全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(6): 958−964 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

基金项目: 国家自然科学基金项目(30471104); 国家重点基础研究发展计划(973 计划)项目(2002CB111303); 教育部新世纪优秀人才项目
(NCET-04-0500); 教育部 111引智计划(B08025)
作者简介: 佘义斌(1981−), 男, 江苏人, 硕士, 从事作物遗传育种研究; 朱一超(1980−), 男, 江苏人, 在读博士, 从事棉花遗传学研究。** 同
等贡献。
*
通讯作者(Corresponding author): 郭旺珍。E-mail: moelab@njau.edu.cn
Received(收稿日期): 2007-08-15; Accepted(接受日期): 2008-01-15.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.00958
棉花腺苷高半胱氨酸水解酶 cDNA的克隆、表达及染色体定位
佘义斌** 朱一超** 张天真 郭旺珍*
(南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室, 江苏南京 210095)
摘 要: 腺苷高半胱氨酸水解酶是调节细胞内甲基反应的一个关键酶。通过对高品质纤维陆地棉品系 7235的棉纤维
混合 cDNA文库随机测序, 得到一个棉花腺苷高半胱氨酸水解酶(编号: g073a03a,GhSAHH)的 cDNA序列。该 cDNA
序列长 1 598 bp, 利用 5′RACE技术得到上游 318 bp的片段,序列拼接获得全长为 1 916 bp的 cDNA序列, ORF为 1 458
bp, 编码 485个氨基酸, 其理论上的等电点 pI＝5.69, 分子量 MW＝53.2 kD。该基因在不同组织、器官中均表达, 在
根、下胚轴和纤维发育早期优势表达。根据 Southern杂交结果推测 GhSAHH基因在陆地棉基因组中为单拷贝。利用
本实验室陆地棉遗传标准系 TM-1和海岛棉海 7124培育的含 140个单株的 BC1作图群体, 将 GhSAHH基因定位在第
20号染色体上。
关键词: 棉花; 腺苷高半胱氨酸水解酶; 克隆; 表达; 定位
Cloning, Expression, and Mapping of S-adenosyl-L-homocysteine
Hydrolase (GhSAHH) cDNA in Cotton
SHE Yi-Bin**, ZHU Yi-Chao**, ZHANG Tian-Zhen, and GUO Wang-Zhen*
(State Key Laboratory of Crop Genetics & Germplasm Enhancement, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, Jiangsu, China)
Abstract: S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase (SAHH) is a key enzyme in the regulation of intracellular methylation reactions.
Though the SAHH function has already been elucidated in various living creature bodies, it is still not explicit in growth and de-
velopment of cotton fiber. Therefore, research of SAHH may provide effectively basis to clarify the mechanism of cotton growth
and development. In this paper, we obtained a full length cDNA fragment of SAHH in cotton and further finished its expression,
mapping and Southern blotting analyses. A cDNA clone encoding S-adenosyl-homocysteine hydrolase (Library No. g073a03a,
GhSAHH) was isolated from cotton fiber cDNA library of 7235 germplasm line with elite fiber quality in Gossypium hirsutum L.
The length of this cDNA clone was 1 598 bp. Further, a 318 bp-long-upstream fragment was obtained via 5′RACE technique. The
full length of the cDNA clone was 1 916 bp with its open reading frame encoded 485 amino acids. The putative protein of this
gene had an isoelectric point of 5.69 and a calculated molecular weight of 53.2 kD. Judging from its expression characters,
GhSAHH is expressed in cotton cells, especially in root, hypocotyl and at early stage of fiber developmental period. Southern
blotting analyses showed there was only one copy of GhSAHH in the genome of upland cotton. Using the BC1 mapping popula-
tion with 140 individuals derived from the hybridization between the upland cotton standard line TM-1 and the sea-island cotton
cultivar Hai7124, and TM-1 as recurrent parent, GhSAHH was localized on the chromosome 20. We have already constructed
plant express vector and RNAi vector of GhSAHH, the transgenic research on cotton is undertaking.
Keywords: Gossypium hirsutum L.; Adenosyl-homocysteine hydrolase; Cloning; Expression; Localization
S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶(SAHH)是生物体
内广泛存在的, 调节细胞内甲基反应的一个关键酶,
能可逆性地催化 S-腺苷-L-高半胱氨酸(SAH)分解为
腺苷(Ado)、高半胱氨酸(Hcy)[1]。这一生化反应的生
物学意义在于将 S-腺苷甲硫氨酸(SAM, 体内甲基
供体)转甲基作用后产生的 SAH 代谢掉[2-3]。
第 6期 佘义斌等: 棉花腺苷高半胱氨酸水解酶 cDNA的克隆、表达及染色体定位 959


