全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(7): 12121218 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(30971788), 中国科学院所级领域前沿探索项目和山东省农业良种重大课题(鲁农良种字 2008-6)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 陈化榜, E-mail: hbchen@sdau.edu.cn, Tel: 0538-8249939
第一作者联系方式: E-mail: hhliu2005@163.com(刘怀华); liwen-wang163@163.com(王莉雯) ** 共同第一作者
Received(收稿日期): 2010-11-16; Accepted(接受日期): 2011-03-28.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.01212
玉米异交不亲和基因 Ga1-S的蛋白质组分析
刘怀华 王莉雯** 刘 旭 马 侠 宁丽华 张 华 崔德周
姜 川 陈化榜*
山东农业大学农学院 / 作物生物学国家重点实验室 / 山东省作物生物学重点实验室, 山东泰安 271018
摘 要: 为了研究玉米异交不亲和的蛋白表达机制, 以玉米(Zea mays L.)异交不亲和基因 Gal-S 的一对近等基因系
W22(GG)与 w22(gg)为材料, 组配自交(GG×GG)、正交(gg×GG)与反交(GG×gg) 3个组合。首先采用荧光显微技术, 观
察比较了 3 个组合中花粉管在花丝中的生长过程; 其次采用 IEF/SDS-PAGE 双向凝胶电泳与基质辅助激光解吸电离
飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术, 比较研究了授粉后 10 h自交与反交母本W22(GG)花丝蛋白质组的特异表达差
异。结果表明, 授粉后 10 h, 自交与正交花粉管伸长可达花丝基部, 而反交花丝基部未观察到花粉管; 自交与反交母
本 W22(GG)花丝蛋白质组共检测到 25个差异蛋白质点, 其中 15个在自交中特异表达, 10个在反交中特异表达。通
过MALDI-TOF-MS质谱测序和MASCOT序列分析, 注释了 12个蛋白质点, 其中自交中特异表达的蛋白质点 11、12、
14和异交中特异表达的蛋白质点 18、22、24可能与玉米异交不亲和密切相关。
关键词: 玉米; 异交不亲和; Ga1-S; 蛋白质组; 双向电泳; 质谱分析
Proteomic Analysis of Maize Cross Incompatibility Gene Ga1-S
LIU Huai-Hua, WANG Li-Wen**, LIU Xu, MA Xia, NING Li-Hua, ZHANG Hua, CUI De-Zhou, JIANG Chuan,
and CHEN Hua-Bang*
State Key Laboratory of Crop Biology / Shandong Key Laboratory of Crop Biology / Agronomy College, Shandong Agricultural University, Tai’an
271018, China
Abstract: The objective of this paper was to study the cross incompatibility gene Ga1-S in maize through proteomic approach.
Near isogonic lines of Ga1-S gene, W22 (GG) and w22 (gg), were used to make the crosses of GG×GG, gg×GG, and GG×gg.
First, we observed the growth process of pollen tubes grown into silks in three crosses by fluorescence microscopy; second, total
silk proteins were extracted from silks of the W22 (GG) at 10 h after pollination. Total proteins were extracted by TCA/Acetone,
separated by two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) and analyzed through MALDI-TOF-MS mass spectrometry. The results
indicated that pollen tube could not grow into silks base in the cross of GG×gg, but could reach the silk base in the other two
crosses. In the silk proteomes of GG×GG and GG×gg, there were 25 differentially expressed proteins, including 15 specifically
expressed in GG×GG, and 10 specifically expressed in GG×gg. Twelve of them were annotated in various databases by
MALDI-TOF-MS and MASCOT analyses. Proteins 11, 12, 14, 18, 22, and 24 presumably play important roles in the maize cross
incompatibility.
Keywords: Zea mays L.; Cross incompatibility; Ga1-S; Proteome; 2-DE; MALDI-TOF-MS
玉米(Zea mays L.)异交不亲和是玉米自交与正
交亲和, 而反交不亲和的一种雌雄配子互作现象。
1902 年 Correns 首次发现这一现象, 并将该基因座
命名为 Ga1 (Gametophyte factor 1, Ga1) [1]。几乎所
有的温热带玉米都是 ga1/ga1基因型, Ga1/Ga1基因
型只存在于爆裂玉米和极少数中美洲玉米中[2]。Ga1
基因座有 3 个等位基因(Ga1、Ga1-M 和 Ga1-S), 以
Ga1-S基因的异交不亲和性最强, 已被定位于第 4条
染色体的短臂 bin4.02内, 距端点 31.0+/5.0个交换
单位[3]。Ga1-S基因座为显性单一主效基因, 其控制
第 7期 刘怀华等: 玉米异交不亲和基因 Ga1-S的蛋白质组分析 1213


