全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(9): 1551−1558 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家转基因生物新品种培育科技重大专项(2008ZX08005-004)和国家“十一五”科技支撑计划项目(2006BAD13B04-1)资助。
∗ 通讯作者(Corresponding author): 叶武威, E-mail: yeww@cricaas.com.cn
第一作者联系方式: E-mail: zqkai888@163.com
Received(收稿日期): 2011-02-28; Accepted(接受日期): 2011-05-20; Published online(网络出版日期): 2011-06-28.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20110628.1007.006.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.01551
陆地棉质体转录活性因子基因 GhPTAC的克隆及其耐盐性分析
周 凯 叶武威* 王俊娟 王德龙 樊保香 王 帅
中国农业科学院棉花研究所 / 棉花生物学国家重点实验室 / 农业部棉花遗传改良重点实验室, 河南安阳 455000
摘 要: 为了挖掘新的耐盐基因及调控途径, 利用基因芯片技术及抑制性差减文库技术筛选到质体转录活性因子,
通过 RACE及 RT-PCR技术克隆到该基因的 cDNA全长, 命名为 GhPTAC。该 cDNA全长 1 564 bp, 其中 ORF 1 038 bp,
推测编码 345个氨基酸残基的多肽。生物信息学分析表明 GhPTAC为拟南芥 PTAC13同源基因, 同源性 60.6%。编码
蛋白为转录活跃的染色体(TAC)的一个组分, 参与叶绿体基因组转录终止/抗终止调节。real-time PCR分析结果表明,
GhPTAC受盐胁迫诱导上调表达, 在耐盐材料中 9806中表达水平明显高于盐敏感材料中 S9612, 这与芯片结果一致。
关键词: 陆地棉; 盐胁迫; PTAC; real-time PCR
Cloning and Salt-tolerance Analysis of Gene Plastid Transcriptionally Active
(GhPTAC) from Gossypium hirsutum L.
ZHOU Kai, YE Wu-Wei*, WANG Jun-Juan, WANG De-Long, FAN Bao-Xiang, and WANG Shuai
Cotton Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Science / State Key Laboratory of Cotton Biology / Key Laboratory of Cotton Genetic
Improvement of Agriculture Ministry, Anyang 455000, China
Abstract: To develop novel salt-tolerance genes and adjustment pathway, we screened out gene Plastid Transcriptionally Active
named as GhPTAC based on salt-tolerance gene chips and salt resistance related SSH library. The result of RACE and RT-PCR
showed that the cDNA full length was 1 564 bp, and ORF was 1 038 bp, which encoded 345 amino acid residues. Bioinformatics
analysis showed that GhPTAC shared the identity of 60.6% with the homologous gene PTAC13 from Arabidopsis thaliana. As one
part of Transcriptionally active chromosome (TAC), GhPTAC plays a part role in regulation of transcription termination/
antitermination of chloroplastid genome. The GhPTAC expression was up-regulated under salt stress induction and the expression
level of GhPTAC of Zhong 9806 (salt-resistant material) was obviously higher than that Zhong S9612 (salt-sensitive material)
