全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2009, 35(8): 1558−1561 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(30871467)和江苏省高校研究生科技创新计划项目资助。
*
通讯作者(Corresponding author): 王忠, E-mail: wangzhong@yzu.edu.cn
第一作者联系方式: E-mail: yxwang2100@yahoo.cn
Received(收稿日期): 2008-11-15; Accepted(接受日期): 2009-02-17.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.01558
cpt1基因与水稻根负向光性运动的关系
汪月霞1,2 王 忠2,* 刘全军1 赵会杰1 顾蕴洁2 钱晓旦2 袁志良1
1河南农业大学生命科学学院, 河南郑州 450002; 2扬州大学生物科学与技术学院, 江苏扬州 225009
摘 要: 为了研究cpt1基因与水稻根负向光性运动的关系, 探讨IAA横向运输与水稻根负向光性运动的关系。检测了
外源试剂CaCl2、EDTA以及IAA对水稻根的负向光性运动的效应, 并采用RT-PCR的方法验证了不同外源试剂对cpt1
基因表达的影响。结果表明, 水稻根经光照 24 h后, 与对照相比, 1 mg L−1的CaCl2和 0.001 mg L−1的IAA能明显促进水
稻根负向光性的弯曲生长, 1 mg L−1的EDTA (CaCl2的抑制剂)明显抑制水根负向光性的弯曲生长; cpt1基因的表达受
上述外源试剂诱导, 并表现与水稻根的负向光性生长呈明显的正相关性, 推测IAA的横向运输及其运输载体CPT1 蛋
白对水稻根的负向光性运动具重要作用。
关键词: 水稻; 根; 负向光性; IAA载体蛋白; cpt1基因
Relationship between cpt1 Gene and the Negative Phototropism in Rice Roots
WANG Yue-Xia1,2, WANG Zhong2,*, LIU Quan-Jun1, ZHAO Hui-Jie1, GU Yun-Jie2, QIAN Xiao-Dan2, and
YUAN Zhi-Liang1
1 College of Life Sciences, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China; 2 College of Biosciences and Biotechnology, Yangzhou
University, Yangzhou 225009, China
Abstract: With the purpose of studying the relationship between cpt1 gene and negative phototropism in rice roots, discussing the
contribution of asymmetric distribution of IAA on negative phototropism in rice roots, CaCl2, EDTA and IAA were assayed for
their effects on the negative phototropism in rice roots, as well as effects on the expression of cpt1 gene on the basis of reverse
transcription-PCR. The result showed that, the negative phototropism in rice roots was improved by the treatment with 1 mg L−1
CaCl2 and 0.001 mg L−1 IAA in culture solution under light for 24 h but constrained by 1 mg L−1 EDTA. A similar effect was
shown from the analysis of cpt1 gene expression, which suggested CPT1 protein could be induced by CaCl2 and IAA. The effects
also showed a positive correlation between the expression of cpt1 and negative phototropism in rice roots. It could be supposed
from present results that the asymmetric distribution of IAA is an important step for the negative phototropism process in rice
roots, which probably is particularly associated with CPT1 protein as a carrier of IAA.
