全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(9): 1574−1580 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

基金项目: 国家重点基础研究发展计划(973 计划)项目(2002CB111301); 教育部长江学者和创新团队发展计划项目(IRT0432); 高等学校创新引
智计划项目(B08025)
作者简介: 贺亚军(1979−), 女, 博士。
*
通讯作者(Corresponding author): 张天真, 教授。E-mail: cotton@njau.edu.cn
Received(收稿日期): 2007-12-19; Accepted(接受日期): 2008-03-14.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.01574
棉花 6个小分子质量热激蛋白基因的序列、表达与定位
贺亚军 郭旺珍 张天真*
(南京农业大学棉花研究所/作物遗传与种质创新国家重点实验室, 江苏南京 210095)
摘 要: 利用棉花纤维 cDNA 文库, 分离到 6 个小分子质量的热激蛋白基因。序列结构分析发现, 它们分别属于 3
种不同类型的小热激蛋白。RT-PCR 分析表明, 它们在棉花体内具有不同的转录表达特征, 可能行使不同的功能, 它
们的转录与棉花特定的发育阶段相关, 线粒体小热激蛋白和细胞质 I 类小热激蛋白基因受纤维启始和分化的调控,
而细胞质 II 类小热激蛋白与棉花叶片的生长发育相关。利用本实验室的四倍体棉花遗传图谱, 对这 6 个小热激蛋白
基因进行定位, 其中 3个被定位在 A4、D8和 A6染色体上。
关键词: 棉花; 小分子质量热激蛋白; 表达; 基因定位
Cloning, Expression, and Mapping of Six Low-Molecular-Weight Heat-
Shock Protein Genes in Cotton
HE Ya-Jun, GUO Wang-Zhen, and ZHANG Tian-Zhen*
(National Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement / Cotton Research Institute, Nanjing Agricultural University, Nanjing
210095, Jiangsu, China)
Abstract: Heat-shock proteins (HSPs), known as stress proteins, are created when cells are exposed to elevated temperatures, or
to other kinds of environmental stress. Although HSPs were first characterized because their expression increased in response to
elevated temperature, some of them are found in normal, nonstressed cells. HSPs have many biochemical functions in cell me-
tabolism during plant developmental process. The objective of the study was to isolate low-molecular-weight HSP genes, further
put a foundation to illustrate them function in cotton fiber developmental stages. Six low-molecular-weight HSP genes were iso-
lated from cotton fiber cDNA library. Sequence analysis showed that they belong to three different types of low-molecular-weight
HSP. RT-PCR analysis revealed that they exhibit different transcripional profile in cotton. The mitochondrial and cytoplasmic I
HSP genes were regulateded by the fiber initiation; however, cytoplasmic II HSP genes were more closely correlated with the
growth and development of cotton leaf. Using genetic map of the tetraploid cotton constructed by our laboratory, three of these
genes, LMWHSP1, LMWHSP2, and LMWHSP3, were mapped on the cotton chromosomes A4, D8, and A6, respectively.
Keywords: Cotton; Low-molecular-weight heat-shock protein; Expression; Gene mapping
热激蛋白(heat-shock protein, HSP)是指生物体
受热或其他理化因素作用后, 抑制一些蛋白质的合
成, 同时新合成或增加合成的一类应激蛋白, 又称
热击蛋白、热休克蛋白[1-2]。热激蛋白广泛存在于自
然界原核与真核细胞中, 具有独特的分子生物学特
性及功能 , 在生物体内参与多种复杂的功能活动 ,
有“瑞士军刀”之称[3]。这类蛋白不仅可以维持细胞的
生存和功能, 在不利条件下起到应激保护作用, 而
且还参与细胞信号转导途径中的调节[4]。
HSP 是一组糖蛋白[5], 目前尚无明确的分类标
准。根据相对分子质量的大小和同源程度, 热激蛋
白可分为 HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、分子
量在 15~30 kD 的小分子质量 HSP(low-molecular-
weight HSP, LMWHSP)和泛素等几个家族[4,6]。植物
的热激蛋白多以小分子质量热激蛋白为主 [7], 根据
细胞学定位可分为 5类, 即细胞质 I类 LMWHSP, 细
第 9期 贺亚军等: 棉花 6个小分子质量热激蛋白基因的序列、表达与定位 1575