which was measured by real-time PCR and in accord with the arrays results.
Keywords: Gossypium hirsutum; Salt stress; PTAC; real-time PCR
土地盐碱化已成为一个世界关注的焦点问题 ,
解决该问题已迫在眉睫。我国自 20 世纪 70 年代以
来, 展开了全面治理工作, 已积累了许多宝贵经验,
研究人员认为在轻度或部分中度盐碱地上种植比较
耐盐的作物, 如棉花、苜蓿、高粱、枣树和刺槐等, 是
一种简便、快捷、经济有效的改良措施。对作物耐
盐机理的研究近年来也有较大进展, 许多学者提出了
不少假说, 如膜伤害学说、蛋白代谢干扰学说、原始
伤害和次生伤害学说和脉内再循环学说等等[1]。
棉花作为重要的耐盐作物 , 其耐盐性及分子
机制已有不少的研究。在大田耐盐鉴定方面, 普遍
认为土壤含盐 0.2%以下有利于棉花出苗、生长、
提高产量和品质 , 如大于 0.3%时就会对棉花产生
危害[2], 叶武威等[3]通过多年盐池鉴定制定了 0.4%
盐胁迫的耐盐性鉴定标准。在生理方面, 盐胁迫主
要通过造成生理干旱和离子毒害来影响植株的正
常生长 , 按伤害的先后分为原初盐害和次生盐
害 [4]。一方面盐害干扰正常的生理代谢, 使光合作
1552 作 物 学 报 第 37卷
用降低、呼吸作用加强、降低蛋白质合成、氮素代
谢异常等 , 导致产生氮毒害 ; 另一方面导致 DNA
复制和 RNA 转录作用的丧失, 造成聚合酶活性丧
失, 限制了植物必需蛋白的合成[5-7]。因此, 为了促
使植株在盐胁迫下能够正常生长首先就要保证各
类必要基因稳定的转录、翻译和修饰, 进而保持各
类细胞器及组织功能的完整性 , 为维持正常的生
理代谢奠定基础。
在耐盐基因及其作用机理方面的研究, 目前主
要从信号转导、转录调控、渗透调节和活性氧清除
等方面展开[5-7]。其中, 转录因子类基因能同时调控
多个耐盐途径, 被认为是最具潜力的一类基因。目
前在棉花上已克隆的该类耐盐相关基因包括类锌指
蛋白基因CSTZ[8], CCCH类锌指蛋白基因GhZFP1[9],
DRE-biding转录因子基因GhDBP2[10]和GhDBP3[11],
乙 烯 反 应 元 件 结 合 蛋 白 基 因 GhEREB2 和
GhEREB3[12], 乙烯反应因子基因 GhERF1[13]和
GhERF4[14]等。但是, 对该类基因的研究还不完善,
与棉花耐盐性的关系的研究尚未见报道。
叶绿体基因组的正常表达是叶绿体行使功能的
基础, 而叶绿体基因组的转录是至少受两种活性类
型的RNA聚合酶调节的, 一种是由叶绿体基因编码
的可溶性 RNA 聚合酶(PEP), 另一种是由核基因编
码的叶绿体 RNA 聚合酶(NEP)。同叶绿体 DNA 紧
密结合的由多个多聚体蛋白复合体组成的蛋白薄膜,
称为转录活跃的染色体(transcriptionally active chro-
mosome), 简称 TAC。Jeannette Pfalz等从拟南芥和
芥菜中纯化到该蛋白复合体 , 共分离了 35个组分,
对其中 3个组分 PTAC2, PTAC6和 PTAC12进行了
研究, 结果表明它们与质体基因表达有关, 可能参
与转录后加工[15]。而质体转录活性因子基因作为调
节叶绿体等质体基因组转录的重要基因, 成为研究
叶绿体相关耐盐机理的一个很好的切入点。在本研
究中, 将以耐盐陆地棉为材料, 克隆质体转录活性
因子基因和初步分析其耐盐性表达, 为后期该基因
的功能验证奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料及处理
以陆地棉耐盐材料中 9806 和盐敏感材料中
S9612为试验材料, 其中, 中 9806由中棉所 23与耐
盐材料中 07 杂交后, 盐池多代高压选择育成, 0.4%
盐胁迫下相对成活苗率为 73.4%; 中 S9612 由中棉
所 12后代的不耐盐突变株多代纯化而来, 0.4%盐胁
迫下相对成活苗率为 12.8%。两材料均由中国农业
科学院棉花研究所育成, 耐盐性经多年盐池鉴定。
采用沙培育苗, 在三叶一心期以干沙重 0.4%的
NaCl充分溶解后浇灌材料。分别采集盐处理 0、1、
3、6、12、24和 168 h的叶片, 以盐处理 0 h为对照
(CK)。液氮速冻, 存于–70℃。
1.2 RNA提取
采用改良的 CTAB 法[16-17], 提取不同盐处理的
叶片 RNA。
1.3 耐盐基因的筛选
根据耐盐性寡核苷酸芯片初步分析结果[18], 在
芯片数据库中挑取在耐盐材料中 9806 中表达量受
盐胁迫后显著上调(ratio≥2.0), 而在盐敏感材料中
S9612 中表达量显著下调(ratio≤0.5)或者表达量无
明显变化(0.5
花耐盐性抑制消减文库的分析[19], 从文库中查找同
源 EST序列, 进一步选定耐盐相关基因。
