强的 DNA 结合域 , 例如螺旋 -转角 -螺旋
(helix-turn-helix)、锌指(zinc finger)结构、亮氨酸拉
链(leucine zipper)和 MADS 盒等结构对转录因子进
行分类。
最早的 MYB 转录因子(v-MYB)是从鸟类的原
癌病毒 AMV中发现的[1]。在植物中, Paz-Ares等首
先从玉米中克隆出与色素合成有关的 ZmMYBC1 基
因[2], 随后在拟南芥、玉米等真核生物中发现存在着
大量的 MYB 转录因子[3-4]。植物中 MYB 类转录因
子以含有 MYB结构域(DNA-binding domain)为共同
特征, 是一段包含 51~52 个氨基酸残基的肽段。在
MYB蛋白中含有 1~3个串联的、不完全重复的MYB
结构域(R1、R2和 R3), 每个 MYB结构域折叠成螺
旋－转角一螺旋(HTH)的形式参与和 DNA大沟的结
合[5-6]。每个 MYB 区域中一般都含有 3 个保守的色
氨酸残基(其间隔 18或 19个氨基酸)起疏水核心的作
用, 对维持 HTH 的构型有着特别重要的意义。在
MYB 的 DNA 结合区的羧基端有一个富含酸性氨基
酸的转录激活区(transcription activation domain)一
般折叠成双亲性的螺旋发挥作用, 其作用有一定的
可塑性。研究发现, MYB转录因子广泛参与植物次
生代谢调控、激素和环境因子的应答[7-11], 并对细胞
分化、器官的形成、植物叶片的形态建成及抗病具
有重要的调节作用[12-17]。因此, MYB被认为是植物
体内数量最多、功能最多样化的转录因子之一。近
年来, MYB类转录因子被证实广泛参与植物苯丙烷
代谢途径。类黄酮化合物是植物苯丙烷类次生代谢
途径的一个重要分支产物。在自然界中主要分布于
豆科蝶形花亚科的豆科作物(如大豆、红三叶等)中。
具有多种多样的生物学功能, 如调节植物生长、保
护植物免受紫外线的损伤、作为植物组织红色、蓝
色以及紫色花青素等色素以及作为植物抗毒素
(phytoalexin)和活性氧清除剂等。同时, 该类化合物
也是药用植物的主要活性成分之一。相关药理和临
床实验证实, 黄酮类化合物具有广泛的生理和药理
活性, 如类黄酮可软化血管、抗 HIV 病毒活性、抗
癌、抗氧化、抗炎、抗衰老和治疗冠心病等[18-21]。
鉴于该类化合物广泛的生物活性和药理功能, 被认
为是一类具有广泛开发前景的天然物质。
虽然对植物 MYB 类转录因子家族的研究已取
得了一些进展 , 但对该类基因功能的研究报道很
少。本试验分离克隆出两个 MYB新基因 GmMYBJ6
和 GmMYBJ7, 并对他们的结构特征和表达特性进
行分析鉴定。以期为进一步研究其在植物抗逆及次
生代谢调控, 特别是类黄酮生物合成中的作用奠定
基础。
1 材料与方法
1.1 材料、菌株、载体及试剂
供试大豆品种吉林 3 号由中国农业科学院作物
科学研究所及北京国家大豆改良分中心孙君明博士
共同提供。自然光照下, 温室培养 2 周后开始取幼
苗叶片, 液氮冻存备用。大肠杆菌菌株 DH5α为本实
验室保存; SuperScript III Reverse Transcriptase 及
Gene Racer kit购自 Invitrogen公司; 实验所用限制
性内切酶及 pMD18-T 载体购自 TaKaRa 公司 ;
Matchmaker Three-Hybrid System购自 Clontech公司;
RNA提取试剂 TRNzol购自北京天根科技有限公司;
RNAase-free 的 DNA酶购自 Promega公司; 实时荧
光定量 PCR试剂盒 SYBR Green I购自 Q IAGEN公
司; 其他常规试剂均为国产分析纯。
1.2 MYB基因全长序列的克隆
根据植物中已报道的 MYB 转录因子 DNA 结
合域保守区的氨基酸序列及碱基序列 , 设计与保
守区两端相应的一对简并引物 S 和 AS(表 1); 采用
TRNzol法提取大豆幼苗叶片总 RNA进行 RT-PCR。
PCR程序为 94℃变性 5 min; 94℃变性 45 s, 60℃退
火 45 s, 72℃延伸 30 s, 30个循环; 72℃延伸 10 min。
对扩增产物按分子克隆手册中的方法进行克隆和测
序。根据获得的中间片段设计基因特异引物(表 1)。
提取大豆叶片总 RNA, 以引物 QT 作反转录获得的
cDNA 为模板 , 分别用 3JL6-GSP1、3JL6-GSP2、
3JL7-GSP1和 3JL7-GSP2与 3′通用引物 Q1和 Q2进
行 3′cDNA 末端扩增, 引物序列如表 1 所示。PCR
程序为 94℃变性 5 min; 94℃变性 45 s, 60℃退火 45 s,
72℃延伸 1 min, 30个循环; 72℃延伸 10 min。利用
5′特异引物 5JL6-GSP1、5JL6-GSP2和 5JL7-GSP1、
5JL7-GSP2与 GeneRacer 5′ Primers和 GeneRacer 5′
Nested Primers进行 5′ cDNA末端扩增, 引物序列如
表 1所示。具体操作参照 Invitrigen公司的GeneRacer
试剂盒说明书。PCR程序为 94℃变性 5 min; 94℃变
性 45 s, 60℃退火 45 s, 72℃延伸 1 min, 30个循环;
72℃延伸 10 min。回收扩增产物 , 并克隆到
pMD18-T载体对扩增产物进行克隆和测序。根据已
得到的 5′序列设计基因全长特异引物 JL6-F1、
JL6-F2、JL7-F1和 JL7-F2和 3′通用引物 Q1、Q2, 巢
式 PCR获得 GmMYBJ6和 GmMYBJ7的 cDNA全长
序列。引物序列如表 1所示。
第 7期 杜 海等: 大豆 MYB转录因子基因 GmMYBJ6和 GmMYBJ7的克隆及表达分析 1181