Keywords: Rice; Root; Negative phototropism; IAA carrier protein; cpt1 gene
向光性是高等植物中广泛存在的生理现象, 是植物
适应环境变化的一种体现[1]。近年来, 以双子叶植物的模
式植物拟南芥为材料 , 对植物向光性运动的生理与分子
机制的研究已经取得很大进展[2]。采用构建突变体库筛选
拟南芥胚芽鞘向光性缺失突变体并结合基因组学分析的
方法 , 已经鉴定出与向光性运动密切相关的基因或蛋白
[3-5]。NPH3 蛋白是拟南芥下胚轴向光性运动中的信号组
分之一, 促进下胚轴向光性运动[6], 在黑暗条件下它处于
磷酸化状态, 而phot1处于去磷酸化状态, phot1被蓝光激
活后发生磷酸化, 启动光信号的转导[7], NPH3 迅速去磷
酸化[8], 从而推动光信号的转导。RPT2 是另一种信号组
分, 该蛋白是NPH3的同源体[9]。此外, PSK1、PSK2也是
拟南芥下胚轴向光性运动的信号组分[10-11]。拟南芥突变体
研究的结果也表明, NPH3、RPT2 以及PSK1 在根的负向
光性运动中也起重要的作用[4,12-13]。
燕麦(Avena sativa L.)、玉米(Zea mays L.)以及水稻
(Oryza sativa L.)等禾本科植物目前也已广泛作为研究植
物向光性运动的材料[1]。生长素在禾本科植物胚芽鞘向光
性运动中的作用已有不少报道 , 该类研究的结果遵守
Cholodny-Went假说, 该假说认为植物的向光性运动是生
长素的不对称分布造成的。生长素(吲哚-3-乙酸)在向光性
运动植物体内的不对称分布已经在玉米[14]、水稻[15-16]以
第 8期 汪月霞等: cpt1基因与水稻根负向光性运动的关系 1559

及豌豆[17]中通过对其两侧生物量的测定而得到证明。近
年来对拟南芥的研究结果也为IAA参与植物的向光性运
动提供了分子依据[18-19]。植物不同器官中的生长素水平与
生长素的极性运输有着密切的联系 , 生长素在细胞间运
输是直接由生长素载体承担的[20]。在拟南芥中已经鉴定
一种载体蛋白PIN1[21]。Friml等[22]研究发现当植物受到单
向刺激后, 体内的生长素载体PIN3 蛋白发生不对称的分
布和动态运动。这对生长素的侧向运输起着较大的作用。
Haga等[16]的研究结果表明, CPT1 (coleoptile phototropism
1)蛋白是水稻胚中拟南芥NPH3 的高度同源体, 该蛋白可
能是水稻胚芽鞘向光性运动过程中IAA横向运输的重要
载体, cpt1基因缺失突变体的胚芽鞘无向光性弯曲发生。
我们首先发现了水稻根具有明显的负向光性 [23-24],
并初步认为是由于IAA横向运输不均导致的[15]。然而, 有
关IAA横向运输的载体蛋白CPT1 的编码基因在水稻根负
向光性运动中的功能尚没有报道。高等植物向光性运动机
理的复杂性也使我们需要对cpt1 基因在水稻根负向光性
运动过程中的功能做独立的研究。本实验将对生长素在植
物向性运动中的作用以及向光性运动中的信号转导途径
提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
水稻(Oryza sativa L.)品种日本晴(粳)。
1.2 不定根的培养
取分蘖期的秧苗, 剥除分蘖, 剪去根系, 将主茎以泡
沫塑料板固定插入盛水的玻璃方缸 , 泡沫塑料板具适宜
的圆孔, 稻株植入圆孔中, 使茎基部垂直插入水下 2 cm。
待根原基长出后进行试验。分别用 0.001 mg L−1 IAA、1 mg
L−1 CaCl2、1 mg L−1 EDTA作为培养液, 以H2O作为对照。
暗室中培养, 设置照光和不照光两组处理, 照光条件为室
温下的 540 Cd。24 h后取出, 测量稻根弯曲度, 每样重复
3次, 取平均值, 结果用±SE表示。
1.3 引物设计
根据 GenBank数据库中登录的水稻(Oryza sativa L.)