1.4 GhPTAC基因的克隆
根据耐盐性抑制消减文库中搜索的 EST 序列,
设计 3-RACE特异引物 GSP1 (5-CTTGATAACTTG
GCTCACTTGGGTCCTC-3)和 5-RACE 特异引物
GSP2 (5-CCTTGCTGTTCCTCCTGAAATGCTTG-3),
以盐处理材料中 9806的 cDNA为模板, 按 Clontech
公司的 SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit试
剂盒说明书进行 RACE扩增。扩增程序为 94 30 s, ℃
72 2 min℃ , 5个循环; 94 30 s, 70 30 s, 72 2 ℃ ℃ ℃
min, 5个循环; 94 30 s, 68 30 s, 72 2 min℃ ℃ ℃ , 25个
循环。回收扩增片段, 并连接到 PGEM-Teasy 载体,
转化大肠杆菌感受态细胞 DH5α, 经上海英骏生物
技术有限公司测序获得基因的 3和 5-cDNA 序列,
用 Seqman 软件拼接获得 cDNA 全长。根据拼接序
列设计长距离 PCR 5端引物 GhPTACF1 (5-GGGTC
GAAGAAATCTTCAAG-3)和 3端引物 GhPTACR1
(5-GCAAGCAACGATGAGGTG-3), 扩增包含完整
ORF的 cDNA。采用 TaKaRa公司的 Ex Taq酶扩增
基因全长, 按说明书设置 PCR程序。将扩增产物回
收纯化, 连接到 PGEM-Teasy 载体, 转化大肠杆菌
感受态细胞 DH5α, 测序得基因 cDNA全长序列。本
实验引物由上海英骏生物技术有限公司合成, 大肠
杆菌 DH5α感受态购自天根生化科技有限公司。
第 9期 周 凯等: 陆地棉质体转录活性因子基因 GhPTAC的克隆及其耐盐性分析 1553
1.5 分析 GhPTAC基因表达特点
为了解GhPTAC基因在耐盐材料中 9806和盐敏
感材料中 S9612中的表达差异, 以盐处理 0 h的三叶
期的叶片为对照, 采用盐处理 1、3、6、12、24 和
168 h 的叶片, 利用 Real-time 技术对该基因进行了
荧光表达分析。
采用 Roche LightCycler 480 PCR仪及 promega
的 GoTaq qPCR Master Mix, 按照分析仪及试剂盒
操作说明进行。实验共设 3个重复, 利用 2–ΔΔCt法计
算目的基因的相对表达量。为介绍 2–ΔΔCt 法的计算
方法, 假设检测 A 基因在某因子干预下的表达, 得
到一组数据见表 1。
表 1 目的基因和内参基因的 Ct值
Table 1 Ct values of target gene and reference gene
处理
Treatment
目的基因
Target gene
内参基因
Reference gene
干预前 Untreated A B
干预后 Treated E F
则 A基因在待测样本中的表达量与在校准样本
中表达量的比值 2–ΔΔCt = 2–[(E–F)–(A–B)], 以此表
示待测基因的相对表达水平。
本实验以棉花看家基因 Histone 3 为内参基因,
上游引物 HF 为 5′-TCAAGACTGATTTGCGTTTC
CA-3′, 下游引物 HR为 5′-GCGCAAAGGTTGGTGT
CTTC-3′。
扩增 GhPTAC 基因的荧光引物, 上游引物 YF 为
5′-TTCCGTCAACCAAACACACTCCGC-3′, 下 游 引
物 YR 为 5′-TGCTGCAGTTGGACTTGCGTGT-3′, 该
对引物扩增 GhPTAC基因 cDNA的 115~196 bp区域。
2 结果与分析
2.1 耐盐相关基因的筛选
通过耐盐性寡核苷酸芯片分析, 筛选到一个新
的耐盐相关转录调节基因。通过 NCBI 数据库搜索
推测为拟南芥质体转录活性因子 PTAC13 (plastid
transcriptionally active 13)的同源基因。以未处理的
棉花材料为对照, 在盐处理后, 该基因在中 9806 中
表达量显著上调(ratio=3.9747 > 2.0), 在中 S9612中
表达量基本没有变化(0.5 < ratio=1.8913 < 2.0)(图
1)。利用耐盐性抑制消减文库查找同源 EST序列(图
2), 设计引物并进行基因克隆和相关分析。
图 1 PTAC基因在棉花耐盐基因芯片中表达的 ratio值
Fig. 1 ratio of PTAC in cotton salt-tolerance gene chips
图 2 耐盐性抑制消减文库(SSH)中筛选的 EST序列
Fig. 2 EST selected from salt-tolerance SSH Library
下画波浪线部分为 3-RACE特异引物 GSP1位置; 下画直线部分为 5-RACE特异引物 GSP2位置。
Wave-underlined part is GSP1 location; linear underline part is GSP2.