胞质 II 类 LMWHSP, 线粒体 LMWHSP, 叶绿体
LMWHSP 和内质网 LMWHSP[8]。已经发现植物细
胞质 I 类 LMWHSP, 细胞质 II 类 LMWHSP 和线粒
体 LMWHSP 具有分子伴侣功能[9-10], 主要是有效地
捕捉未折叠蛋白 , 使之处于有利于折叠的感受态 ,
并与其他 HSP 共同作用使之有效折叠。除此之外,
细胞质 LMWHSP 可以提高细胞的耐热性[11], 线粒
体 LMWHSP 可提高线粒体的耐热性 [12]。叶绿体
LMWHSP可以保护光系统 II的电子传递系统, 提高
叶绿体的耐热性[13]。
国内外已对小麦、大豆、玉米、高粱、番茄、
胡萝卜等[14-18]作物的 HSP 进行了研究。关于棉花
HSP 研究也取得初步结果 [19], 主要集中在对棉花
HSP 产生规律及其与高温期蕾铃脱落关系的研究。
目前, 从分子水平上对棉花 HSP的研究尚未见报道,
更缺少小分子质量 HSP在棉花中表达和染色体定位
的系统研究。本研究主要从棉纤维 cDNA 文库中分
离到 6 个小分子质量的 HSP, 分别命名 为
LMWHSP1、LMWHSP2、LMWHSP3、LMWHSP4、
LMWHSP5、LMWHSP6, 研究其在棉花不同器官不
同组织以及胚珠和纤维发育的不同时期的转录表达
特征, 并将 LMWHSP1、LMWHSP2、LMWHSP3 定
位在四倍体棉花遗传图谱上。
1 材料与方法
1.1 植物材料
供试陆地棉(Gossypium hirsutum L.)品种 7235,
选择成熟饱满种子硫酸脱绒后种植于南京农业大学
网室, 采集种植 2 周后的棉花幼根、幼茎、幼叶以
及不同发育时期的胚珠和纤维, 所取材料经过液氮
冷冻, −80℃保存, 供提取 RNA。
1.2 RNA的分离
采用CTAB-酸酚法提取细胞总RNA[20], 随后用
无 RNase的 DNase (TaKaRa公司)除去 RNA中残留
的 DNA。
1.3 RT-PCR分析
利用 M-MLV (Promega)反转录合成第一链
cDNA。取 1 μg总 RNA 按照说明书操作, 将反转录
产物稀释 10 倍后取 1 μL 进行 RT-PCR。PCR 反应
程序为 94℃预变性 3 min, 94℃变性 45 s, 55℃退火
45 s, 72℃延伸 1 min, 24~28 个循环(LMWHSP1、
LMWHSP2、LMWHSP3、LMWHSP4、LMWHSP5和
LMWHSP6 的扩增循环数分别为 28、24、24、28、
26和 26); 72℃延伸 5 min。为校正用于 RT-PCR反
应的模板量, 以一对专一性扩增真核生物组成型表
达基因 EF1α (GenBank 登录号 AF120093)的引物进
行平行 PCR反应(24个循环)作为内对照[21]。扩增产
物经 1.2%琼脂糖凝胶电泳分离。用于 PCR反应的引
物及扩增片段大小见表 1。
1.4 氨基酸序列比对与系统进化树的构建
利用 Clustalx 软件将这 6 个小分子质量热激蛋
白基因的氨基酸序列进行多序列比对和系统进化树
分析。
1.5 基因定位
用[(TM-1×海 7124) ×TM-1][22]为群体。扩增所
用的引物为 RT-PCR实验中所用引物。将扩增产物
直接电泳, 根据亲本 TM-1与海 7124的带型值及其
BC1群体的带型值, 应用 JoinMap3.0 [23]作图软件将
基因整合到本实验室已有的该群体遗传图谱上[24]。
对于基因扩增产物在亲本 TM-1与海 7124间没有多
态的基因, 将亲本 TM-1和海 7124的基因进行测序,
根据测序结果 , 应用 NEBcutter 软件分析(http://