目前所知,在真核生物中 SAHH 催化 AdoHcy
水解生成腺苷(Ado)和高半胱氨酸(Hcy)是 AdoHcy
代谢的唯一途径[4]。在动物细胞中, 基因的表达、细
胞的分化、胚的发育都与 DNA甲基化有关。在高等
植物细胞中, 尽管对细胞分化发育过程中的DNA甲
基化了解的不多, 但有实验认为基因的表达可能与
DNA的甲基化有关。植物基因甲基化是以 S-腺苷甲
硫氨酸为甲基供体, 催化产物之一是 SAH, SAH 以
产物抑制的方式, 阻遏 S-腺苷甲硫氨酸甲基转移酶
的活性, 使基因的甲基化程度降低, 从而调控基因
的表达。SAHH在生物体内主要功能是催化 SAH水
解, 使 SAH甲基转移能够顺利进行, 所以 SAHH在
基因表达调控中起到了类似开关的作用。
SAHH 基因在自然界各生物体中普遍存在, 但
在棉花中还没有报道 , 在棉花中的功能也不清楚 ,
有待进一步研究证明。对该基因的深入研究将为阐
明棉花的生长和发育机制提供有力依据。本文从陆
地棉(Gossypium hirsutum L.)优质品系 7235 不同时
期棉纤维的混合 cDNA 文库随机测序的序列信息库
中 , 通过序列功能预测筛选获得一个棉花 SAHH
cDNA 片段, 利用 5′RACE 技术克隆出其全长序列,
并进一步通过 PCR 方法扩增全长 ORF 序列和测序
分析验证其序列的正确性。同时也对该 cDNA 序列
进行了表达特征分析和染色体定位研究。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 高品质纤维陆地棉品系 7235,
陆地棉遗传标准系 TM-1 和海岛棉海 7124 及其以
TM-1 为轮回亲本, 含 140 个单株的 BC1群体, 种植
于南京农业大学网室。
1.1.2 试剂 限制性内切酶为NEB产品, 小量胶
回收试剂盒(Gel Extraction Mini Kit)为上海华舜生
物工程有限公司产品; Southern杂交采用 Roche公司
的 DIG High Prime DNA Labeling and Detection
Starter Kit I, 硝酸纤维素膜也为 Roche公司产品, 选
用 QIAGEN公司 QIAquick® Nucleotide Removal Kit
纯化探针; PCR反应中所用 Taq酶和 5′RACE所用试
剂均购自 TaKaRa公司。
1.2 方法
1.2.1 cDNA 全长序列克隆及序列分析 通过构
建陆地棉优质材料 7235开花后 5、8、11、14、17、
20、23和 25 d不同纤维发育时期的混合 cDNA文库,
随机挑取 6 000 余个克隆进行 5′端测序分析, 获
1 056个非冗余单克隆, 并对其功能初步预测。根据
功能分类, 选取与激素酶类相关的 cDNA 克隆, 完
成插入片段的测序。参照 GIBCO BRL公司 5′RACE
System for Rapid Amplification of cDNA Ends, ver-
sion 2.0 说明书进行操作, 利用 5′RACE 技术[5]获得
全长 cDNA 序列, 所用 RACE 引物分别为 GSP1:
5′-TTCCTCAGAAACACCAACTAAT-3′; GSP2: 5′-T
TTCTCATAAACCTCCTCGGCT-3′; GSP3: 5′-TCAC
CTTTCCAGGCGAACACGG-3′。全长 ORF 扩增的
PCR引物为 F: 5′-CCAAGGGTGAGTGTGATCTG-3′;
R: 5′-CCATCACCTTATTCAAACCC-3′。利用 DNAStar
软件完成 ORF预测, 在 GenBank数据库进行核酸的
BLAST比对, 采用 SignalP程序进行信号肽预测, 采
用 NetNGlyc1.0和 NetPhos2.0程序分析序列位点[6]。
构建 cDNA文库的克隆载体为 pBluescript II SK(+)。
由上海英骏生物技术公司完成目标克隆测序。
1.2.2 总 RNA提取 采收萌发 10 d后棉花 TM-1
幼苗的根、下胚轴、植株嫩叶; −3、0 DPA(day post
anthesis)的胚珠和纤维混合物, 3、6、9、12、15、18、
21 DPA 的纤维, 采用本实验室发展的 CTAB-酸酚
法[7] 提取各部分的纤维细胞总 RNA。
1.2.3 RT-PCR分析 取 1 μg经 DNase I消化后的
总 RNA, 利用 RevertAidTM First Strand cDNA Syn-
thesis Kit(MBI)进行 cDNA 第一链合成, 然后取 0.5
μL 反转录产物进行 RT-PCR, 用于扩增的特异引物
分别为 F: 5′-GAGAGGAGGTCGTGAGTACAAGGT
C-3′和 R: 5′-ACAACAGCGACCTTACCAGCAATC-3′,
扩增程序为 95℃预变性 5 min; 94℃变性 45 s, 51℃
退火 45 s, 72℃延伸 1 min, 30个循环; 72℃延伸 10
min。同时为了校正 PCR模板的相对浓度, 用组成性
表达的EF1α一对特异引物, 作为内标进行平行 PCR
扩增。EF1α的特异引物为 F: 5′-AGACCACCAAGT
ACTACTGCAC-3′和 R: 5′-CCACCAATCTTGTACA
CATCC-3′。
1.2.4 与其他植物 SAHH蛋白的同源性比较 根
据 BLAST 结果从 GenBank 中挑取 8 个其他物种中
的 SAHH 基因编码的氨基酸序列, 与 GhSAHH 进行
同源性比较和聚类分析, 揭示其间的同源关系及进
化特征, 采用 DNAMAN的 Alignment程序完成进化
树分析。
1.2.5 Southern杂交分析 提取了棉花 7235材料
的基因组 DNA[8], 选用 Sac I、EcoR I、BamH I、
Hind III和 Xba I这 5种限制性内切酶于 37℃酶切
960 作 物 学 报 第 34卷