cpt1 基因的序列 (登录号为 AB186127), 采用 Primer
Premier 5.0软件设计 1对可用于 cDNA扩增的 PCR引物
(cpt1 F: 5′-TTGCAGTGCATAGCCAGTAC-3′; cpt1 R:
5′-TTTC CACGTACTTCTCGTCC-3′)。并根据水稻 β-action
基 因 设 计 引 物 , 作 为 RT-PCR 内 参 (β-action F:
5′-CTGGGTTCGC CGGAGATGAT-3′; β-action R:
5′-TGAGATCACGCCCAG CAAGG-3′)。引物序列由上海生
工生物工程有限公司合成。
1.4 水稻根基因组 DNA的提取以及 cpt1引物 PCR扩增
1.4.1 水稻根基因组DNA的提取 取 1.0 g水稻根弯曲
部分, 在液氮中研磨成粉末状。加提取液(含 0.5 mol L−1
EDTA-Na2, 1 mol L−1 Tris-HCl, 1 mol L−1 KCl) 1 200 µL,
摇匀置 65℃水浴中 30 min。12 000×g离心 15 min, 取上清
液至 1.5 mL Eppendorf管里。加入−20℃预冷的异丙醇 700
µL, 冷冻 2~3 h。在 12 000×g离心 8 min, 弃上清液。加 70%
无水乙醇 800 µL, 室温放置 4 h, 12 000×g离心 5 min, 弃上
清液, 晾干, 加 25 µL ddH2O溶解, 保存于 4℃, 备用。
1.4.2 PCR扩增及产物验证 cpt1 引物PCR扩增体系
中含 200 µmol L−1 dNTP、1×HiFi缓冲液、2.5 mmol L−1
MgCl2、2.5 U Taq DNA聚合酶(上海欣百诺生物科技有限
公司)、0.4 µmol L−1 cpt1 F和cpt 1 R引物, 用ddH2O将终体
积调成 20 µL。反应程序为：94℃ 5 min热启动, 94℃变性
1 min, 58℃退火 1 min, 72℃延伸 1 min, 36个循环, 72℃延
伸 10 min后 8℃保存。PCR反应结束后采用琼脂糖凝胶电
泳 检 测 PCR 产 物 , 用 TIANGEN 凝 胶 回 收 试 剂 盒
(TIANGEN)回收纯化目的DNA扩增产物, 并送上海生工
生物工程有限公司测序。
1.5 RT-PCR
1.5.1 总RNA的提取 取 0.12 g新鲜水稻根弯曲部分,
采用TRNzol试剂 (TIANGEN公司 )按试剂说明书提取总
RNA, 所用器皿均用 0.1% DEPC水清洗后灭菌(121℃, 15
min), 并烘干 , 所用试剂都用无RNase的水配置。将总
RNA溶于 50 µL无RNase的水中。采用甲醛变性的 2%琼脂
糖凝胶电泳对RNA进行纯度分析和定量。
1.5.2 RT-PCR扩增
cDNA的合成: 采用TaKaRa反转录试剂盒, 10 µL反
应体系中含 2 µL 5×PrimeScript缓冲液、0.5 µL Prime Script
RT Enzyme Mix I、0.5 µL 50 mmol L−1 Oligo dT Prime、0.5
µL 100 mmol L−1 Random 6 mers、1 µL总RNA样品。将反
应混合液 65℃加热 5 min, 而后转入 37℃, 待温度稳定后,
加入 1 µL Superscript II RT (Lifetech产品)反转录酶。1 h
后, 置于 65℃ 5 min, 以清除剩余的反转录酶。合成产物
于−20℃保存。
cDNA的PCR扩增及产物验证 : 先采用β-action引物 ,
调整cDNA浓度 , 使得不同外源试剂处理所得的水稻根
cDNA的PCR扩增结果均匀一致 , 再采用该cDNA浓度以
及cpt1 基因引物PCR扩增反转录得到的cDNA, 这样可以
较为准确地比较不同外源试剂处理对水稻根中cpt1 基因
表达的影响。25 µL cDNA的PCR扩增反应体系中含 12.5
µL 2×SYBR Premix ExTaq、0.5 µL 10 µmol L−1 cpt1 F、0.5
µL 10 µmol L−1 cpt1 R、2 µL 2×RT反应溶液(cDNA溶液),
补充ddH2O 9.5 µL到 25 µL, 反应程序为 94℃ 5 min热启
动, 94℃变性 30 s, 53℃退火 30 s, 72℃延伸 1 min, 40个循
环, 72℃延伸时间 10 min后 8℃保存。采用TIANGEN凝胶
回收试剂盒(TIANGEN)回收纯化目的DNA扩增产物, 并
送上海生工生物工程有限公司测序。
2 结果与分析
2.1 外源试剂处理对水稻根负向光性的影响
如表 1所示, 水稻根经过 24 h培养后, 在黑暗条件下

1560 作 物 学 报 第 35卷

水稻根垂直向下生长, 而在单侧光照下, 水稻根背光弯曲
生长, 不同的试剂对水稻根弯曲度的影响不同。1 mg L−1
CaCl2最显著促进水稻根负向光性生长, 其弯曲度比对照
提高 19.0%。0.001 mg L−1 IAA也能明显促进水稻根的负
向光性弯曲。CaCl2的抑制剂EDTA则明显抑制水稻根负向
光性生长, 与对照相比, 使水稻根弯曲度下降 27.9%。

表 1 IAA、CaCl2和EDTA处理对水稻根负向光性的影响
Table 1 Effects of IAA, CaCl2, and EDTA on the negative photo-
tropism of rice roots
弯曲角度 Curvature(°) 处理试剂与浓度
Treatment reagent and
concentration
黑暗
Dark
单侧光照
Unilateral light
0.001 mg L−1 IAA 0 38.1±3.6
1 mg L−1 CaCl2 0 42.9±1.7
1 mg L−1 EDTA 0 26.0±4.3
H2O (CK) 0 36.1±3.1
处理后 24 h考察平均数±标准偏差。
Determined after 24 h of treatment, means ± SD.