表 1 用于 PCR反应的引物及扩增片段
Table 1 Primers using for PCR reaction and amplified product
基因
Gene
引物
Primer
扩增片段的大小
Amplified product (bp)
LMWHSP1 5′-GCAGCAGAAACTCTAAGACAGC-3′
5′-TTGACAATAGGCACAAGACACT-3′ 626
LMWHSP2 5′-AAGATCAACAAGCATTCAAACA-3′
5′-TAACCAGAAATGTCAATAGCCT-3′ 508
LMWHSP3 5′-GCAACCGAAAACCGAATC-3′
5′-AGAAACCACCACGGCAAA-3′ 624
LMWHSP4 5′-TCTCCCAAAATATCATAATCCA-3′
5′-TTAGAAACCAAAGTTCAATCGT-3′ 549
LMWHSP5 5′-GCTCACCAAATTCAACGACG-3′
5′-CCTTCACTTTAGGCACAACCA-3′ 479
LMWHSP6 5′-AAAATGGCAATGATTCCTACC-3′
5′-AAATAACAAACGAAACCACAGA-3′ 528
EF1α 5′-AGACCACCAAGTACTACTGCAC-3′
5′-CCACCAATCTTGTACACATCC-3′ 495
1576 作 物 学 报 第 34卷

www.neb.com), 选择合适的限制性内切酶消化扩
增产物后电泳 , 同样根据两者之间的带型值及其
BC1群体的带型值将该基因整合到本实验室已有的
该群体遗传图谱上[24]。参照王凯等[25]的方法命名染
色体。
2 结果与分析
2.1 6个小分子质量 HSP基因序列分析
LMWHSP1全长 761 bp, ORF编码 159个氨基酸,
LMWHSP2 全长 524 bp, ORF 编码 154 个氨基酸,
LMWHSP3 全长 767 bp, ORF 编码 157 个氨基酸,
LMWHSP4 全长 796 bp, ORF 编码 157 个氨基酸,
LMWHSP5 全长 902 bp, ORF 编码 217 个氨基酸,
LMWHSP6全长 744 bp, ORF编码 160个氨基酸。将这
6个基因进行BLAST分析表明, LMWHSP1、LMWHSP2、
LMWHSP4、LMWHSP6 都与细胞质 I 类的热激蛋白
序列同源性较高, 而 LMWHSP3 与细胞质 II 类热激
蛋白序列同源性较高, LMWHSP5与线粒体热激蛋白
序列同源性较高。将这 6个小分子质量 HSP的序列
提交 GenBank(序列登录号 LMWHSP1- LMWHSP6:
EU223832-EU223837)。
多序列比对和系统进化树分析表明, LMWHSP1、
LMWHSP2、LMWHSP3、LMWHSP4、LMWHSP6聚为
一支, LMWHSP5 单独为一支(图 1)。表明线粒体热激

图 1 基于 6个小 HSP基因氨基酸序列的系统进化树
Fig. 1 Phylogenetic tree based on amino acid sequences encoding six low-molecular-weight HSP genes
分支上的数值表示 Bootstrap值。The numbers above the branch represent bootstrap values (out of 1000).

蛋白与细胞质热激蛋白的亲缘关系较远, 而同为细胞
质的热激蛋白的亲缘关系较近。在所有细胞质的热激
蛋白中, 与细胞质 II 类热激蛋白序列同源性较高的
LMWHSP3单独为一小支, 而与细胞质 I类热激蛋白序
列同源性较高的 4 个基因 LMWHSP1、LMWHSP2、
LMWHSP4、LMWHSP6聚为一小支(图 1), 这表明不同
类型细胞质的热激蛋白亲缘关系较远, 而同一类型细
胞质的热激蛋白亲缘关系较近。
2.2 6个小分子质量 HSP基因的转录表达
这 6 个小分子质量热激蛋白基因在棉花体内具
有不同的表达特征(图 2)。LMWHSP2 是组成型表达
的基因， LMWHSP1、 LMWHSP4、 LMWHSP5、
LMWHSP6 都在开花当天的胚珠中表达量最高，而
LMWHSP3在棉花叶片中优势表达。
2.3 3个小分子质量 HSP基因的定位
将这 6个小分子质量HSP基因在海 7124和 TM-1
中进行多态分析, LMWHSP2、LMWHSP3的 PCR扩
增产物直接电泳后在两亲本之间存在差异 , 而
LMWHSP1、LMWHSP4、LMWHSP5、LMWHSP6的 PCR
扩增产物直接电泳后亲本之间没有发现差异。随后,
我们在 TM-1、海 7124中对 LMWHSP1、LMWHSP4、

