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第26卷 第2期 作　物　学　报 V o l. 26KN o. 2
2000 年3月 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA M ar. K2000
棉花优良品种中棉所19高频体细胞胚胎发生细胞系筛选与植
株再生X
张宝红　刘　方　刘志红　巩万奎　姚长兵
; 中国农业科学院棉花研究所K农业部棉花遗传改良重点开放实验室K河南安阳K455112G
提　要　选用我国优良棉花品种中棉所19进行组织培养K研究了该品种的体细胞胚胎发生和植株再生
能力L 中棉所19的体细胞胚胎发生有两种情况P 一是由外植体直接诱导获得胚性愈伤组织和体细胞
胚M二是先诱导获得愈伤组织K再经继代培养获得胚胎发生L 单独使用 ZT 可在早期诱导胚胎发生K在
该情况下K对子叶的诱导能力最强K胚根次之K下胚轴最差L 刚诱导获得的胚性愈伤组织胚胎发生能
力较差K通过在含有0. 1 m g ö L ZT 或2iP 及2 g ö L 活性炭的培养基上连续培养K可获得具有高频胚胎发
生和植株再生能力的细胞系L 中棉所19诱导获得的体细胞胚中K畸形胚的比率较高L 在较合适的培养
基上培养K20%～ 30% 的体细胞胚可萌发形成再生植株L
关键词　棉花M中棉所19M胚胎发生M植株再生
H igh Frequency Soma tic Em bryogenes is and Plan t Regenera tion of
El ite Cotton Var iety CCR I 19
ZHAN G Bao2Hong　L IU Fang　L IU Zh i2Hong　GON G W an2Ku i　YAO Chang2B ing
@Cotton R esearch Institu te of CA A S YK ey L ab. of Cotton Genetic Imp ro. YA g ri. M inistry PR CYA ny ang H enan 455112S
Abstract　Ch inese elite co t ton variety CCR I 19 w as cho sen fo r t issue cu ltu reK and ob ta ined
ca llu s w ith h igh frequency em b ryogenesis and som atic em b ryo s. Em b ryogen ic ca llu s can p ro2
duced direct ly from co tyledonK hypoco tyle and rad ica lK o r from callu s p roducing from ex2
p lan ts. Em b ryogen ic ca llu s and som atic em b ryo s cou ld be direct ly ob ta ined on the m edium
on ly w ith ZT Kbu t it w as influenced by exp lan t sou rces. Co tyledon w as easiest to be induced
em b ryogenesisKand hypoco tylw as the m o st d iff icu lt. T he in it ia l em b ryogen ic ca llu s w as d if2
f icu lt to p roduce som atic em b ryo sK bu t it cou ld be im p roved by subcu ltu re on the m edium
w ith 0. 1 m g ö L ZT ; o r 2iP G and 2 g ö L act ive carbon. M any abno rm al em b ryo s ex isted.
A bou t 20%～ 30% som atic em b ryo s can be converted in to p lan t lets on su itab le m edium T h is
paper suggested an efficien t p rocedu re fo r CCR I 19 som atic em b ryogenesis and p lan t regener2
a t ion.
Key words　Gossypium hirsu tum L MCCR I 19MSom atic em b ryogenesisMP lan t regenera t ion
有关棉花体细胞胚胎发生与植株再生的报道已很多[ 1～ 10 ]K但这些研究大多集中在模式品
种; 如珂字201、珂字312等G上K而生产上大面积推广的优良主栽品种还很难获得成功K限制
了生物技术在棉花遗传改良中的应用[ 11 ]L 针对这个问题K我们于1995年和1998年分别选用我
国优良棉花品种中棉所19进行培养K均获得了胚胎发生和植株再生K并在此基础上对影响棉
花胚胎发生的诸多因素进行了探讨K明确了影响棉花胚胎发生与植株再生的一些因素K筛选
X 本文系农业部重点科研计划 高新技术与基础研究专题资助项目L
收稿日期P 1998206225K接收日期P 1998212216

获得了棉花优良品种中棉所19的高频胚胎发生细胞系K并建立了适合于中棉所19优良品种的
棉花组织培养高效胚胎发生与植株再生体系L
1　材料与方法
按前文[ 12 ]描述的方法制备陆地棉; Gossypium h irsu tum L. G优良品种中棉所19的无菌苗L
