全 文 ：第27卷 第3期 作　物　学　报 V ol. 27, N o. 3
2001 年5月 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA M ay, 2001
锌元素对籼稻成熟胚愈伤组织绿苗分化率的影响Ξ
赵成章
(中国水稻研究所农业部水稻生物学重点实验室, 浙江杭州 310006)
提　要　本实验就锌元素对籼稻成熟胚愈伤组织绿苗分化率的影响进行了研究, 结果指出: (1) 锌元
素能明显提高籼稻成熟胚愈伤组织绿苗分化频率, 且使用浓度范围较广 (0. 5～ 10 ΛmolöL ) , 其中以锌
浓度1 ΛmolöL 效果较好; (2) 在本实验范围内各籼稻品种对锌元素的反应是一致的, 但品种间差异很
大, 其中中早14绿苗分化率较高; (3) 锌脉冲试验指出, 锌元素对籼稻成熟胚愈伤组织绿苗分化的影
响主要是诱导培养早期的作用, 而当愈伤组织形成以后, 则影响较少。
关键词　籼稻; 锌; 绿苗分化率; 愈伤组织
Effect of ZnSO 4 on Redifferen tia tion Frequency of Ca llus from M a ture
Embryo of Ind ica R ice
ZHAO Cheng2Zhang
(China N ational R ice R esearch Institu te, H angzhou 310006, China)
Abstract　　T he effect of ZnSO 4 on redifferen tiation frequency of callus from m ature em bryo of
Ind ica rice w ere studies, T he experim en t results indicated that (1) ZnSO 4 could incease sign ifi2
can tly the redifferen tiation frequency of callus from m ature em bryo of Ind ica rice and its range of
app lied concen tration w asw ide from 0. 5～ 10 ΛmolöL , the surtable concen tration of ZnSO 4 w as 1ΛmolöL ; (2) In th is experim en t range, the response of ZnSO 4 on differen t Ind ica varieties w as
sam e, but the redifferen tiation frequency betw een four varieties w as differen t, the Zhongzao14
w as better; (3) T he Zn+ + pulse treatm en t indicated that the m ayor effect of ZnSO 4 on the redif2
feren tiation frequency in Ind ica rice w as early stage in induction culture and A fter callus occur2
rence, the effect of ZnSO 4 on callus redifferen tiation w as a few.
Key words　　Ind ica R ice; ZnSO 4; R edifferen tiation frequency; Callus
锌是仅次于铁在细胞中大量存在的过渡金属, 是生物必需无素之一[ 1 ] , 缺锌使植物生育
受阻。现知多种酶 (主要是分解酶) 的活动中心里含有锌, 如锌酶是金属酶, 主要起催化水解
反应。1999年 Suresh Chand 认为锌促进蛋白质合成, 酶和激素活动以及膜的完整。目前国内
外有关锌元素在植物组织和细胞培养中的作用报道极少, 我们在检测水稻矿物元素成份时却
发现有大量锌元素存在, 但就现有水稻组织和细胞培养基成份中锌元素含量偏低, 这为本项
研究提供了重要线索。水稻成熟胚是理想的转基因实验材料, 可以周年取样, 操作简便, 诱
导频率也高, 但其愈伤组织绿苗分化率很低, 约10% 左右, 特别籼稻成熟胚愈伤组织绿苗分Ξ 本实验得到农业部水稻生物学重点实验室资助。
收稿日期: 1999212208, 接受日期: 2000204226
Received on: 1999212208, A ccep ted on: 2000204226

化率更低, 严重影响植物基因转化工作的开展。因此本试验以水稻成熟胚为起始材料, 着重
研究锌元素对其愈伤组织绿苗分化的影响, 为进一步提高籼稻成熟胚愈伤组织绿苗分化率提
供技术依据, 这对植物基因转化具有重要实践意义。
1　材料和方法
1. 1　材料
早籼中早14、中丝2号、虹早、加9708等品种的新鲜成熟胚。Zn+ + 由 ZnSO 4提供。
1. 2　方法
将新鲜的成熟胚脱壳种子先用75% 酒精浸泡1分钟, 再用0. 1% 升汞灭菌15分钟, 最后用