16 h。将酶切好的基因组 DNA(20 μg)加于 0.8%的
琼脂糖凝胶(不加 EB)上 , 20 V 左右电泳过夜。经
变性和中和后用高盐(20×SSC)法转移到尼龙膜上 ,
尼龙膜在 80℃干燥 2 h。参照 Roche 公司的 DIG
High Prime DNA Labeling and Detection Starter
KitI 的说明书进行地高辛标记探针、杂交、洗膜和
放射自显影。
1.2.6 染色体定位分析 利用陆地棉遗传标准系
TM-1 和海岛棉海 7124 培育的含 140 个单株的 BC1
作图群体, 建立包括 1 790位点的遗传连锁图谱[9]。
根据 GhSAHH基因在 TM-1和海 7124间的多态性及
在 BC1作图群体中的分离情况, 在 LOD>6的条件下
采用 JoinMap软件[10] 将该基因整合到上述图谱。用
MapDraw[11]绘制染色体连锁图。
2 结果与分析
2.1 cDNA全长序列获得及序列分析
对从优质陆地棉品系 7235棉纤维混合 cDNA文
库中获得的 1 056个 uni-EST序列进行功能预测, 挑
选并获得一个腺苷高半胱氨酸水解酶的克隆。对其
插入片段全序列测序并进行序列分析 , 发现该
cDNA序列长 1 598 bp, 但 5′端不完整。进一步利用
5′ RACE技术扩增出大小为 500 bp的片段(图 1), 经
序列拼接得到上游 318 bp 的片段,拼接获得的全长
为 1 916 bp cDNA序列, ORF为 1 458 bp, 编码 485
个氨基酸(图 2)。为了验证该 ORF序列的正确性, 在
其两侧设计 PCR 引物, 扩增全长 ORF, 测序结果表
明该序列与拼接序列完全相同。因此, 将其命名为
GhSAHH。BLASTx结果显示, 该基因编码蛋白的氨
基酸序列与已报道的来自长春花 (Catharanthus
roseus)的 S-腺苷高半胱氨酸水解酶氨基酸序列相似
性很高, 达 95%, 其理论上的等电点 pI 为 5.69, 分
子量为 53.2 kD。

图 1 5′RACE扩增结果
Fig. 1 Electrophoretic pattern of amplified product of
5′RACE
1为 GSP2与锚定引物扩增的结果; M为 DNA分子量 marker。
Lane 1 shows the amplified result of anchor primer and GSP2; M
represents DNA molecular marker.

图 2 GhSAHH cDNA的核苷酸及编码氨基酸序列
Fig.2 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of the full-length GhSAHH cDNA
上游同框终止密码子用方框表示, * 表示终止密码子的位置。
An upstream in-frame stop codon is boxed. * indicates the positions of termination codons.
第 6期 佘义斌等: 棉花腺苷高半胱氨酸水解酶 cDNA的克隆、表达及染色体定位 961


以 SignalP 程序对由 GhSAHH 所推导的氨基酸
序列进行 N端信号肽结构的预测, 未发现有信号肽
序列。TMHMM 预测发现该蛋白没有跨膜结构。
NetNGlyc1.0预测发现共有 3个 N-糖基化(N-glyco-
sylation)位点, 分别位于氨基酸残基第 210、230、458
处。NetPhos2.0预测发现, 共 21个磷酸化位点, 含 9
个丝氨酸磷酸化位点, 6 个苏氨酸结合位点, 6 个酪
氨酸结合位点。说明该蛋白翻译后修饰的主要方式
之一是磷酸化。
2.2 GhSAHH基因的表达分析
为研究 GhSAHH 在棉花中表达的时空特点, 我们
以组成性表达的 EF1α为内参基因, 对根、下胚轴、叶
和不同时期棉纤维组织来源的 RNA 进行半定量
RT-PCR分析。结果表明 GhSAHH在陆地棉 TM-1的各
部分组织、器官中都有表达, 在根、下胚轴中优势表达,
随着纤维伸长的发育进程, 表达量逐渐减弱(图 3)。
2.3 GhSAHH 与其他植物 SAHH 蛋白的同源性
比较
根据 BLAST比对结果, 从 GenBank中挑取了 8
个来源于其他物种, 与 GhSAHH 相似性高的 SAHH
氨基酸序列(表 1)。多序列相似性比较表明, 他们在氨
基酸序列上有很高的相似性(图 4)。运用 DNAMAN软
件分析了 GhSAHH 与上述 8 类氨基酸序列的相似
性。聚类分析结果表明(图 5), GhSAHH与长春花 SAHH
编码的氨基酸位于同一分支上, 推测二者有相似的遗
传基础。
2.4 GhSAHH的 Southern杂交分析
利用 GhSAHH cDNA ORF 序列标记探针, 与
Sac I、EcoR I、BamH I、Hind III和 Xba I等 5种限
制性内切酶酶切的基因组 DNA 进行 Southern 杂交,
获得的杂交带型分别为 1、1、1、1、2条(图 6)。检
测探针 cDNA 序列, 没有发现上述 5 种供试验的限
制性内切酶酶切位点。因此根据杂交带型结果可以
得出 GhSAHH基因在棉花基因组中可能为一个拷贝,
属于单拷贝基因。在 Sac I的酶切泳道有 2条带, 推
测在该基因的内含子区含有一个 Sac I的酶切位点。
泳道上少许弱带的产生原因可能是探针与此基因家族
其他同源性较高的基因杂交出现的非特异性条带。
2.5 GhSAHH的染色体定位
用GhSAHH基因的 RT-PCR特异引物扩增 BC1作
图群体的亲本 TM-1、海 7124和 F1, 获得的 PCR产物
直接进行聚丙烯酰胺凝胶电泳, 发现目标扩增产物在
双亲中有差异, 进一步利用 BC1作图群体获得的多态
性分离信息与我室的骨架标记相整合, 利用 JoinMap
软件将GhSAHH基因定位在第 20染色体上, 位于SSR
标记 BNL2570(2.1 cM)和 NAU3070(0.7 cM)之间[9]。