2.2 外源试剂对水稻根负向光性运动过程中 cpt1 基因表
达量的影响
采用RT-PCR的方法研究了光照及黑暗条件下外源试
剂对稻根中该基因表达量的影响, 以β-action基因的表达
量作为内参(图 1-A), 并采用测序的方法验证RT-PCR 的
反应结果与PCR扩增水稻根基因组DNA结果的序列一致
性。结果表明, 通过RT-PCR得到的产物序列与通过PCR
扩增水稻基因组DNA的结果序列相同 , 均位于GenBank
中已经登录的水稻 cpt1 的mRNA序列上 (登录号为
AB186127)。光照条件下该基因的表达量显著增大。其中,
1 mg L−1 CaCl2处理的水稻根中cpt1 基因的表达量最高,
其次是 0.001 mg L−1 IAA处理, 二者均高于光照条件下的
对照处理。EDTA处理的水稻根中cpt1基因的表达量最低,
明显低于光照条件下的对照处理 , 但仍明显高于黑暗条
件下该基因的表达量, 而黑暗条件下水稻根中cpt1 基因
的表达量很低(图 1-B)。



图 1 IAA、CaCl2和EDTA处理对水稻根负向光性中cpt1基因表达的影响
Fig. 1 The effects of IAA, CaCl2 and EDTA on the expression of cpt1 gene during negative phototropism of rice roots
A：β-action基因; B：cpt1 基因。M: 1500 bp marker; 1~4：黑暗处理的水稻根：1 为 0.001 mg L−1 IAA处理; 2为 1 mg L−1 CaCl2处理; 3为 1 mg
L−1 EDTA处理; 4为水处理。5~8：水稻根在光照下处理; 5为 0.001 mg L−1IAA处理; 6为 1 mg L−1 CaCl2处理; 7为水处理(对照); 8为 1 mg L−1
EDTA处理。
A: β-action gene; B: cpt1 gene; M: 1500 bp marker. Lane 1: dark-grown rice roots incubated with 0.001 mg L−1 IAA; lane 2: dark-grown rice roots
incubated with 1 mg L−1 CaCl2; lane 3: dark-grown rice roots incubated with 1 mg L−1 CaCl2; lane 4: dark-grown rice roots incubated with water (CK); lane
5: light-grown rice roots incubated with 0.001 mg L−1 IAA; lane 6: light-grown rice roots incubated with 1 mg L−1 CaCl2; lane 7: light-grown rice roots
incubated with water (CK); lane 8: light-grown rice roots incubated with 1 mg L−1 EDTA.