表 1 克隆 MYB基因中所用引物序列
Table 1 Primers used in isolating MYB genes
引物名称
Primer
引物序列
Primer sequence (5′–3′)
引物名称
Primer
引物序列
Primer sequence (5′–3′)
S G(G/A)TG(T/C)GG(A/G/C)AA(G/A)AGCTG(C/T)AGACT(A/C)(A/C)G 5JL7-GSP1 TGGACCACCTGCTTCCAATGCTAG
AS T(T/C)TCATTG(T/G)C(A/T)GTTC(T/G)TCC(T/A)GG(T/C/A)A(A/G) 5JL7-GSP2 TTTTATCTTCTGCATCAGAGAATTGA
QT GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T) JL6-F1 CCAGGTAGGCCATGGGAAGGG
3JL6-GSP1 TAGCATTGGAAGCAGGTGGTC JL6-F2 CATGGGAAGGGCTCCATGTTGT
3JL6-GSP2 TGGTCCATAATAGCATCTCAGCTTC JL7-F1 TTCTATTGATGCCCCGCTCCA
3JL7-GSP1 AATTGCAGCCAAACTACCTGGAC JL7-F2 CCACGTTCCATTCTTCAGTATCCT
3JL7-GSP2 AGCCAAACTACCTGGACGAACTG Q1 GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG
5JL6-GSP1 TGCTGAAAGTGACATTGTTGTTGCT Q2 CGCTACGTAACGGCATGACAGTG
5JL6-GSP2 GTTGTTGCTTGTCGTGGCAGCA