图 3 GhSAHH的 RT-PCR分析
Fig. 3 The expression profiles of GhSAHH
1～12: 从左至右依次为根、下胚轴、叶、–3、0、3、6、9、12、15、18和 21 d棉纤维, M: 分子量 marker。
Lane M represents DNA marker; lane 1 to lane 12 show root, hypocotyl, leaf, fibers of –3, 0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, and 21 DPA of TM-1, respectively.

表 1 其他植物 SAHH蛋白氨基酸序列信息
Table 1 Amino acid sequences information of SAHH homologies in plants
来源
Origin
功能
Function
GenBank登录号
GenBank accession No.
长春花 Catharanthus roseus 腺苷高半胱氨酸水解酶 S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase CAA81527
拟南芥 Arabidopsis thaliana 腺苷高半胱氨酸酶 Adenosylhomocysteinase NP_193130
水稻 Oryza sativa 小麦类腺苷高半胱氨酸酶蛋白 Wheat adenosylhomocysteinase-like protein AAO72664
烟草 Nicotiana tabacum 腺苷高半胱氨酸水解酶 S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase AAV31755
红三叶 Trifolium pratense 腺苷高半胱氨酸酶 Putative adenosylhomocysteinase BAE71233
紫花苜蓿 Medicago sativa 腺苷高半胱氨酸酶 Adenosylhomocysteinase AAB41814
黄羽扇豆 Lupinus luteus 腺苷高半胱氨酸水解酶 S-adenosyl-L-homocysteinase AAD56048
蒺藜苜蓿 Medicago truncatula 腺苷高半胱氨酸酶 Adenosylhomocysteinase AAO89237

962 作 物 学 报 第 34卷


NP_193130 :
AAD56048 :
GhSAHH :
CAA81527 :
AAV31755 :
AAO72664 :
AAB41814 :
BAE71233 :
AAO89237 :

* 20 * 40 * 60 *
MALLVEKTSSGREYKVKDMSQADFGRLELELAEVEMPGLMACRTEFGPSQPFKGARITGSLHMTIQTAVLIETL
MALLVEKTTSGREYKVKDMSQADFGRLEIELAEVEMPGLMASRSEFGPSQPFKGAKITGSLHMTIQTAVLIETL
MALSVEKTAAGREYKVKDMSQADFGRLEIELAEVEMPGLMACRAEFGPAQPFKGAKITGSLHMTIQTAVLIETL
MALLVEKTSSGREYKVKDMSQADFGRLEIELAEVEMPGLMSCRAEFGPSQPFKGAKITGSLHMTIQTAVLIETL
------KTTSGREYKVKDMSQADFGRLEIELAEVEMPGLMACRTEFGPSQPFKGAKITGSLHMTIQTAVLIETL
MALSVEKTSSGREYKVKDLSQADFGRLEIELAEVEMPGLMACRAEFGPSQPFKGARISGSLHMTIQTAVLIETL
MALLVETTTSGREYKVKDMSQADFGRLEIELAEVEMPGLMSCRTEFGPSQPFKGARITGSLHMTIQTAVLIETL
MSLTVEKTTAGREYKVKDLSQADFGRLEIELAEIEMPGLISCRTEFGPSQPFKGARITGSLHMTIQTAVLIETL
MSLTVEKTQAGREYKVRDLSQADFGRLEIELAEIEMPGLMSCRTEFGPSQPFKGARITGSLHMTIQTAVLIETL
m l vekT GREYKV4D6SQADFGRLE6ELAE6EMPGL6 cR EFGPsQPFKGA4I3GSLHMTIQTAVLIETL