无菌水冲洗3次, 吸干后接种在改良N 6 [ 2 ]培养基上进行诱导培养, 诱导培养基中添加2, 42D 2
m göL , 62BA 1 m göL , NAA 0. 5 m göL。培养温度27°±1℃, 10～ 12天后当愈伤组织长到0. 5
cm 时, 即可进行分化培养, 15天后统计它们的绿苗分化率。
1. 3　试验设计
(1) 锌处理浓度0、0. 5、1. 0、2. 0、5. 0、10、20、40 ΛmolöL ; (2) 不同品种对锌离子的反
应; (3) Zn 脉冲处理对水稻成熟胚诱导和分化的影响。脉冲方法是: 将实验分为CK1, 处1、
处2、处4、处8、处5、CK2等7个处理, 处理1是第1天将成熟胚在含12ΛmolöL Zn+ 1的N 6培养基上
培养1天, 而后 (第2天) 转入普通N 6诱导培养基上继续培养; 处理2是第2天将成熟胚在含1ΛmolöL Zn+ 1培养基上培养1天, 第3天重转回到普通N 6诱导培养基上继续培养; 其余处理依
此类推, 直到第10天。对照 (CK1)为不经1 ΛmolöL Zn+ 1处理而一直在普通N 6诱导培养基上培
养。对照2 (CK2)则一直在含1 ΛmolöL Zn+ 1的培养基上培养; (4) 分化培养阶段锌元素对愈伤
组织绿苗分化率的影响, 方法是将诱导产生的愈伤组织同时转移到含不同浓度锌 (0、1、2、
5、10 ΛmolöL Zn)的分化培养基上进行绿苗分化。分化培养基为1ö2 N 6大量, 和M S 微量、有
机成份不变、附加62BA 2 m göL、NA 0. 25 m göL 蔗糖2%、洋菜0. 8%、pH 5. 8每天光照8小
时, 培养温度27±℃。
2　实验结果
2. 1　锌浓度对愈伤组织诱导和分化的影响
表1结果指出, 锌元素对早籼中早14成熟胚的愈伤组织诱导率影响不大, 但对愈伤组织
绿苗分化率有很大促进作用, 其中0. 5 ΛmolöL 处理绿苗分化率比对照增加一倍, 1. 0 ΛmolöL
处理组绿苗分化率比对照增加二倍多, 在0. 5～ 10 ΛmolöL 范围内, 锌元素都能提高愈伤组织
绿苗分化率, 而且在此范围内, 锌对愈伤组织出现时间影响不大, 说明锌元素的使用范围较
表1　　Zn+ + 浓度对水稻成熟胚愈伤诱导和分化的影响 (中早14)
Table 1　　Effect of ZnSO4 on Callus of formation and regeneration for mature embryo in r ice
Zn 处理浓度 (ΛmolöL ) 0 0. 5 1. 0 2. 0 5. 0 10 20 40
外值体数 No. of exp lants% 100 90 90 90 90 90 20 40
愈伤诱导率 Callus % 57 66. 7 64. 2 65. 0 60 46 66. 0 6. 7
绿苗分化率 Regeneration % 22. 4 48. 2 61. 8 56. 7 56. 0 50 20 0
出愈天数 Day of callus
occurrence
4 4 4 4 4 5 10 13
5043期　　　　　　　　赵成章: 锌元素对籼稻成熟胚愈伤组织绿苗分化率的影响　　　　　　　　　　　

广, 但随锌元素浓度提高出愈时间成倍增加, 而且愈伤组织变褐直至死亡。
2. 2　不同基因型品种对 Zn 元素的反应
从表2结果看出, 当锌处理浓度1 ΛmolöL 时, 不同早籼品种对锌元素的反应有很大差异。
锌元素对不同品种的愈伤组织诱导率影响不大, 而对不同品种愈伤组织绿苗分化率却有较大
差异, 其中早籼中早14锌处理组的愈伤组织绿苗分化率比对照增加1. 7倍, 而中丝2号锌处理
组的愈伤组织绿苗分化率仅比对照增加28. 6%。
表2　　不同基因型品种对 Zn 元素的反应 (中早14)
Table 2　　Respanse of ZnSO4 on different Ind ica var iety
品种
V ariety
中早 Zhongzao14
CK
处理
T reatm ent
中丝2号 Zhongsi
CK
处理
T reatm ent
虹早Hongzao
CK
处理
T reatm ent
加9708 Gia9708
CK
处理
T reatm ent
外植体数　No of Exp lants 100 90 30 30 100 100 90 100
愈伤诱导率　Callus % 57 64 37. 7 34. 0 96 96 22 23. 0
绿苗分化率　Regeneration % 22. 4 61. 8 35 45 8. 5 15. 0 10 25
2. 3　锌脉冲处理对水稻成熟胚愈伤诱导和分化的影响
从表3结果指出, 锌脉冲处理对籼稻成熟胚愈伤组织诱导率影响不大, 而对其愈伤组织
绿苗分化率则有很大差别, 当成熟胚刚出现愈伤组织时 (即第4天) 供给锌元素能成倍增加愈
伤组织绿苗分化频率, 在此时间以前提供锌元素有一定影响, 而在此时间以后提供锌元素则
反而降低愈伤组织绿苗分化频率, 并使部分愈伤组织变褐。当然全培养期供锌元素最有利于
愈伤组织绿苗分化, 高达85. 2%。
表3　　Zn 脉冲处理对水稻成熟愈伤诱导和分化的影响 (中早14)