1.3 基因组序列分析
分别在克隆基因的推测读码框上游及下游设计
引物 , 以幼苗叶片基因组 DNA 为模板 , 使用
KOD-Plus 进行 PCR 扩增。PCR 产物回收后克隆到
pMD18-T载体上, 分析其基因组序列。
1.4 组织中的表达特性分析
分别提取吉林 3 号的根、茎、叶、花及未成熟
种子的总 RNA, 经 DNase I 处理去除痕量的基因组
DNA, 以反转录获得的 cDNA 为模板; 以大豆泛素
蛋白基因 Subi-1(D16248)为内参(NAct-F: 5′-GCTG
TTTTTCCTAGTATTGTTGGTC-3′和 NAct-R: 5-AAT
ACCTGTTGTACGGCCACTG-3 )。预实验确定
RT-PCR 指数扩增循环数。根据 GmMYBJ6 和
G m M Y B L 7 的 3 ′非翻译区设计基因特异引物
JL6-RT(F): 5′-CAAGCAACAACAATGTCACTTTC
AG-3′, JL6-RT(R): 5′-CATCAAGCACAAACTCAAG
CAAAT-3′和 JL7-RT(F): 5′-TACTCCAAAGGAAGC
CTCAACA-3′和 JL7-RT(R): 5′-GCCTGTCCACCCA
CTAACACTAC-3′进行 RT-PCR 扩增。PCR 程序为
94℃变性 5 min; 94℃变性 30 s, 57℃退火 30 s, 72℃
延伸 45 s, 28个循环; 72℃延伸 10 min。检测它们在根、
茎、叶、花和未成熟种子中的表达情况。
1.5 实时荧光定量 PCR 技术分析目的基因在激
素诱导下的表达
近年来研究表明, MYB类转录因子广泛参与激
素应答[22-25]。据此, 我们选取 4 种对植物生长起重
要作用的激素对大豆材料进行处理 , 分析
GmMYBL6 和 GmMYBL7 受激素诱导表达的情况。4
种激素及相应浓度分别为, 100 mol L−1 ABA、100
mol L−1 GA3、75 mol L−1 NAA和 75 mol L−1 BA; 分
别于 0、4、12 和 24 h 取样。用 TRNzol 法提取总
RNA, 并经 Dnase I 处理去除痕量的基因组 DNA,
反转录得到第一链 cDNA。以大豆泛素蛋白基因
Subi-1(D16248)为内标基因, JL6-RT(F)、JL6-RT(R)
及 JL7-RT(F) 和 JL7-RT(R) 为 特 异 引 物 , 对
GmMYBL6 和 GmMYBL7 两个基因进行荧光定量
PCR 扩增, 检测两个基因在大豆中受激素诱导时的
表达情况。引物设计时尽可能使两条引物跨越一个
或多个内含子, 以避免基因组 DNA的污染。实时荧
光定量 PCR的程序为 95℃变性 15 min; 94℃变性 30
s, 56℃退火 30 s, 72℃延伸 30 s, 80℃获取荧光信号 15
s, 45个循环。所用仪器为 ABI Prism 7000型 PCR仪。
采用相对定量法, 将目的基因和内标基因分别
亚克隆到中间载体 pMD18-T上, 经酶切和测序鉴定
正确后, 以质粒为模板经蒸馏水按 105、104、103、
102 和 10倍稀释, 得到一系列的浓度制得标准曲线,
每点设 3次重复(结果未显示)。按双标准曲线法分析
数据。
1.6 酵母单杂交方法分析转录激活活性
1.6.1 酵母单杂交质粒载体的构建 酵母单杂交
所用酵母菌株为本实验室保存的含有双报告基因
(lacZ和 HIS3)的 AH109菌株。分别在克隆基因的推
测读码框上游及下游设计引物, 并在两端加上 EcoR
I和 Sal I酶切位点将目的 cDNA序列亚克隆到酵母
表达载体 pBridge 上, 构建融合表达载体 pBridge-
GmMYBJ6 和 pBridge-GmMYBJ7; 同样将两个基因
的基因组序列亚克隆到 pBridge 上, 构建 pBridge-
GN-GmMYBJ6 和 pBridge-GN-GmMYBL7 两个融
合表达载体, 以验证内含子对目的基因转录激活活
性的影响。所有效应质粒均经酶切、PCR鉴定正确,
测序验证目的基因与 BD融合表达的读码框亦完全
正确。
1.6.2 转录激活活性的验证 将构建的效应质
粒、阴性对照(空质粒 pBridge)及阳性对照 pGAL4
1182 作 物 学 报 第 34卷