: 74
: 74
: 74
: 74
: 68
: 74
: 74
: 74
: 74



NP_193130 :
AAD56048 :
GhSAHH :
CAA81527 :
AAV31755 :
AAO72664 :
AAB41814 :
BAE71233 :
AAO89237 :


80 * 100 * 120 * 140
TALGAEVRWCSCNIFSTQDHAAAAIARDSAAVFAWKGETLQEYWWCTERALDWGPGGGPDLIVDDGGDATLLIH
TALGAEVRWCSCNIFSTQDHAAAAIARDSAAVFAWKGETLQEYWWCTERALDWGPGGGPDLIVDDGGDTTLLIH
TALGAEVRWCSCNIFSTQDHAAAAIARDSAAVFAWKGETLQEYWWCTERALDWGPTGGPDLIVDDGGDATLLIH
TALGAEVRWCSCNIFSTQEHAAAAIARDSAAVFAWKGETLQEYWWCTERALDWGPDGGPDLIVDDGGDATLLIH
TALGAEVRWCSCNIFSTQDHAAAAIARDSAAVFAWKGETLQEYWWCTERALDWGPGGGPDLIVDDGGDATLLIH
TALGAEVRWCSCNIFSTQDHAAAAIARDSAAVFAWKGETLEEYWWCTERCLDWGVGGGPDLIVDDGGDATLLIH
TALGAEVRWCSCNIFSTQDHAAAAIARDSAAVFAWKGETLQEYWWCSERALDWGPGGGPDLIVDDGGDVTLLIH
TALGAEVRWCSCNIFSTQDHAAAAIARDSAAVFAWKGETLQEYWWCTERALDWGPGGGPDLIVDDGGDATLLIH
TALGAEVRWCSCNIFSTQDHAAAAIARDSAAVFAWKGETLQEYWWCTERALDWGPGGGPDLIVDDGGDATLLIH
TALGAEVRWCSCNIFSTQdHAAAAIARDSAAVFAWKGETL2EYWWC3ERaLDWGpgGGPDLIVDDGGDaTLLIH


: 148
: 148
: 148
: 148
: 142
: 148
: 148
: 148
: 148



NP_193130 :
AAD56048 :
GhSAHH :
CAA81527 :
AAV31755 :
AAO72664 :
AAB41814 :
BAE71233 :
AAO89237 :


* 160 * 180 * 200 * 220
EGVKAEEIFEKTGQVPDPTSTDNPEFQIVLSIIKEGLQVDPKKYHKMKERLVGVSEETTTGVKRLYQMQQNGTL
EGVKAEEIYEKSGQFPDPDSTDNAEFKIVLSIIKEGLKTDPKRYHKMKDRVVGVSEETTTGVKRLYQMQANGTL
EGVKAEEVYEKTGQLPDPSSTDNAEFQIVLTIIRDGLKADPKKYTRMKERLVGVSEETTTGVKRLYQMQANGTL
EGVKAEEEYKKNGALPDPSSTDNAEFQIVLTIIRDGLKSDPTKYTRMKERLVGVSEETTTGVKRLYQMQANGTL
EGVKAEEEYAKSGKLPDPSSTDNVEFQLVLTIIRDGLKTDPLKYTKMKERLVGVSEETTTGVKRLYQMQANGTL
EGVKAEEEFEKSGKVPDPESTDNAEFKIVLTIIRDGLKSDPSKYRKMKERLVGVSEETTTGVKRLYQMQETGAL
EGVKAEEVFEKTGQLPDPSSTDNAEMQIVLTIIRDGLKTDPKRYQKMKTRIVGVSEETTTGVKRLYQMQASGTL
EGVKAEELYEKTGEVPDPSSTDNVEFQLVLTIIRDGLKTDPQRYRKMKERLVGVSEETTTGVKRLYQMQANGTL
EGVKAEELYEKTGEVPDPSSTDNAEFQLVLTIIRDGLKTDPKRYRKMKDRLVGVSEETTTGVKRLYQMQASGTL
EGVKAEE 5eK G PDP STDN Efq6VL3II4dGLk DP 4Y 4MK R6VGVSEETTTGVKRLYQMQa GtL


: 222
: 222
: 222
: 222
: 216
: 222
: 222
: 222
: 222



NP_193130 :
AAD56048 :
GhSAHH :
CAA81527 :
AAV31755 :
AAO72664 :
AAB41814 :
BAE71233 :
AAO89237 :