图 2 6个小分子质量 HSP的 RT-PCR
Fig. 2 RT-PCR of six low-molecular-weight HSP from 7235
1、2和 3分别表示 7235苗期根、茎、叶; 4、5、6和 7分别表
示 7235开花后 0、3、5和 8 d的胚珠与纤维; 8、9和 10分别表
示 7235开花后 11、14和 17 d的纤维; EF1α为植物组成性表达基因。
Lanes 1, 2, and 3 represent roots, stems, and leaves at seedling
stage, respectively; lanes 4, 5, 6, and 7 represent ovules and fibers
at 0, 3, 5, and 8 DPA, respectively; lanes 8, 9, and 10, represent
fibers at 11, 14, and 17 DPA, respectively. EF1α is constituted
expression gene of plant.
第 9期 贺亚军等: 棉花 6个小分子质量热激蛋白基因的序列、表达与定位 1577


LMWHSP5、LMWHSP6的扩增产物测序, 结果表明,
LMWHSP1 在两亲本之间存在单核苷酸多态性
(SNPs), 利用该基因的 CAP 标记对其进行了定位。
测序结果发现 LMWHSP4、LMWHSP5、LMWHSP6
的扩增产物在 2个亲本中不存在差异, 最终将其中 3
个基因 LMWHSP1、LMWHSP2、LMWHSP3 整合到
四倍体棉花遗传图谱上。
2.3.1 LMWHSP1基因的定位 利用 LMWHSP1基因
设计引物扩增 TM-1 和海 7124, 扩增产物测序结果表
明内切酶 Tsp509I可以酶切扩增产物, 其中 TM-1的产
物可被酶切为 51、83和 492 bp 3个片段, 海 7124可
被酶切为 83 bp和 543 bp 2 个片段(图 3)。应用 Join
Map3.0 分析标记间的位置关系, 计算得出 LMWHSP1
基因与 SSR标记 NAU3205的遗传距离为 0.8 cM, 与
另外一个标记 EM10D22的距离为 5.7 cM。因此, 该基
因被整合到四倍体棉花遗传图谱的A4染色体上(图 4)。
2.3.2 LMWHSP2 基因的定位 将 LMWHSP2 基
因的 PCR扩增产物直接电泳(图 5), 分析标记间的位
置关系 , 计算得出 LMWHSP2 基因与 SSR 标记
NAU3786的遗传距离为 1.6 cM, 与另外一个 SSR标
记 NAU2876的距离为 0.1 cM。该基因被整合到四倍
体棉花遗传图谱的 D8染色体上(图 4)。
2.3.3 LMWHSP3 基因的定位 将 LMWHSP3 基
因的 PCR扩增产物直接电泳分析(图 6), 分析标记间
的位置关系, 计算得出 LMWHSP3 基因与 SSR 标记
NAU4946 的遗传距离为 1.5 cM, 与另外一个标记
DC1SA14的距离为 0.6 cM。该基因被整合到四倍体
棉花遗传图谱的 A6染色体上(图 4)。

图 3 作图亲本与作图群体中部分单株 LMWHSP1基因的 Tsp509I酶切
Fig. 3 Digestion of the LMWHSP1 gene in mapping parents and individuals by Tsp509I
M: marker; 1、2和 3分别表示 TM-1、H-7124和(TM-1×H-7124)F1; 4、5和 6分别表示酶切后的 TM-1、H-7124和 F1;
7~33表示部分单株的 Tsp509I酶切结果。
M: marker; 1, 2, and 3 represent undigested LMWHSP1 gene in TM-1, H-7124, and F1; 4, 5, and 6 represent digested LMWHSP1 gene in
TM-1, H-7124, and F1; 7–33 represent digested LMWHSP1 gene from some individuals of mapping population.