分别转化酵母菌株AH109中。分别均匀涂于 SD/-Trp
及 SD/-Trp/-HIS 营养缺陷固体培养基上, 30℃倒置
培养 2~3 d, 观察转化子的生长情况。挑取直径为
1~2 mm在双缺陷型培养基上生长的单菌落, 接种于
3~5 mL SD/-Trp/-HIS 液体培养基中 , 30 200℃ r
min−1, 振荡培养过夜。按 Matchmaker酵母系统操作
流程进行 Whatman 滤纸显色检测。进一步采用 β-
半乳糖甘酶活性检测法对转录激活活性进行定量分
析, 取 2 mL过夜培养菌液转接到 8 mL液体 YPD培
养 基 中 , 30℃ 继 续 培 养 至 细 胞 对 数 生 长 期
(OD600=0.5~0.8)后收集菌液 , 用冻融法裂解细胞 ,
以 ONPG (O-Nitrophenyl-β-D-Galactopyranoside)为
底物, 分光光度计法检测 β-半乳糖甘酶活性。实验
经 3次重复。
2 结果与分析
2.1 MYB 基因全长序列的克隆、序列分析及进
化分析
通过 RT-PCR和 RACE法从吉林 3号幼苗叶片
中分离得到两个MYB基因 GmMYBJ6和 GmMYBJ7
(GenBank登录号分别为DQ902863和 DQ902864)。
其中 GmMYBJ6 序列全长 993 bp, 开放阅读框 786
bp, 编码 261 个氨基酸, 分子量为 29.08 kD, 等电
点为 5.97。GmMYBJ7序列全长 1 371 bp, 开放阅读
框 969 bp, 编码 322个氨基酸, 分子量为 35.64 kD,
等电点为 6.60。生物信息学分析表明, 这两个基因
的编码区均含两个 MYB 结构域, 分别由 52 和 49
个氨基酸组成(图1); 该结构域与其他植物中已克隆到
的 MYB 转录因子的保守结构域具有很高的同源性
(图 2); 在它们的 R2、R3结构域中含有保守的色氨
酸残基 W。除了具有典型的 R2R3-MYB 保守结构
域外 , 在它们的 C-端还存在一个富含酸性氨基酸
的 转 录 激 活 区 , 推 测 这 两 个 基 因 为 典 型 的
R2R3-MYB 转录因子基因(图 1 和图 2)。根据推测
的氨基酸序列, 利用 DNAMAN 对两个基因与其他
植物 MYB 转录因子进行同源性分析显示, 两个基
因与大豆中的 GmMYB78 和 GmMYB71 及拟南芥中
的 AtMYB68 的同源性相对较高。其中 GmMYBJ6
的氨基酸序列与大豆的 GmMYB71 一致性为 29.95%,
MYB保守区一致性达 81.51%; 与拟南芥 AtMYB68的
氨基酸一致性为 33.69%, MYB 保守区一致性达
80.67%。GmMYBJ7的氨基酸序列与大豆的 GmMYB78

图 1 GmMYBJ6(A)和 GmMYBJ7(B)核苷酸序列及推测的氨基酸序列
Fig. 1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of GmMYBJ6 (A) and GmMYBJ7 (B)
阴影部分为 R2R3MYB转录因子保守的 DNA结合域; 黑体字为结合域中的保守的色氨酸(W)残基; 虚线部分示可能的转录激活区。
The shaded regions are the conserved R2R3 DNA-binding domain of MYB protein. The bold letters show the conserved tryptophan residues in the MYB domain.
The dashed region is the putative transcriptional activation domain.
第 7期 杜 海等: 大豆 MYB转录因子基因 GmMYBJ6和 GmMYBJ7的克隆及表达分析 1183




图 2 GmMYBJ6 和 GmMYBL7与其他 MYB蛋白的 MYB结合域的氨基酸序列的比对
Fig. 2 MYB domain alignments of GmMYBJ6 and GmMYBL7 with other MYB protein
拟南芥的 AtMYB12和 AtMYB68在 GenBank的登录号分别为 Z95740和 Z95791; 玉米的 ZmMYBc1、ZmMYBpL和 ZmMYBp 在
GenBank的登录号分别为M37153、L19494和 Z11879; 大豆 GmMYB78和 GmMYB71在 GenBank的登录号为 ABH02914和 ABH02912;
黑色区代表氨基酸具有 100％的同源性, 阴影区代表部分同源。星号代表 DNA结合域中保守的色氨酸残基, 下划线代表推测的螺旋-
转角-螺旋基序, 箭头处为内含子的插入位点: (其中 1,2为 GmMYBJ6的内含子的插入位点; 3,4为 GmMYBJ7的内含子的插入位点)。
The above proteins include AtMYB12 (Z95740) and AtMYB68 (Z95791) in Arabidopsis; ZmMYBc1 (M37153), ZmMYBpL (L19494) and
ZmMYBp (Z11879) in maize; GmMYB78 (ABH02914) and GmMYB71(ABH02912) in soybean. The black background represent perfectly
conserved acid resides, the partially conserved residues are shaded in different colors. The helix-turn-helix motif is underlined. Regularly
spaced tryptophan residuces are indicated by stars. Arrows indicate the localization of introns(1 and 2 are the insertion sites of the introns of
the GmMYBJ6; 3 and 4 are the insertion sites of the introns of the GmMYBJ7).