的异交不亲和性的遗传规律为, 隐性基因型(ga1)给
显性纯合基因型(Ga1-S/Ga1-S)母本授粉不能结实 ,
而显性基因型(Ga1-S)花粉给隐性纯合基因型(ga1/
ga1)母本授粉结实; 当显性基因型(Ga1-S)花粉和隐
性基因型(ga1)花粉混合给杂合基因型(Ga1-S/ga1)母
本授粉时 , 显性基因型 (Ga1-S)花粉对隐性基因型
(ga1)花粉具有显著的竞争优势[4-5]。2010 年 Lausser
等[6]的观察表明, ga1型花粉管在 Ga1Ga1型花丝中
的伸长严重受阻。Kermicle等[7]认为, ga1型花粉和
Ga1Ga1 型花柱的不亲和是由二者之间的不相容
(incongruity)造成的, 而不是 Ga1Ga1 型花柱对 ga1
花粉的主动排斥。目前关于 Ga1-S 基因异交不亲和
机制研究甚少, 本文通过荧光显微观察进一步揭示
了玉米异交不亲和过程中花粉管在花丝中的发育过
程, 并首次从蛋白质组学的角度初步研究了玉米异
交不亲和的蛋白表达机制及花粉管与花丝的互作过
程, 以期发现与 Ga1-S基因相关的候选基因。
1 材料与方法
1.1 植物材料
以玉米(Zea mays L.)异交不亲和基因 Ga1-S 的
近等基因系 W22(GG)与 w22(gg)组配自交 (GG×
GG)、正交(gg×GG)与反交(GG×gg) 3个组合。Ga1-S
近等基因系来源于(w22/Ga1-S)BC7, 2008年从 USDA-
ARS National Germplasm Collection引种, 除异交不
亲和的性状外, 其他表型基本一致。2009 年 5 月将
其种植于山东农业大学实验田, 至 7 月中旬开花期,
对相应植株套袋, 选择雌穗抽丝一致(花丝抽出苞叶
约 3 cm)的植株同时进行 3个组合的授粉。分别取自
交、正交和反交授粉后 0.15、0.5、1、2、5、10 和
20 h 共 7 个不同时间段果穗中上部的全长花丝, 每
个处理 5 个雌穗, 每个雌穗取约 10 根花丝用 FAA
固定液保存用于花粉管观察, 将其余露出苞叶的花
丝放入蒸馏水, 用细毛刷不断梳理, 快速漂洗 3 次,
以去除绝大部分花粉, 除去多余水分以后液氮速冻,
80℃冰箱储存, 用于蛋白提取。每个处理取样设 3
次重复。
1.2 药品与试剂
凝胶组分、硫脲、碘乙酰胺、苯胺蓝、DTT、
Tris、CHAPS、甘氨酸均为 Amresco公司产品; 尿素、
考马斯亮蓝(CBB G-250)、载体两性电解质、固相线
性 pH梯度 IPG胶条(24 cm, pH 4~7)购于美国 USB
公司; 甘油、蛋白纯化试剂盒(2-DE Clean Kit)购自
美国 GE Healthcare 公司; 三氟乙酸(TFA)、胰蛋白
酶、α 氨基-4-羟基肉桂酸为 Roche 公司产品; 其他
为国产分析纯试剂; Bradford 蛋白浓度定量试剂盒
购自上海生工生物工程有限公司。
1.3 玉米花粉管观察
荧光显微镜观察参照 Kho和 Baer的方法[8]。将
固定的饱和授粉的花丝, 用 8 mol L1 NaOH软化和
透明 2 h, 水洗后以 0.1%苯胺蓝(0.1 mol L1 K3PO4
溶液配制)染色 12 h, 压片后在 Olympus Bx61荧光
显微镜下(U激发)观察、摄影。
1.4 蛋白质提取、纯化与定量
采用三氯乙酸-丙酮法提取授粉后 10 h 自交与
反交中的母本 W22(GG)花丝总蛋白质, 称取等量不
同处理的玉米花丝, 反复研磨至精细的粉末, 将研
好的样品悬浮于预冷的丙酮溶液(含有 0.07%巯基乙
醇和 10%三氯乙酸), 20℃放置 1 h。离心弃上清液,
用丙酮对沉淀进行 2 次悬浮并离心。弃上清液, 于
通风橱干燥后进行 1 h 裂解; 超速离心取上清蛋白
溶解液。利用 2-DE Clean Kit 纯化蛋白质。利用
Bradford蛋白浓度定量试剂盒进行蛋白质定量。
1.5 双向电泳(2-DE)
参照 Amersham Biosciences公司的双向电泳系
统使用说明书[9], 第一向等电聚焦采用 IPG 固相胶
条(pH 4~7, 24 cm), 仪器运行条件为 20℃, 30 V 6 h、
60 V 6 h、500 V 1 h、1 000 V 1 h、8 000 V 8.5 h和
500V 0.5 h。将聚焦后的 IPG胶条在平衡液 I与平衡
液 II中先后平衡 15 min, 转移到 10% SDS-PAGE凝
胶顶端, 利用 Ettan Dalt six (GE Healthcare, USA)系
统进行第二向 SDS-PAGE电泳, 功率参数为 2 W/胶
0.5 h和 17 W/胶约 10 h。以考马斯亮蓝(CBB G-250)
染色 24 h。
1.6 凝胶图谱分析
使用 Bio-Rad GS710 扫描仪扫描考马斯亮蓝染
色后的凝胶, 分辨率为 300 dpi, 并用 Imagemaster
2D Platinum Software Version 5.0 (GE Healthcare)图
像分析软件对双向电泳结果进行分析, 其后挖取特
异蛋白质点。
1.7 质谱鉴定与匹配搜索
将 25 个差异表达的蛋白质点进行脱色和胶上原
位消化、酶解; 将酶解后的肽混合物委托北京华大
中生科技发展有限公司进行基质辅助激光解吸 /电
离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析, 其中 19 个
蛋白点获得肽质量指纹图, 运用软件MASCOT (http://
1214 作 物 学 报 第 37卷