2.2 GhPTAC基因的克隆
按照 SMARTer RACE cDNA Amplification Kit
说明操作 , 扩增出质体转录活性因子的 3′端(1 226
bp)和 5 ′端 (760 bp)片段 (图 3), 测序获得 5′-RACE
1554 作 物 学 报 第 37卷
PCR 产物序列(图 4)和 3′-RACE PCR 产物序列(图
5)。经 NCBI Blast比对结果表明其为质体转录活性
因子基因的 3′端和 5′端片段。依据 3′端和 5′端末端
设计长距离 PCR引物 GhPTACF1和 GhPTACR1, 以
5′-RACE-Ready cDNA 为模板, 扩增包括完整 ORF
的 cDNA序列 1 209 bp (图 3)。通过 TA克隆, 测序
获得该基因的 cDNA 全长 , 并将该基因命名为
GhPTAC。
图 3 质体转录活性因子基因 GhPTAC的克隆
Fig. 3 Cloning of plastid transcriptionally active gene
1: 3′-RACE PCR产物; 2: 5′-RACE PCR产物; 3: 长距离 PCR产
物; M: marker DL5000。
1: 3′-RACE PCR product; 2: 5′-RACE PCR product; 3: long dis-
tance PCR product; M: marker DL5000.
2.3 生物信息学分析
陆地棉质体转录活性因子 cDNA全长 1 564 bp
(图 6), 5′-UTR 41 bp, 3′-UTR 485 bp, ORF 1 038 bp,
编码 345 个氨基酸残基的多肽链, 利用在线服务软
件(http://us.expasy.org/tools/pi_tool.html)推测其编码
蛋白的理论分子量为 39.13 kD, 等电点为 9.76。
利用 BlastP 搜索 GhPTAC蛋白同源序列, 通过
Needle (v6.0.1)序列比对发现, 陆地棉 GhPTAC蛋白
与其他物种中该蛋白的同一性为: 葡萄(Vitis vinif-
era: XP_002276763.1) 69.5%, 杨树(Populus tricho-
carpa: XP_002308199.1) 66.7%, 拟南芥(Arabidopsis
lyrata subsp. Lyrata: XP_002884721.1) 60.6%。其中
拟南芥中被命名为 PTAC13, 初步研究为质体转录
活性因子。通过 ClustalX 进行序列比对找出该蛋白
的保守序列如图所示 (图 7)。通过 ClustalX 和
TreeView软件, 与 13个物种同源蛋白共同构建进化
树(图 8)表明, 该蛋白与葡萄中同源蛋白亲缘关系最
近, 而与小立碗藓(Physcomitrella patens subsp. Pat-
ens: XP_001768244.1)、卷柏 (Selaginella moellen-
dorffii: XP_002988471.1)、金矿菌(Candidatus desul-
forudis audaxviator: YP_001716403.1) 、 嗜 热 菌
(Thermomicrobium roseum: YP_002521914.1)亲缘关
系较远。
通过 TargetP 1.1 分析, 预测 PTAC 定位在叶绿
体。同时, Jeannette Pfalz等在拟南芥叶绿体中分离
到其同源基因编码的蛋白。通过 TopPred软件分析,
该蛋白 N 端有跨膜区域。SMART 分析蛋白结构域
发现在 107~223氨基酸为 NGN结构域, 它是抗终止
蛋白 NusG 的特征结构域 [20]; 289~316 氨基酸为
KOW 结构域, 它曾在多种核糖体蛋白和细菌转录
终止蛋白 NusG中被发现[21]。
2.4 real-time PCR分析
检测表明, 陆地棉质体转录活性因子在盐胁迫
图 4 5′-RACE PCR产物序列
Fig. 4 Sequence of 5′-RACE PCR product
下画直线部分为 5′-RACE PCR引物 GSP2位置; 下画波浪线部分为长距离 PCR上游引物 GhPTACF1的位置。
Linear underline part is GSP2; wave-underlined part is GhPTACF1.
第 9期 周 凯等: 陆地棉质体转录活性因子基因 GhPTAC的克隆及其耐盐性分析 1555
图 5 3′-RACE PCR产物序列
Fig. 5 Sequence of 3′-RACE PCR product
下画直线部分为 3-RACE特异引物 GSP1位置; 下画波浪线部分为长距离 PCR下游引物 GhPTACR1。
Linear underline part is GSP1; wave-underlined part is GhPTACR1.
图 6 陆地棉 GhPTAC基因 cDNA序列
Fig. 6 cDNA of GhPTAC gene from Gossypium hirsutum L.
下画直线部分为完整 ORF。Total ORF is underlined.
1556 作 物 学 报 第 37卷
图 7 推定的陆地棉质体转录活性因子(GhPTAC)氨基酸序列与其他物种的氨基酸序列多重比对结果
Fig. 7 Alignment of the deduced amino acid sequence of GhPTAC and those from other species
一致性序列用黑色表示, 相似性序列用灰色表示。
Identical residues are shaded in black and similar residues in grey.