一致性较高 , 达到 61.03%, MYB 保守区一致性
达 97.41%(图 2)。系统进化树分析表明, 两个基因与
GmMYB78 和 GmMYB71 及拟南芥中的 AtMYB68 的
关系最近(图 3)。因 AtMYB68在拟南芥中为第 14亚
类, 由此推测这 2 个基因可能与该亚类的基因有相
似的功能。
2.2 基因组序列分析
根据测序结果对目的基因的 cDNA 序列和基因
组进行比对显示, GmMYBJ6和 GmMYBJ7两个基因
均含有两个内含子。其中 GmMYBJ6 在 137~731位
和 862~974位各有一个 595 bp和 112 bp的内含子;
而 GmMYBJ7 在 141~287位和 418~723位分别含有
一个 147 bp和 305 bp的内含子。内含子的插入位置
都在目的基因的结合域中(图 2), 它们的作用有待我
们作进一步的突变研究。
2.3 基因的组织表达特性分析
通过 RT-PCR 分析了两个基因在大豆不同组织
的表达, 结果在根、茎、叶、花及未成熟种子中均
检测到 GmMYBJ6和 GmMYBJ7的表达(图 4)。据此
推测它们可能为组成型表达。
2.4 实时荧光定量 PCR 检测目的基因在激素诱
导下的表达
内标基因和目的基因的标准曲线的扩增效率分
别为 93.51%、93.06%和 92.22%, R2值分别为 0.996、
1184 作 物 学 报 第 34卷


图 3 GmMYBJ6 和GmMYBJ7与其他MYB蛋白的系统发生分析
Fig. 3 Phylogentic relationship of GmMYBJ6, GmMYBJ7, and
some other MYB proteins

图 4 RT-PCR分析GmMYBJ6和GmMYBJ7在大豆组织中的表达
Fig. 4 Expression detection of GmMYBJ6 and GmMYBJ7 in
soybean by RT-PCR
A: GmMYBJ6的RT-PCR结果; B: GmMYBJ7的RT-PCR结果; C: 内标
基因UBQ (D16248); D: rRNA; R: 根; S: 茎; L: 叶; F: 花; IS: 未成熟
种子。
A: RT-PCR for GmMYBJ6; B: RT-PCR for GmMYBJ7; C: UBQ
(D16248); D: rRNA; R: root; S: stems; L: leave; F: flowers; IS: imma-
ture seeds.

0.999和 0.988。根据实时荧光定量 PCR所得到的数
据计算得到两个基因经 ABA、GA3、NAA 和 BA 4
种激素诱导后的相对表达量(图 5-A, B)。从中可以看
出, GmMYBJ6受 ABA、NAA和 GA3诱导, 但不受 BA
诱导。GmMYBJ7的表达也受 ABA和 NAA的诱导。
说明这两个基因可能参与植物对这两种激素的应答。
2.5 转录激活功能的检测
将 pBridge-GmMYBJ6、pBridge-GN-GmMYBJ6、
pBridge-GmMYBJ7、pBridge-GN-GmMYBJ7、空质
粒 pBridge 及阳性对照 pGAL4 分别转入酵母菌株
AH109 中。所有含相应质粒的酵母菌落均能在单缺

图 5 4种激素诱导下 GmMYBJ6和 GmMYBJ 基因的实时荧光
定量 PCR
Fig. 5 Real-time PCR analysis of the expression patterns of
GmMYBJ6 and GmMYBJ7 induced by 4 different phytohormones
A, B分别为 GmMYBJ6和 GmMYBJ7受 ABA、GA3、NAA和 BA
4种激素诱导下的表达情况。
A, B are the comparative quantitative expression of GmMYBJ6 and
GmMYBJ7 genes induced by ABA, GA3, NAA, and BA, respectively.