www.matrixscience.com/)选择 NCBI 数据库进行 PMF
分析获得鉴定结果。鉴定条件是: (i) MOWSE分值高
于 70分; (ii)至少有 4个不同肽段与已知蛋白的肽段
匹配; (iii)匹配肽段的覆盖率高于 15%。
2 结果与分析
2.1 玉米异交不亲和过程中花粉管在花丝中的
发育过程
如表 1 所示, 授粉 10 h 后, 自交、正交与反交
组合的花粉管生长状态出现显著差异, 前两者正常,
有 40%左右的花粉管到达花丝基部; 而后者花粉管
生长缓慢, 没有花粉管到达花丝基部; 授粉 20 h后,
反交组合的花粉管开始部分降解, 仍没有花粉管进
入花丝基部(图 1); 调查表明, 只有反交组合没有籽
粒, 另两者结实正常。其余 0.15、0.5、1、2、5 h各
时期 3个组合中的花粉管发育情况基本一致, 花粉均
能在柱头上萌发, 2 h后均有约 60%的花粉管进入花
柱, 5 h后均有约 90%的花粉管在花柱中伸长。
2.2 玉米花丝双向电泳图像与特异表达差异分析
采用三氯乙酸-丙酮法分别提取授粉后 10 h 的
自交与反交组合中的母本W22(GG)花丝总蛋白质 ,
定量后进行双向电泳分析, 经考马斯亮蓝 G-250 染
色后, 得到分辨率和重复性均较好的 2-DE 图谱(图
2)。用 Imagemaster 2D Platinum Software Version 5.0
软件对 2个处理的图谱进行比较分析, 在等电点 4.0~
7.0, 分子质量 9.0~100.0 kD 范围内, 可分别鉴定出
平均 784 个与 812 个清晰的蛋白质点。2 个处理的
蛋白质点图谱匹配率为 92%, 且蛋白质点集中在 pH
5.0~6.5、分子质量 15.0~94.0 kD 的范围内, 两处理
间表达的蛋白质数量和种类大致相同, 仅有少量蛋
白质发生变化, 可用于差异分析。
用 Imagemaster 2D Platinum软件对蛋白质点进
行分析, 共获得 25个特异表达的差异蛋白质点(图 3
箭头所示)。其中 15 个蛋白质点在自交中特异表达,
10个蛋白质点在反交中特异表达; 通过MALDI-TOF-
MS质谱测序, 在 25个蛋白质点中测出 19个, 而后进