* 240 * 260 * 280 *
LFPAINVNDSVTKSKFDNLYGCRHSLPDGLMRATDVMIAGKVAVICGYGDVGKGCAAAMKTAGARVIVTEIDPI
LFPAINVNDSVTKSKFDNLYGCRHSLPDGLMRATDVMIAGKVAVVAGYGDVGKGCAAALKQAGARVIVTEIDPI
LFPAINVNDSVTKSKFDNLYGCRHSLPDGLMRATDVMIAGKVAVVCGYGDVGKGCAAALKQAGARVIVTEIDPI
LFPAINVNDSVTKSKFDNLYGCRHSLPDGLMRATDVMIAGKVAVVAGYGDVGKGCAAALKQAGARVIVTEIDPI
LFPAINVNDSVTKSKFDNLYGCRHSLPDGLMRATDVMIAGKVALVAGYGDVGKGCAAALKQAGARVIVTEIDPI
LFPAINVNDSVTKSKFDNLYGCRHSLPDGLMRATDVMIAGKVAVVCGYGDVGKGCAAALKQAGARVIVTEIDPI
LFPAINVNDSVTKSKFDNLYGCRHSLPDGLMRATDVMIAGKVAVVCGYGDVGKGCAAALKQGGARVIVTEIDPI
LFPAINVNDSVTKSKFDNLYGCRHSLPDGLMRATDVMIAGKVGVVCGYGDVGKGCAVALKQAGARVIVTEIDPI
LFPAINVNDSVTKSKFDNLYGCRHSLPDGLMRATDVMIAGKVGVVAGYGDVGKGCAVALKQAGARVIVTEIDPI
LFPAINVNDSVTKSKFDNLYGCRHSLPDGLMRATDVMIAGKVa66 GYGDVGKGCAaA6KqaGARVIVTEIDPI


: 296
: 296
: 296
: 296
: 290
: 296
: 296
: 296
: 296



NP_193130 :
AAD56048 :
GhSAHH :
CAA81527 :
AAV31755 :
AAO72664 :
AAB41814 :
BAE71233 :
AAO89237 :


300 * 320 * 340 * 360 *
CALQALMEGLQVLTLEDVVSEADIFVTTTGNKDIIMVDHMRKMKNNAIVCNIGHFDNEIDMLGLETYPGVKRIT
CALQATMEGLQVLTLEDVVSEADIFVTTTGNKDIIMLDHMKKMKNNAIVCNIGHFDNEIDMLGLETHPGVKRIT
CALQALMEGLQVLTLEDVVSEADIFVTTTGNKDIIMVNHMRKMKNNAIVCNIGHFDNEIDMLGLENYPGVKRIT
CALQATMEGLQVLTLEDVVSEADIFVTTTGNKDIIMVDHMRKMKNNAIVCNIGHFDNEIDMLGLETYPGVKRIT
CALQATMEGLQVLTLEDVVSDVDIFVTTTGNKDIIMVDHMRKMKNNAIVCNIGHFDNEIDMLGLETFPGVKRIT
CALQALMEGLQVLTLEDVVSEADIFVTTTGNKDIIMVDHMRKMKNNAIVCNIGHFDNEIDMLGLETYPGVKRIT
CALQALMEGLQVLTLEDVISEADIFVTTTGNKDIIMVSDMKKMKNNAIVCNIGHFDNEIDMHGLETYPGVKRIT
CALQALMEGFQVLTLEDVVSYADIFVTTTGNKDIIMVDDMKKMKNNAIVCNIGHFDNEIDMSGLENYPGVKRIT
CALQALMEGFQVLTLDDVVSYADIFVTTTGNKDIIMVDDMRKMKNNAIVCNIGHFDNEIDMSGLENYPGVKRVT
CALQA MEGlQVLTLeDV6S aDIFVTTTGNKDIIM6 M4KMKNNAIVCNIGHFDNEIDM GLE PGVKR6T


: 370
: 370
: 370
: 370
: 364
: 370
: 370
: 370
: 370



NP_193130 :
AAD56048 :
GhSAHH :
CAA81527 :
AAV31755 :
AAO72664 :
AAB41814 :
BAE71233 :
AAO89237 :


380 * 400 * 420 * 440
IKPQTDRWVFPETKAGIIVLAEGRLMNLGCATGHPSFVMSCSFTNQVIAQLELWNEKASGKYEKKVYVLPKHLD
IKPQTDRWVFPETNTGIIILAEGRLMNLGCATGHPSFVMSCSFTNQVIAQLELWNEKSSGKYEKKVYVLPKHLD
IKPQTDRWVFPETNTGIIVLAEGRLMNLGCATGHPSFVMSCSFTNQVIAQLELWKEKATGKYEKKVYVLPKHLD
IKPQTDRWVFPDTNSGIIVLAEGRLMNLGCATGHPSFVMSCSFTNQVIAQLELWNERKTGKYEKKVYVLPKHLD
IKPQTDRWVFPDTNSGIIVLAEGRLMNLGCATGHPSFVMSCSFTNQVIAQLELWKEKSTGKYEKKVYVLPKHLD
IKPQTDRWVFPETNTGIIVLAEGRLMNLGCATGHPSFVMSCSFTNQVIAQLELWKEKSTGKYEKKVYVLPKHLD
IKPQTDRWVFPETKSGIIVLAEGRLMNLGCATGHPSFVMSCSFTNQVIAQIELWKEKTSGKYEKKVYVLPKHLD
IKPQTDRWLFPETNTGIIVLAEGRLMNLGCATGHPSFVMSCSFTNQVIAQLELWNERKSGKYEKKVYVLPKHLD
IKPQTDRWVFPETNTGIIVLAEGRLMNLGCATGHPSFVMSCSFTNQVIAQLELWNERKSGKYEKKVYVLPKHLD
IKPQTDRW6FPeTn GII6LAEGRLMNLGCATGHPSFVMSCSFTNQVIAQ6ELW E4 3GKYEKKVYVLPKHLD