培养基 SD(-Trp)上生长, 说明所有质粒全部成功转
化入酵母菌株中。除阴性对照 pBridge不能够在缺少
Trp 和 His 的 SD 双缺陷培养基上生长外, 其他效应
质粒均能正常生长; 证明效应质粒都已表达, 并激
活下游报告基因 his3 的表达, 使酵母细胞在-His 缺
失培养基上能正常生长。Whatman 滤纸显色反应表
明 GmMYBJ6、GmMYBJ7 和阳性对照 pGAL4 均能
显现明显的蓝色, 说明他们都具有转录激活活性;而
pBridge-GmMYBJ6、pBridge-GmMYBJ7及阴性对照
均未显明显的蓝色(图 6-B, D)。β-半乳糖甘酶活性检测结
果显示, 效应质粒 pBridge-GN-GmMYBJ6 和 pBridge-
GN-GmMYBJ7有激活活性, 但活性很低(图 7)。
3 讨论
MYB转录因子广泛参与植物次生代谢调控、激
素和环境胁迫的应答, 是一类调节植物体内产生各
种生理代谢反应的关键因子。不同的 MYB 转录因
子在基因的结构、表达特性及功能方面存在明显的
差异。目前, 大多数 MYB转录因子的功能尚不清楚,
因此, 克隆 MYB 基因, 明确其功能, 对于阐明这类
转录因子在转录水平对植物生理代谢调控及逆境胁
迫的应答机制具有重要的意义。
本研究利用 RT-PCR 和 RACE 的方法从大豆中
分离得到了两个新的 MYB 基因 GmMYBJ6 和
GmMYBJ7。结构分析表明 , 两个基因均具有植物
第 7期 杜 海等: 大豆 MYB转录因子基因 GmMYBJ6和 GmMYBJ7的克隆及表达分析 1185



图 6 GmMYBJ6 和 GmMYBJ7蛋白在酵母单杂交系统中的转录激活活性的分析
Fig. 6 Assay of transcriptional activation ability of the GmMYBJ6 and GmMYBJ7 protein by yeast expression system
A和 B分别为 GmMYBJ6所有酵母转化子在 SD/-Trp/-His双缺陷培养基上的生长情况及含相应效应质粒的显色结果; 其中, 1: 含
GmMYBJ6的转化子; 2: 阳性对照 GAL4; 3: 含内含子的转化子; 4: 阴性对照空质粒; C和 D分别为 GmMYBJ7所有酵母转化子在
SD/-Trp/-His双缺陷培养基上的生长情况及含相应效应质粒的显色结果; 其中, 1: 含 GmMYBJ7转化子; 2: 阳性对照 GAL4; 3: 含内含
子的转化子; 4: 阴性对照空质粒。
A and B are the yeast containing the pBridge-GmMYBJ6, pBridge-GN-GmMYBJ6, GAL4 (active control) and empty vector (CK) grows on
the plate of SD/-Trp/-His and the result of yeast one-hybrid of the corresponding effect plasmids; C and D are the yeast containing the
pBridge-GmMYBJ7, pBridge-GN-GmMYBJ7, GAL4(active control) and empty vector(CK) grows on the plate of SD/-Trp/-His and the result
of yeast one-hybrid system of the corresponding effect plasmids.


图 7 GmMYBJ6和 GmMYBJ7蛋白在酵母中的 β-半乳糖苷酶
活性分析
Fig. 7 Assay of the β-Galactosidase activity of GmMYBJ6
and GmMYBJ7 proteins in yeast expression system