图 4 LMWHSP1、LMWHSP2和 LMWHSP3的定位
Fig. 4 The mapping of LMWHSP1, LMWHSP2, and LMWHSP3 in tetraploid cotton

图 5 作图亲本与作图群体中部分单株 LMWHSP2基因的多态性
Fig. 5 Polymorphisms of the LMWHSP2 gene in mapping parents and individuals
M: marker; 1、2和 3分别表示 TM-1、H-7124和(TM-1×H-7124)F1 LMWHSP2基因的扩增结果;
4~33表示部分单株 LMWHSP2基因的扩增结果。
M: marker; 1, 2, and 3 represent LMWHSP2 gene in TM-1, H-7124, and F1; 4–33 represent LMWHSP2 gene
from some individuals of [(TM-1×H-7124) × TM-1] population.
1578 作 物 学 报 第 34卷


图 6 作图亲本与作图群体中部分单株 LMWHSP3基因的多态性
Fig. 6 Polymorphisms of the LMWHSP3 gene in mapping parents and individuals
M: marker; 1、2和 3: TM-1、H-7124和(TM-1×H-7124)F1 LMWHSP3基因的扩增结果; 4~33:部分单株 LMWHSP3基因的扩增结果。
M: marker; 1, 2, and 3 represent LMWHSP3 gene in TM-1, H-7124, and F1; 4–33 represent LMWHSP3 gene from some individuals of [(TM-1
×H-7124) × TM-1] population.