图 8 陆地棉质体转录活性因子蛋白(GhPTAC)序列与其他物种同源序列的进化树分析
Fig. 8 Phylogenetic tree of GhPTAC from G. hirsutum L. and other spices
下的表达情况稳定(图 9)。在盐胁迫条件下, 耐盐材
料中 9806和盐敏感材料中 S9612中GhPTAC基因的
表达趋势基本一致。在盐处理 1 h 时表达量显著上
调(0.01
对照的水平。而且, 整体上, 耐盐材料中 9806 中该
基因表达水平显著高于盐敏感材料中 S9612 (0.01<
P<0.05)。由此, 认为陆地棉 GhPTAC 基因是受盐胁
迫诱导表达的, 其表达水平与陆地棉的耐盐能力呈
图 9 质体转录活性因子的相对表达量
Fig. 9 Relative expression of GhPTAC gene
正相关。
3 讨论
在盐胁迫处理下, 叶绿体结构和功能受到破坏,
致使细胞色素含量、类胡萝卜素含量、净光合速率
下降, 从而作物自身所需有机物合成受阻, 叶片变
小, 枯萎甚至死亡。因此, 要提高作物耐盐性, 就要
保持稳定的新陈代谢, 而叶绿体作为光合作用、淀
粉代谢、亚硝酸盐和硫酸盐还原、四吡咯化合物代
谢、萜类和酚类化合物代谢的重要场所[22], 在耐逆
生理中起着重要作用。叶绿体作为半自主性细胞器,
其自身基因组的表达也显得至关重要。而 TAC蛋白
复合体则涉及到叶绿体代谢各个方面, 我们通过分
析推测 GhPTAC 基因编码蛋白属于 TAC 组分之一,
是调控叶绿体基因组表达的转录因子 , 通过
SAMRT分析, GhPTAC蛋白含有 NGN和 KOW结构
域, 两者都是转录抗终止蛋白 NusG的重要结构域。
因此, 我们认为 GhPTAC 蛋白具有与 NusG 相似的
功能。而 NusG是转录延伸复合体的重要组分, 可以
第 9期 周 凯等: 陆地棉质体转录活性因子基因 GhPTAC的克隆及其耐盐性分析 1557
通过与终止因子 ρ 互作来调节转录的终止和抗终
止[23-24]。
real-time PCR 分析结果显示, 本试验两个材料
的 GhPTAC 基因在盐胁迫条件下表达量变化趋势基
本一致 , 受盐诱导显著上调表达(0.01
受到盐胁迫后, 叶绿体基因组的转录及叶绿体正常
代谢受到阻碍, 植株自身产生抗性反应, GhPTAC基
因表达量上调, 产生 GhPTAC 蛋白用于稳定叶绿体
基因组的正常转录, 同时, 随着 GhPTAC 蛋白量的
增加, 产生反向抑制作用, GhPTAC基因表达量也随
之下降。 24 h 后 , 随着叶绿体代谢趋于稳定 ,
GhPTAC 基因表达也慢慢维持在一个高于对照的表
达水平上, 以此来适应高盐环境。
结合 GhPTAC蛋白的结构域功能及其在盐胁迫
条件表达特点, 我们推测当植株受到盐胁迫时, 叶
片中叶绿素含量降低 [25], 植物必需蛋白合成受阻 ,
细胞代谢紊乱, 而受胁迫组织将胁迫信号传递到包
含叶绿体的细胞中, 诱导 GhPTAC 基因的表达量升
高。一方面, GhPTAC 蛋白行使抗转录终止的功能,
在转录水平上调节叶绿体中蛋白质、脂肪酸、色素、
以及光系统 I 和光系统 II 中相关酶类等的合成[26];
另一方面, 行使转录终止功能, 停止或减慢过氧化
物等次生毒素的合成, 起到解毒作用。通过转录终
止/抗转录终止的调节作用, 进一步维持了细胞的正
常代谢功能, 起到抵御盐害的作用。在实时定量检
测结果中发现, 在耐盐材料中 9806中该基因的表达
量明显高于盐敏感材料中 S9612, 这在一定程度上
提高了中 9806 的转录调节能力。因此, 我们认为
GhPTAC 基因的表达量受盐胁迫诱导上调表达, 在
转录水平上调控叶绿体基因组的正常表达, 以此来
抵御盐害。
4 结论
获得了陆地棉质体转录活性因子基因(GhPTAC),
其 cDNA全长 1 564 bp, ORF 1 038 bp, 编码 345个
氨基酸残基的多肽。推测 GhPTAC 基因在叶绿体基
因组的转录调控中起作用。该基因的表达与陆地棉
耐盐性呈正相关。
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