: 444
: 444
: 444
: 444
: 438
: 444
: 444
: 444
: 444



NP_193130 :
AAD56048 :
GhSAHH :
CAA81527 :
AAV31755 :
AAO72664 :
AAB41814 :
BAE71233 :
AAO89237 :


* 460 * 480
EKVALLHLGKLGARLTKLSKDQSDYVSIPIEGPYKPPHYRY
EKVAALHLEKLGAKLTKLSKDQADYISVPVEGPYKPFHYRY
EKVAALHLGKLGANLTKLTKDQADYISVPIEGPYKPPHYRY
EKVAALHLGKLGAKLTKLTKDQADYISVPIEGPYKPAHYRY
EKVAALHLGKLGARLTKLSKDQADYISVPVDGPYKPPHYRY
EKVAALHLGKLGARLTKLSKSQADYISVPVEGPYKPAHYRY
EKVAALHLGQLGAKLTKLSKDQADYISVPVEGPYKPAHYRY
EKVAALHLGKLGAKLTKLSQSQADYISVPVEGPYKPAHYRY
EKVAALHLGKLGAKLTKLSQSQADYISVPVEGPYKPAHYRY
EKVAaLHLgkLGA LTKL3k QaDY6S6P6eGPYKP HYRY


: 485
: 485
: 485
: 485
: 479
: 485
: 485
: 485
: 485

图 4 来源于不同物种的腺苷高半胱氨酸酶的相似性比较
Fig. 4 Sequence alignment of the adenosylhomocysteinase genes from different species
阴影部分表示相同的氨基酸残基, 各基因详细信息见表 1。
Identical residues are shaded. The information of these genes is presented in Table 1.
第 6期 佘义斌等: 棉花腺苷高半胱氨酸水解酶 cDNA的克隆、表达及染色体定位 963



图 5 来源于不同物种的腺苷高半胱氨酸酶的聚类分析
Fig. 5 Phylogenetic analysis of adenosylhomocysteinase genes
from different species
各基因详细信息见表 1。
The information of these genes is presented in Table 1.

图 6 GhSAHH基因的 Southern杂交分析
Fig.6 Southern blotting analysis of GhSAHH
箭头示杂交特征带。Arrows show specific bands.

3 讨论
Masuta 等[12]研究植物抗病毒反应时, 在烟草中
反义表达 SAHH 基因, 发现烟草的抗病毒能力增加,
认为: 病毒进入植物体内复制时需要 5′末端帽子结
构的甲基化, 反义表达 SAHH 后, 植物 SAH 相应增
多, SAM 减少, 基因的甲基化必然减少, 所以植物
具有抗病毒特性。第二种可能是植物反义表达 SAHH
基因后, 植物体内的游离细胞分裂素含量增多, 细
胞分裂素可诱导植物的抗性防御。
近年来, SAHH 已成为引人注目的药物设计靶
标, 其抑制剂显示出抗病毒、抗癌、抗寄生虫、抗
关节炎等多种药理作用[13]。大多数动植物病毒在复
制过程中其 mRNA 5′末端均需要一个“甲基帽”
(methyl cap) 结构,因此通过抑制 AdoHcy水解酶,就
可以反馈性抑制与形成“甲基帽”结构有关的病毒
编码的转甲基酶,从而抑制病毒的复制。AdoHcy 水
解酶抑制剂具广谱抗病毒活性,如干扰( − ) RNA 病
毒(Ebola、Marburg、麻疹、甲和乙型流感、狂犬病
等病毒)、( + ) RNA病毒(reo和 rota病毒)以及某些
DNA病毒(疱疹和巨细胞病毒)。SAHH在生物体内,
既可通过影响细胞分裂素的含量来调节基因的表达,
又可通过影响 DNA 甲基化的水平来调控基因的表
达, 对生物的生长发育进行调控。还在生物体抗病
毒性、抗逆性等抗性防御中起重要作用。
尽管如此, 其在棉花生长和棉纤维发育中的作
用还不明确。李春红[14]通过 cDNA 微阵列技术分离
到一个 SAHH 基因, 该基因在棉纤维细胞中高表达,
推测其可能通过调节 SAH/SAM 的比例来影响基因
的甲基化, 控制基因表达, 或通过调节细胞分裂素
的含量来影响植物的发育。本研究克隆到的 SAHH
基因在开花后一天的纤维细胞中也表达量较高 ,
DNA 序列分析表明我们新克隆到的 GhSAHH 基因
与李春红报道的 SAHH 基因 ORF 区的同源性达
90.2%, 这 2 个基因作用机理是否有共性, 我们正通
过农杆菌介导的转基因研究进一步验证。
目前我们已构建了 GhSAHH基因的植物过量表
达载体和干扰载体, 得到转基因棉花后, 将通过测
定各个生理变化时期与 SAHH 有密切关系的物质含
量来确定 SAHH 的功能。如检测细胞分裂素含量,
DNA 甲基化的程度 , SAH/SAM 的比例 , NAD+/
NADH [15]的含量等。GhSAHH在棉花生长和发育过
程中的机制并不清楚, 可以通过这些物质含量的测定,
同棉花发育和棉纤维发育的过程中的各物质含量的变
化结合起来分析, 可以初步判定该基因的功能, 从而
为棉花生长发育研究提供有力的依据。
964 作 物 学 报 第 34卷