3 讨论
天然小分子质量热激蛋白是以 12 聚体的形式存
在 [26], 是一个非常多样的群体, 不同的组织有着不
同数目的小分子质量热激蛋白, 啤酒酵母[27]只含单
一小分子质量热激蛋白, 而高等植物有 30多种小分
子质量热激蛋白[28], 其分子量也有很大的差异。本
研究从棉花纤维 cDNA 文库中分离到 6 个不同的
小分子质量热激蛋白 , 其中 1 个属于线粒体
LMWHSP, 1个属于细胞质 II类 LMWHSP, 4个属于
细胞质 I类 LMWHSP。本研究没有分离到内质网和
叶绿体 LMWHSP, 棉花中应该还有其他的小分子质
量热激蛋白存在。
近年来, 热激蛋白已成为目前生命科学的热点
课题。在植物领域中, 小分子质量热激蛋白的研究
也取得了很大进展。高温胁迫时, 植物细胞在分子
水平上最突出的反应是热激蛋白的表达, 其中小分
子质量热激蛋白是主要热激表达产物, 它们可以减
缓蛋白质的热变性, 促进热变性蛋白的复性 [29], 被
认为是提高植物细胞抗热能力的重要原因之一[30]。
因此, 在许多作物上, 集中围绕热激蛋白的可诱导
性(主要是受高温诱导性)展开研究。大豆每个细胞在
热激下可积累 2万拷贝, 20种编码 14~27 kD的热激
蛋白 mRNA[31], 热激下黄化大豆苗中小热激蛋白的
合成与其生长速度相关, 推测小分子质量热激蛋白
参与幼苗获得耐热性过程, 在研究大豆抗逆境及提
高大豆贮藏蛋白含量的过程中, 发现 HSP35、HSP38
基因对大豆贮藏蛋白的形成有一定影响, 它们能被
高温、干旱、积水和砷离子诱导而表达量增加[32]。
胡萝卜受热激诱导也可产生多种分子量不等的小热
激蛋白[28], 将线粒体小分子热激蛋白基因导入烟草,
发现高温下转基因烟草线粒体的氧化磷酸化效率高
于对照, 花粉粒的高温萌发率也高于对照, 线粒体
小分子热激蛋白对线粒体具有保护作用 ,而且可以
提高细胞的抗热能力[12]。将 35S CaMV启动子驱动
的番茄叶绿体小分子热激蛋白 cDNA导入番茄表明,
叶绿体小分子热激蛋白的过量表达提高了植物抗寒
性[33]。虽然这些小热激蛋白的研究取得了很大进展,
但是目前还没有关于小分子质量热激蛋白在棉纤维
发育过程中的研究报道。
本研究发现, 6个小热激蛋白在棉花体内具有不
同的表达特征, 大多数(线粒体小热激蛋白和细胞质
I 类小热激蛋白)都在开花当天的胚珠中表达量最高,
而细胞质 II类小热激蛋白 LMWHSP3在棉花叶片中
优势表达。说明不同类型的小热激蛋白在棉花不同
器官或组织表达的特征并行使不同的功能, 线粒体
小热激蛋白和细胞质 I 类小热激蛋白与胚珠和纤维
的发育相关, 而细胞质 II 类小热激蛋白与叶片的生
长发育密切相关。LMWHSP1、LMWHSP4、LMWHSP5
和 LMWHSP6 的转录与棉花胚珠和纤维的发育阶段
相关, 它们在开花当天的胚珠中表达量较高。开花
当天, 纤维细胞启始分化, 这些小热激蛋白的高度
转录暗示, 它们的表达受纤维发育的诱导。一些植
物的小热激蛋白也受到本身发育的调控。在大豆、
百合小孢子、豌豆种子、小麦胚、芒果种子和荔枝
种子中, 都有受发育调控的小热激蛋白[33-36]。还有研
究表明, 小热激蛋白与植物细胞的减数分裂有关[37]。
非常有趣的是, 在植物胚胎发育前期没有热激蛋白
mRNA转录[38-40], 这一点甚至被作为植物小热激蛋白
的一个表达特点来阐述[41]。但是, 在棉花中发现在
胚珠发育的前期, 即开花当天的胚珠中, 线粒体小
热激蛋白和细胞质 I 类小热激蛋白都有较高丰度的
转录。而棉花胚珠细胞的特异性在于, 部分胚珠表
皮细胞将发育为纤维, 从这一点可以推测, 这部分
热激蛋白的表达与胚珠表皮细胞——纤维细胞的发
育密切相关。目前已有报道, 热激蛋白通过对信号
传导网络各个关键部位的调节, 控制着细胞信号转
导, 从而广泛地参与调控细胞分裂、细胞分化、形
态建成等重要生理途径[42-43]。在棉纤维发育过程中,
开花当天纤维细胞处在原始分化与突起时期, 期间
第 8期 贺亚军等: 棉花 6个小分子质量热激蛋白基因的序列、表达与定位 1579


线粒体小热激蛋白和细胞质 I 类小热激蛋白高表达,
暗示这类小热激蛋白可能参与调节棉纤维细胞启始
分化和突起过程中的信号传导途径。
本研究中 3个小热激蛋白基因 LMWHSP1、LM-
WHSP2 和 LMWHSP3 被定位到棉花染色体上, 而另
外的 3个小热激蛋白基因 LMWHSP4、LMWHSP5和
LMWHSP6没有被定位, 主要是因为这 3个基因在亲
本海 7124和 TM-1中的扩增序列不存在差异。所以,
继续定位这些未被定位的基因需要利用其他作图群
体。
4 结论
从棉花材料 7235纤维 cDNA文库中分离出 6个
小分子质量热激蛋白基因 LMWHSP1、LMWHSP2、
LMWHSP3、LMWHSP4、LMWHSP5和 LMWHSP6, 分
别编码 159、154、157、157、217和 160个氨基酸。
LMWHSP1、LMWHSP2、LMWHSP4 和 LMWHSP6
属于细胞质 I类小热激蛋白, LMWHSP3属于细胞质
II 类小热激蛋白, LMWHSP5 属于线粒体小热激蛋
白。LMWHSP2 是组成型表达的基因, LMWHSP1、
LMWHSP4、LMWHSP5和 LMWHSP6都在开花当天
的胚珠中表达量最高, 而 LMWHSP3 在棉花叶片中
优势表达。LMWHSP1、LMWHSP2和 LMWHSP3分
别被定位到棉花 A4、D8和 A6染色体上。
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