Table 3　　Effect of ZnSO4 pulse treatment on callus of formation and regeneration
for mature embryo in r ice without Zn
处理
T reatm ent
对照1 CK1
全培养期不供 Zn
w ithout Zn at
full period
处理1
第一天
F irst
　
处理2
第二天
Second
　
处理3
第四天
Forth
　
处理4
第八天
E ighth
　
处理5
第十天
Tenth
　
对照2CK2
全培养期供 Zn
Full cultured
period w ith Zn
外植体　No of exp lant 60 60 60 60 60 60 60
愈伤诱导率　Callus% 75. 0 75. 0 62 66 73. 3 75 70
绿苗分化率　Regeneration % 36. 1 40 38 61. 8 27. 3 15. 4 85. 2
出愈情况　O ccurrence
of callus
未出愈 未出愈 刚出愈 出愈 出愈
2. 4　锌元素对愈伤组织绿苗分化的影响
如将不经锌元素处理的成熟胚愈伤组织分别转移到不同锌浓度的N 6分化培养基上进行
绿苗分化培养 (见表4) , 结果表明: (1) 低浓度 (0～ 2 ΛmolöL ) 锌处理能明显降低愈伤组织褐
化率, 从而提高其绿苗分化频率, 但增幅不大; (2) 随着锌浓度的进一步提高 (5～ 10 Λmolö
L ) , 其愈伤组织褐化率成倍增加, 进而成倍降低其绿苗分化频率。因此我们认为在分化培养
基中添加锌元素对提高成熟胚愈伤组织绿苗分化的作用是不明显的。
604　　　　　　　　　　　　　　　　　作　　物 　　学　　报　　　　　　　　 　　　　　　　　27卷

表4　　Zn 对水稻成熟胚愈伤组织绿苗分化的影响 (中早14)
Table 4　　Effect of ZnSO4 on the callus regeneration of mature embryo in r ice
Zn 浓度
Zn concentration ΛmolöL 0 1 2 5 10
愈伤组织数 No of callus 50 50 40 40 40
褐化率% B row n callus % 43 18 25 70 80
绿苗分化率 Regeneration % 22. 4 31 38 13 11
3　讨论
3. 1　目前水稻基因转化工作最关注的难题是愈伤组织的绿苗再生, 而籼稻成熟胚愈伤组织
绿苗再生更为困难。因此进一步研究提高籼稻愈伤组织绿苗再生频率成为当前水稻基因工作
研究中急需解决的重大课题。虽然前人已做过许多有益工作, 积累了大量宝贵资料。迄今仍
未根本解决。本文在以往研究工作的基础上, 根据锌元素的生理生化功能, 通过锌元素对水
稻成熟胚愈伤组织的研究发现, 锌元素确能明显地提高籼稻成熟胚愈伤组织的绿苗分化率,
而且使用浓度范围也较广 (0. 5～ 10 ΛmolöL ) , 这给实际应用带来很大方便, 这在国内未见报
道, 在国外也只有一例简报[5 ], 该简报仅指出硫酸锌使用浓度在30～ 60 ΛmolöL , 这与本文
结果有较大差异, 这可能与基因型和环境条件有关。虽然在现有的N 6、M S、B 5等培养基中都
或多或少地含有微量锌元素 (1. 5～ 8. 6 m göL ) , 其中M S 培养基中锌元素含量最高。这对多
数双子叶植物组织和细胞培养可能是合适的, 而对多数水稻品种是不够的, 因此当我们供给
一定量 (1～ 2 ΛmolöL )锌元素时都能明显提高其愈伤组绿苗分化频率, 当然浓度过高就有强
烈抑制和毒害作用。
3. 2　从锌元素脉冲试验结果表明, 锌元素在籼稻成熟胚诱导培养早期使用有很好效果, 说
明锌元素有利于盾片胚性细胞的启动和发育, 但在愈伤组织出现后使用, 特别在愈伤组织分
化阶段使用反而对愈伤组织生长和分化产生抑制和毒害作用, 表现在愈伤组织变褐数目增
加, 愈伤组织绿苗分化率下降, 因此在应用上应把锌元素放在愈伤组织诱导培养基上使用。
有关锌元素在籼稻胚性细胞的启动和分化中的作用机理有待进一步深入探索。
参　考　文　献
1　朱至清, 孙敬三, 王敬驹等. 中国科学, 1976. (5) : 484～ 490
2　赵成章. 中国水稻科学, 1987. 1 (3) : 171～ 176
3　赵成章, 杨长登, 吴连斌等. 应用和环境生物学报, 1997. 1 (2) : 132～ 137
4　赵成章, 杨长登, 吴连斌等. 作物学报, 1997. (1) : 39～ 43
5　Suresh Chand, A shok Kum ar Sahraw at, B iotechnology Q uarterly V olum e, 1999, (37) : 17
6　W elch R. M. , M icronutrient N uctrition of P lants C ritical R ev iew s in P lant S cience, 1995. 14: 49～ 82
7043期　　　　　　　　赵成章: 锌元素对籼稻成熟胚愈伤组织绿苗分化率的影响