4 结论
从优质陆地棉品系 7235中克隆了一个GhSAHH
全长基因。GhSAHH在陆地棉 TM-1的各部分组织、
器官中都表达, 在根、下胚轴中优势表达。在基因
组中是单拷贝, 被定位于第 20 号染色体 SSR 标记
BNL2570(2.1 cM)和 NAU3070(0.7 cM)之间。
References
[1] Chen X(陈昕 ), Wang L(王琳 ). Research progress of
S-adenosylhomocysteine hydrolase and its inhibitors. Chin J
Med Chem (中国药物化学杂志), 1998, 8(1): 66−72 (in Chi-
nese)
[2] Tanaka H, Masuta C, Uehara K, Kataoka J, Koiwai A, Noma
M. Morphological changes and hypomethylation of DNA in
transgenic tobacco expressing antisense RNA of the
S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase gene. Plant Mol Biol,
1997, 35: 981−986
[3] Shu S, Mahadeo D C, Liu X, Liu W L, Parent C A, Korn E D.
S-adenosylhomocysteine hydrolase is localized at the front of
chemotaxing cells, suggesting a role for transmethylation
during migration. Proc Natl Acad Sci USA, 2006, 103:
19788−19793
[4] Palmer J L, Abeles R H. The mechanism of action of
S-adenosylhomocysteine hydrolase. J Biol Chem, 1979, 254
(4): 1216−1217
[5] Tang K-X(唐克轩), Kai G-Y(开国银), Zhang L(张磊), Pan
Z(潘征), Zhao L-X(赵凌侠), Sun X-F(孙小芬), Zheng J-G(郑
金贵). Research of RACE and its application on plant gene
cloning. J Fudan Univ (Nat Sci)(复旦学报 ·自然科学版 ),
2002, 41(6): 704−709 (in Chinese with English abstract)
[6] Hao B-L(郝柏林 ), Zhang S-Y(张淑誉 ). Bioinformatics
Manual (生物信息学手册). Shanghai: Shanghai Scietific and
Technical Publisher, 2000
[7] Jiang J-X(蒋建雄), Zhang T-Z(张天真). Extraction of total
RNA in cotton tissues with CTAB-acidic phenolic method.
Cotton Sci (棉花学报), 2003, 15(3): 166−167 (in Chinese
with English abstract)
[8] Paterson A H, Brubaker C L, Wendel J F. A rapid method for
extraction of cotton (Gossypium spp.) genomic DNA suitable
for RFLP and PCR analysis. Plant Mol Biol Rep, 1993, 11:
122−127
[9] Guo W Z, Cai C P, Wang C B, Han Z G, Song X L, Wang K,
Niu X W, Wang C, Lu K Y, Shi B, Zhang T Z. A microsatel-
lite-based, gene-rich linkage map in tetraploid cotton reveals
genome structure, function and evolution in Gossypium. Ge-
netics, 2007, 176: 527−541
[10] Van-Ooijen J W, Voorrips R E. JoinMapR Version 3.0: Soft-
ware for the Calculation of Genetic Linkage Maps. 2001,
CPRO-DLO, Wageningen
[11] Liu R-H(刘仁虎), Meng J-L(孟金陵). MapDraw: a microsoft
excel macro for drawing genetic linkage maps based on given
genetic linkage data. Hereditas (遗传), 2003, 25(3): 317−321
(in Chinese with English abstract)
[12] Masuta C, Tanaka H, Uehara K, Kuwata S, Koiwai A, Noma
M. Broad resistance to plant viruses in transgenic plants con-
ferred by antisense inhibition of a host gene essential in
S-adenosylmethionine-dependent transmethylation reactions.
Proc Natl Acad Sci USA, 1995, 92: 6117−6121
[13] Ji Y(纪宇), Li Z-T(李振涛), Zhu Q(朱奇), Li A-X(李爱秀).
Current status in research of S-adenosylhomocysteine hy-
drolase and its inhibitors. Prog Pharmac Sci (药物科学进展),
2005, 29(11): 481−486 (in Chinese with English abstract)
[14] Li C-H(李春红). Study on separation and cloning of cotton fiber
cell elongation-related genes and their expression characteristics
by cDNA-microarray. MS Dissertation of Nanjing Agricultural
University, 2002 (in Chinese with English abstract)
[15] Kloora D, Lu¨dtkea A, Stoevab S, Osswald H. Adenosine
binding sites at S-adenosylhomocysteine hydrolase are con-
trolled by the NAD+/NADH ratio of the enzyme. Biochem
Pharmacol, 2003, 66: 2117−2123