R2R3-MYB 转录因子典型的特征, 如在两个基因的
N端分别含有由 52和 49个氨基酸组成的两个MYB
结构域, 且该结构域含有典型的 R2R3-MYB 转录因
子所特有的保守的色氨酸残基 W。此外, 在其 C 端
还存在一个富含酸性氨基酸的转录激活区。系统进
化树分析显示, 它们与拟南芥的 AtMYB68、大豆的
GmMYB71 和 GmMYB78 同源性最高。在拟南芥中,
根据内含子的插入位点的不同, MYB蛋白被分为A、
B、C 3大类。A类 MYB蛋白约占拟南芥蛋白质的
10%, 在其 BRH(the region between the conserved
DNA-recognition helix)中没有内含子; B类相对较小,
MYB蛋白约占拟南芥蛋白的 5%, 在其 BRH的 3号
位含有一个内含子; C 类最大, 主要参与苯丙烷类
代谢途径, MYB 蛋白占拟南芥蛋白的 85%, 在其
BRH 的 2 号位含有一个内含子(图 2)[26]。经基因组序
列分析表明, 两个基因都含有两个内含子, 按内含
子的插入位点, 它们均属于 C类 MYB转录因子。据
此推测它们可能与该类基因有相似的功能, 参与苯
丙烷类代谢途径的调控。目前我们已构建植物表达
载体转化烟草, 研究其在类黄酮生物合成中的作用
(结果未显示)。组织特异性分析表明, GmMYBJ6 和
GmMYBJ7在大豆的根、茎、叶、花和未成熟种子中
均能表达, 推测他们为组成型表达的 MYB 转录因
子基因。同时, GmMYBJ7在不同组织的表达量还存
在明显的差异 , 如其在茎和花中的表达量相对
要低。
植物体内存在一套适应环境胁迫的信号接受、
转导和应答机制, 使植物能对逆境信号作出快速反
应 , 以适应外界环境的变化 , 减少逆境造成的伤
害。在植物应答逆境的过程中, 植物激素对植物的
生长发育和逆境信号具有重要的调控作用。近年来,
有研究发现植物 MYB 转录因子广泛参与植物对激
素的应答。因此, 为进一步研究目的基因在代谢调
控中的作用, 本实验对目的基因受激素诱导的表达
模式进行了分析。实时 PCR 检测结果显示 ,
GmMYBJ6的表达受 ABA、GA3及 NAA的诱导; 受
ABA 及 NAA 诱导时, 其表达在 12 h 时达到峰值,
表达量分别相当于 0 h对照的 2.12倍及 7.12倍, 而
在 4 h和 24 h的表达量明显低于 0 h对照; 受 GA3
诱导时, 4 h和 12 h表达量很低, 24 h时表达量明显
1186 作 物 学 报 第 34卷

高于对照; 说明 GmMYBJ6 可以通过依赖于这 3 种
激素的信号转导途径对逆境胁迫进行应答反应 ;
GmMYBJ7 受 ABA 和 NAA 的诱导表达, 其中受
ABA 诱导时在 12 h表达量最高, 24 h时表达量略
有下降, 但仍明显高于对照, 分别是对照的 2.38和
2.32倍; 而受 NAA 诱导时, 4 h和 24 h处基因表达
量明显较低, 12 h时最高。说明 GmMYBJ7可能与
这两种激素的信号传导有关。
酵母单杂交实验结果显示 , GmMYBJ6 和
GmMYBJ7均可以和MYB结合元件结合, 激活下游
报告基因 HIS3的表达, 表明这两个基因和其他植物
中已克隆的 MYB 类基因具有相似的激活功能。结
合基因组序列分析的结果, 本文首次采用酵母单杂
交系统验证内含子对目的基因的转录激活活性的影
响。结果表明, 含有内含子的酵母效应质粒能在缺
少 Trp和 His的 SD双缺陷培养基上正常生长, 但相
对于目的基因菌株生长缓慢约两天。Whatman 滤纸
显色反应结果显示, 含有内含子的效应质粒均未能
显现明显的蓝色。进一步采用 β-半乳糖苷酶活性检
测法进行定量分析表明, 含内含子的效应质粒具有
转录活性, 但相对于目的基因其活性明显降低。这
可能是因为内含子在酵母这种低等的真核生物中的
剪切速度较慢, 使其蛋白与 MYB 结合元件的结合
能力受到影响, 甚至不能正确剪切所至; 也可能是
因为内含子对目的基因的转录激活活性具有抑制作
用, 其结果有待进一步研究验证。
4 结论
从大豆品种吉林 3 号中分离得到了两个 MYB
新基因 GmMYBJ6和 GmMYBJ7。它们均为典型的植
物 R2R3-MYB 转录因子, 均含两个内含子, 均为组
成型转录因子。它们都具有转录激活性, 但内含子
的存在对目的基因的转录激活活性可能有抑制作
用。它们的表达均受 ABA 和 NAA 的诱导, 参与植
物对这两种激素的应答。
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