表 1 花粉在玉米柱头上的萌发及其花粉管的生长
Table 1 Pollen germination on the stigma and pollen tube elongation (%)
花粉管到达位置百分率 Percent pollen tubes entering 组合
Cross
授粉时间
Hours after pollination
花粉萌发率
Percentage of pollen
germination
羽状柱头
Pinnate stigma
花柱
Style
花柱基部
Base of style
0.15 h 29 21 0 0
0.5 h 71 42 0 0
1 h 88 50 38 0
2 h 94 28 66 0
5 h — 7 93 0
10 h — — 56 44
自交
GG×GG
20 h — — 44 56

0.15 h 28 19 0 0
0.5 h 73 40 0 0
1 h 87 51 36 0
2 h 92 30 62 0
5 h — 8 92 0
10 h — — 100 0
反交
GG×gg
20 h — — — 0

0.15 h 25 22 0 0
0.5 h 76 41 0 0
1 h 84 53 31 0
2 h 93 29 64 0
5 h — 9 91 0
10 h — — 58 42
正交
gg×GG
20 h — — 46 54

第 7期 刘怀华等: 玉米异交不亲和基因 Ga1-S的蛋白质组分析 1215




图 1 授粉 20 h后的花丝基部
Fig. 1 Silks base at 20 h after pollination
左: 正交, 花粉管如箭头所示; 右: 反交, 无花粉管
(放大倍数: 4×10)。
Left: gg×GG , pollen tubes indicated by arrows; Right: GG×gg, no
pollen tubes were observed. (magnification: 4×10)



图 2 授粉后 10 h自交与反交母本 W22(GG)花丝总蛋白双向
电泳图谱
Fig. 2 2-D silk protein profiles at 10 h after pollination in
crosses of GG × GG and GG×gg

行 MASCOT 序列分析, 其中有 12 个点鉴定出蛋白
质(表 2), 而对于其他的 7个点由于得分不够未能鉴


图 3 部分蛋白质点的放大图
Fig. 3 Enlargements of silk protein spots
左: 自交; 右: 反交。
Left: at 10 h after pollination in cross of GG×GG ; Right: at 10 h after
pollination in cross of GG×gg.