3 讨论
近年来对以拟南芥为模式植物开展的高等植物向光
性运动的研究结果指出, NPH3 对拟南芥的向光性运动生
长具有重要的作用 , 在拟南芥中有很多NPH3 的同源
体[6,9,12]。Haga等[16]通过筛选突变体的方法得到了与水稻
胚芽鞘向光性运动密切相关的基因cpt1, 该基因与拟南芥
中的NPH3 具有高度的同源性。目前已有的研究表明 ,
NPH3 和CPT1 均是高等植物向光性运动过程中光信号传
递的重要成分, 与NPH3类似, CPT1也是通过与光受体相
互作用参与植物向光性运动的[6,16]。
本实验表明, 施加外源IAA、CaCl2、EDTA[24]对稻根
中cpt1 基因表达量的影响与这些试剂对水稻根弯曲度的
影响结果是一致的, cpt1基因的表达对水稻根的负向光性
运动起着重要的作用。
Ca2+是拟南芥向光性运动过程中光信号转导的重要
介质[25], 在拟南芥和烟草幼苗细胞内Ca2+均是NPH1 依赖
的向光性运动的重要信号转导物质[26]。本试验结果也表
明, Ca2+对水稻根的负向光性运动具有重要的作用, 这种
作用可能是通过影响细胞光信号转导过程和cpt1 基因的
表达来实现的。
有关IAA对高等植物向光性运动的影响很早就有报
道。虽然目前Cholodny-Went假说存在不少异议[27], 但仍
是高等植物向光性运动机理的最合理的解释之一。我们在
前期研究中将暗中垂直生长的水稻根尖光照 1 h后, 其 4
mm处自向光侧和背光侧间均匀纵切 , 然后用ELISA
(enzyme linked immunosorbent assay)法测定两部位的生长
素含量 , 结果显示背光侧的比向光侧的生长素浓度高出
2~4 倍, 表明水稻根的负向光性是由于生长素在根尖内的
不均匀分布所致[15]。这与Haga等[16]在水稻胚芽鞘中两侧
第 8期 汪月霞等: cpt1基因与水稻根负向光性运动的关系 1561

IAA含量分析的结果一致。但在水稻cpt1基因缺失突变体
中, 未有这种不对称分布的情况。因此可以推测, 与NPH3
类似, CPT1 蛋白不仅是水稻胚芽鞘发生向光性弯曲过程
中IAA的重要载体, 可能也是在根中介导负向光性弯曲的
IAA的重要载体。
References
[1] Iino M. Phototropism in higher plants. In: Hader D, Lebert M,
eds. Photomovement: ESP Comprehensive Series in
Photosciences, Vol. 1, Amsterdam: Elsevier, 2001. pp 659–811
[2] Tokutomi S, Matsuoka D, Zikihara K. Molecular structure and
regulation of phototropin kinase by blue light. Biochim Biophys
Acta, 2008, 1784: 133–142
[3] Khurana J P, Poff K L. Mutants of Arabidopsis thaliana with
altered phototropism. Planta, 1989, 178: 400–406
[4] Liscum E, Briggs W R. Mutants of Arabidopsis in potential
transduction and response components of the phototropic
signaling pathway. Plant Physiol, 1996, 112: 291–296
[5] Kang B, Grancher N, Koyffmann V, Lardemer D, Burney S,
Ahmad M. Multiple interactions between cryptochrome and
phototropin blue-light signaling pathways in Arabidopsis
thaliana. Planta, 2008, 227: 1091–1099
[6] Motchoulski A, Liscum E. Arabidopsis NPH3: A NPH1
photoreceptor-interacting protein essential for phototropism.
Science, 1999, 286: 961–964
[7] Inoue S I, Kinoshita T, Matsumoto M, Nakayama K I, Doi M,
Shimazaki K. Blue light-induced autophosphorylation of
phototropin is a primary step for signaling. Proc Natl Acad Sci
USA, 2008, 105: 5626–5631
[8] Pedmale U V, Liscum E. Regulation of phototropic signaling in
Arabidopsis via phosphorylation state changes in the phototropin
1-interacting protein NPH3. J Biol Chem, 2007, 282: 19992–
20001
[9] Sakai T, Kagawa T, Kasahara M, Swartz T E, Christie J M,
Briggs W R, Wada M, Okada K. Arabidopsis nph1 and npl1: Blue
light receptors that mediate both phototropism and chloroplast
relocation. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98: 6969–6974
[10] Fankhauser C, Yeh K C, Lagarias J C, Zhang H, Elich T D, Chory
J. PKS1, a substrate phosphorylated by phytochrome that
modulates light signaling in Arabidopsis. Science, 1999, 284:
1539– 1541
[11] Lariguet P, Schepens I, Hodgson D, Pedmale U V, Trevisan M,
Kami C, de Carbonnel M, Alonso J M, Ecker J R, Liscum E,
Fankhauser C. Phytochrome kinase substrate 1 is a phototropin 1
binding protein required for phototropism. Proc Natl Acad Sci
USA, 2006, 103: 10134–10139
[12] Sakai T, Wada T, Ishiguro S, Okada K. RPT2: A signal transducer
of the phototropic response in Arabidopsis. Plant Cell, 2000, 12:
225–236
[13] Boccalandro H E, Simone S N D, Bergmann-Honsberger A,

Schepens I, Fankhauser C, Casal J J. PHYTOCHROME KINASE
DSUBSTRATE1 regulates root phototropism and gravitropism.