定出有意义的结果。结合双向凝胶电泳相应点的等
电点和分子量(两者大小差异<20%)、匹配肽段的多
少及得分进行综合分析, 确定候选蛋白质点, 分别
为自交中特异表达的蛋白质点 11、点 12与点 14; 异
交中特异表达的蛋白质点 18、点 22与点 24。
3 讨论
3.1 玉米异交不亲和过程中花粉管在花丝中伸
长受阻
花粉与亲和柱头的表皮细胞外基质结合后, 花
粉粒萌发穿透柱头, 在花柱传导管中接受其引导、
营养而快速伸长, 并最终在雌配子体引导下通过珠
孔并与之结合[10-11]。段桃利等[12]将花粉与花柱的互
1216 作 物 学 报 第 37卷

表 2 分别用 GG型花粉与 gg型花粉授粉后 10 h的 W22(GG)花丝差异蛋白点的质谱鉴定结果
Table 2 Differentially expressed proteins from W22(GG) silks at 10 h after pollination by GG and gg pollens predicated by
MALDI-TOF-MS
斑点号
Spot No.
登录号
Accession No.
鉴定蛋白质
Protein identification
得分
Score
匹配肽段,
覆盖率
PC, SC%
预测, 胶分子量
Mw predicted, gel
(kD)
预测, 胶等电点
pI predicted, gel
特异性
Specificity
11 a gi|219362973 Plant SGNH lipase 141 12, 43% 36.8, 41.6 6.29, 5.48 GG
12 a gi|194698766 Unknown protein 112 11, 32% 46.3, 45.2 6.42, 5.56 GG
14 a gi|226493041 hypothetical protein LOC100283878 135 16, 51% 41.9, 46.1 5.30, 5.45 GG
18 a gi|226494255 hypothetical protein LOC100277913 154 14, 58% 41.4, 44.5 5.23, 5.62 gg
22 a gi|223942857 Unknown protein 79 8, 42% 20.5, 24.4 6.28, 6.55 gg
24 a gi|226503501 hypothetical protein LOC100273396 102 13, 36% 41.9, 47.6 5.11, 5.23 gg
2 gi|284807026 Nuclear matrix constituent protein 2 84 23, 26% 109.0, 44.2 5.19, 6.37 GG
8 gi|228016670 Hypothetical chloroplast protein 76 19, 9% 244.0, 27.4 9.18, 5.85 GG
10 gi|34849893 At4g05190 76 18, 22% 89.8, 28.7 6.52, 5.81 GG
13 gi|24421095 Receptor-like protein kinase 75 8, 15% 71.1, 45.5 9.21, 5.20 GG
16 gi|242060634 hypothetical protein SOR_04g004520 96 17, 41% 50.7, 26.7 4.73, 5.09 gg
19 gi|110738694 Hypothetical protein 75 8, 16% 77.4, 26.7 9.53, 5.29 gg
a 候选蛋白。a Candidate protein.

作分为 4个阶段进行荧光显微镜观察, 一是花粉在柱
头上的萌发, 二是花粉管进入花柱, 三是花粉管在
花柱中的伸长, 四是花粉管进入胚囊。本文自交与
正交观察结果与段桃利等的研究结果大致相同, 略
有偏差可能是品种间差异所致。2010年 Lausser等[6]
的研究表明每个阶段都可能发生花粉与花柱的不亲
和现象: 一是花粉与柱头不能相互识别而不能进入
花柱, 二是花粉管不能进入花柱传导管而无方向地
生长(transmitting tract mistargeting), 三是花粉管不
能获得足够营养而伸长停滞 (insufficient growth
support), 四是花粉管不能被雌配子引导穿过珠孔。
本文的研究表明 ga1 型花粉管在 Ga1Ga1 型花柱中
的伸长受阻, 并且进一步确定了玉米 Ga1-S 基因异
交不亲和发生的时间段是授粉后 5~10 h, ga1型花粉
管能够在 Ga1Ga1型花柱传导管中伸长, 但 5 h后与
对照相比伸长速率减缓, 10 h后与对照差异显著, 20
h 后开始部分降解。本文显微观察的结果与 Lausser
等 [6]所述的第三类不亲和现象相似, 而其机制可能
不同; 玉米Ga1-S基因异交不亲和的机理可能是 ga1
型花粉和 Ga1Ga1型花柱的不相容(incongruity)[7]。
依据观察结果选取了授粉后 10 h为花丝蛋白取
样时间点。因为控制时间变量, 只进行基因型的单
因素分析有一定的针对性和典型性, 避免了由时间
变化而带来的差异。
3.2 玉米异交不亲和候选蛋白点的功能分析
目前对于植物雌雄配子互作的研究主要集中于
自交不亲和机制, 而对于异交不亲和机制的研究甚
少, 对其蛋白质组学的分析未见报道。植物雌雄互
作过程中蛋白质的互作具有时空性和可调节性。玉
米异交不亲和过程中所涉及的蛋白质变化是动态的,
运用蛋白质组学对这一过程进行分析, 对了解异交
不亲和发生的原因及花粉管与花丝的互作过程具有
重要作用[13]。
通过MASCOT序列分析, 结合双向凝胶电泳相
应点的等电点和分子量(两者大小差异<20%), 鉴定
出 6个候选蛋白(表 2前 6个蛋白点), 它们大部分为
未发现的新蛋白质, 序列信息的功能注释表明, 候
选蛋白点 11可能为植物 SGNH脂酶, 其他 5个蛋白
为假定蛋白, 可能与玉米异交不亲和有关, 但其功
能有待进一步的注释。
候选蛋白 11, 功能注释为玉米的 SGNH 脂酶,
序列注释表明该蛋白第 33至 341个蛋白残基编码植
物 SGNH 脂酶的活性区域(plant SGNH lipase like
domain) [14]。该脂酶氨基端信号肽序列有别于其他定
位于细胞外的脂酶[15-16]。已有研究表明 SGNH脂酶
的反应底物很多, 如复合多糖、磷脂、酰基辅酶 A
酯等[17-19]; 2010 年 Reina 等[20]研究表明脂酶 Aga-
SGNH参与细胞壁的角质化过程; 2009 年 Updegraff
等[21]研究表明拟南芥中的细胞外脂酶 EXL4 参与花
粉水化过程; 在水稻中, 脂酶 EXTRA GLUME1 调
节小穗的发育[22]; Arif 等[23]的研究表明 SGNH 脂酶
能够降解细胞壁多糖促进细胞的生长与伸长。综上,
第 7期 刘怀华等: 玉米异交不亲和基因 Ga1-S的蛋白质组分析 1217


自交中特异表达的候选蛋白 11可能参与花粉管在花
丝中的伸长, 而异交中可能由于这一蛋白的缺失而
导致花粉管伸长停滞。
本试验中对一种基因型花丝(GG)的两种处理 ,
即自交与异交, 进行蛋白差异分析保证了单因素分
析。为防止花粉背景蛋白的干扰, 本试验采用了近
等基因系, 并且在取样时采取了去除花粉的措施。
本试验中自交与反交两处理平均有 784 个与 812 个
蛋白点被检出, 蛋白质 2-DE 图谱有较高的分辨率,
说明所采用的 2-DE分离方法比较合适。点 2、点 8、
点 10、点 13、点 16和点 19由于其理论等电点和分
子量与实际表观等电点和分子量差距较大, 对其未
做进一步的研究。此外有其余 13个差异蛋白点未能
得到鉴定, 可能与其蛋白表达丰度低, 酶解不充分
有关, 或蛋白质数据库不完整影响了其成功鉴定。对
这些蛋白的鉴定和功能分析有待进一步深入研究。
4 结论
玉米 Ga1-S 基因异交不亲和过程中, 隐性基因
型花粉(ga1)在显性基因型花丝(Ga1-S)中伸长受阻
而不能到达花丝基部, 从而不能结实。自交与反交
中母本 W22(GG)花丝蛋白质组共检测出 25个差异
蛋白质点, 其中 15 个蛋白质点在自交中特异表达, 10
个蛋白质点在反交中特异表达; 自交中特异表达的
蛋白质点 11、点 12、点 14 和异交中特异表达的蛋
白质点 18、点 22、点 24 可能与玉米异交不亲和密
切相关。

致谢: 本文获得山东农业大学作物生物学重点实验
室张宪省教授的技术支持与指导, 在此表示感谢。
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