Plant Physiol, 2008, 146: 108–115
[14] Iino M. Mediation of tropisms by lateral translocation of
endogenous indole-3-acetic acid in maize coleoptiles. Plant Cell
Environ, 1991, 14: 279–286.
[15] Mo Y W, Wang Z, Qian S Q, Gu Y J. Effect of indoleacetic acid
(IAA) on the negative phototropism of rice root. Rice Sci, 2004,
11(3): 125–128
[16] Haga K, Takano M, Neumann R, Iino M. The rice COLEOPTILE
PHOTOTROPISM1 gene encoding an ortholog of Arabidopsis
NPH3 is required for phototropism of coleoptiles and lateral
translocation of auxin. Plant Cell, 2005, 17: 103–115
[17] Haga K, Iino M. Asymmetric distribution of auxin correlates with
gravitropism and phototropism but not with autostraightening
(autotropism) in pea epicotyls. J Exp Bot, 2006, 57: 837–847
[18] Harper R M, Stowe-Evans E L, Luesse D R, Muto H, Tatematsu
K, Watahiki M K, Yamamoto K, Liscum E. The NPH4 locus
encodes the auxin response factor ARF7, a conditional regulator
of differential growth in aerial Arabidopsis tissue. Plant Cell,
2000, 12: 757–770
[19] Tatematsu K, Kumagai S, Muto H, Sato A, Watahiki M K, Harper
R M, Liscum E, Yamamoto K T. MASSUGU2 encodes
Aux/IAA19, an auxin-regulated protein that functions together
with the transcriptional activator NPH4/ARF7 to regulate
differential growth responses of hypocotyl and formation of
lateral roots in Arabidopsis thaliana. Plant Cell, 2004, 16:
379–393
[20] Muday G K, Murphy A S. An emerging model of auxin transport
regulation. Plant Cell, 2002, 14: 293–299
[21] Geldner N, Friml J, Stierhof Y D, Jurgens G, Palme K. Auxin
transport inhibitors block PIN1 cycling and vesicle trafficking.
Nature, 2001, 413: 425–428
[22] Friml J, Wisniewska J, Benkova E, Mendgen K, Palme K. Lateral
relocation of Auxin efflux regulator PIN3 mediates tropism in
Arabidopsis. Nature, 2002, 415: 806–809
[23] Gu Y-J(顾蕴洁), Wang Z(王忠), Wang W-X(王维学). The
negative phototropism of rice root. Plant Physiol Commun (植物
生理学通讯), 2001, 37(5): 396–398 (in Chinese)
[24] Wang Z, Mo Y W, Qian S Q, Gu Y J. Negative phototropism of
rice root and its influencing factors. Sci China (Ser C), 2002,
45(5): 485–496
[25] Harada A, Shimazaki K. Phototropins and blue light-dependent
calcium signaling in higher plants. Photochem Photobiol, 2007,
83: 102–111
[26] Baum G, Long J C, Jenkins G I, Trewavas A J. Stimulation of the
blue light phototropic receptor NPH1 causes a transient increase
in cytosolic Ca2+. Proc Natl Acad Sci USA, 1999, 96: 13554–
13559
[27] Iino M, Neumann R. Phototropism of rice seedlings:
Characterization and mutant isolation. Plant Cell Physiol, 2000,
41(suppl): S56