取7日龄无菌苗的下胚轴、子叶和胚根K分别切割成3～ 5 mm 长的切段或3～ 5 mm 见方的叶
块分别接种于附加有不同激素及其组合的改良M S 培养基;M S 无机盐+ B 5维生素K简称M S
+ B 5 K下同G中L40天后将接种的培养物分为两部分K一部分继续培养K另一部分转入附加
0. 1 m g ö L ZT 和0. 1 m g ö L IAA K或仅附加0. 1 m g ö L ZT 的改良M S 培养基上培养K以后每
20～ 30天继代培养一次L
所有培养基均用7 g ö L 琼脂固化KpH 值5. 8～ 6. 0K在121℃下高温灭菌12～ 15 m inL
所有培养均在光照条件下进行K每天光照12～ 14 hK光照强度2000 lx 左右K培养温度28
±2℃L
2　结果与讨论
与其它品种一样K中棉所19愈伤组织的诱导受激素的调控K单独使用 ZT 诱导获得愈伤
组织的量较少K2K42D 的添加则使愈伤组织大量形成M不同外植体诱导形成愈伤组织的能力
不同K其中下胚轴和子叶形成愈伤组织的能力较强K培养50天愈伤组织就已长满整个三角
瓶K胚根较差; 表1GL激素对愈伤组织诱导的差异还表现在出愈时间上K2K42D 的添加可使愈
伤组织快速形成K在含有2K 42D 的培养基上K接种后5～ 7天就可观测到明显的愈伤组织形
成M而单独使用 ZT 或 ZT 与 IAA 配合使用愈伤组织的形成则较慢K一般10～ 15天才观察到
少量愈伤组织的形成L
表1　中棉所19愈伤组织诱导和胚胎发生
Table 1　Callus and somatic embryogenesis induced from cotton cultivar CCR I 19
培养基
M edium
;m g ö L G
　
外植体
Exp lan t
　
　
接种数
N o. of
exp lan t
　
出愈数
N o of
callus
　
出愈率
; % G
Callus
; % G
胚性愈
伤形成
数
N o of EC
胚性愈伤
组织形成率
; % G
EC ; % G
胚性愈
伤组织
分化率; % G
D EC; % G
愈伤量3
Grow th
of callus
　
分化
根数
N o of
roo ted
根分化
率; % G
Roo ted
; % G
根分化
量3 3
Grow th
of roo t
M S+ B 5+ 2K42
D 0. 1+ ZT 0. 1
　
下胚轴
子叶
根
56
58
48
56
58
48
100. 0
100. 0
100. 0
0
0
0
0. 00
0. 00
0. 00
0. 00
0. 00
0. 00
+ + + + +
+ + + +
+ + + +
0
0
-
0. 00
0. 00
-
-
-
-
M S+ B 5+ 2K42
D 0. 1+ ZT 0. 5
　
下胚轴
子叶
根
46
58
52
46
58
52
100. 0
100. 0
100. 0
0
0
0
0. 00
0. 00
0. 00
0. 00
0. 00
0. 00
+ + + + +
+ + + + +
+ + +
0
0
-
0. 00
0. 00
-
-
-
-
M S+ B 5+
ZT 0. 1
　
下胚轴
子叶
根
60
59
51
58
26
10
96. 7
44. 1
19. 6
1
4
2
1. 67
6. 78
3. 92
1. 72
15. 38
20. 00
+ +
+ +
+
12
30
-
20. 0
50. 6
-
+
+ + + +
-
M S+ B 5+
IAA 0. 1+
ZT 0. 5
下胚轴
子叶
根
60
63
48
59
25
7
98. 3
39. 7
14. 6
0
2
0
0. 00
3. 17
0. 00
0. 00
8. 00
0. 00
+ + +
+ +
+
4
15
-
6. 67
23. 81
-
+
+ +
-
　注N o teP EC= Em bryogenic callusMD EC= D ifferen tiat ion of em bryogenic callus 3 + K+ + K+ + + K+ + + + K+ + + +
+ 表示愈伤组织形成的量逐渐增加 T he grow th of callus 3 3 - 表示没有根的形成 roo tlessM+ 仅分化出少数根L itt le
roo tM+ + 平均每个外植体分化根2～ 4条2～ 4 roo ts ö exp lan tM+ + + + 分化根多于5条ö 外植体mo re 5 roo ts ö exp lan t
042　　　　　　　　　　　　　　　　　作　　物 　　学　　报　　　　　　　　 　　　　　　　　26卷

　　经过连续培养或2～ 4次的继代培养K可观察到胚性愈伤组织的形成L 中棉所19的胚性愈
伤组织的诱导和体细胞胚的形成有两种方式P 一是直接从外植体诱导获得胚性愈伤组织和体
细胞胚M二是先诱导获得愈伤组织K然后由该愈伤组织再诱导获得胚性愈伤组织和体细胞
胚L 两者的培养方法和所需的激素调控不同L
中棉所19的下胚轴、子叶和胚根在诱导培养基上连续培养70天后K可观察到胚性愈伤组
织开始形成K并能进一步分化发育而形成子叶胚L 激素对胚性愈伤组织和胚胎发生的直接诱
导起着关键性作用L 0. 1 m g ö L ZT 的单独使用使子叶、下胚轴和胚根直接诱导获得胚性愈伤
组织和体细胞胚K IAA 的添加消弱了 ZT 的诱导效果M2K42D 的添加没有观察到胚性愈伤组
织和体细胞胚的直接形成L 这与我们先前的研究结果相似[ 13 ]L 我们在研究外源激素对棉花体
细胞胚发生与发育的调控作用时发现P 在棉花体细胞胚胎发生能力的调控中K细胞分裂素类
物质的活性强于生长素类物质K且细胞分裂素类物质对棉花体细胞胚诱导能力不同K按BA、
KT、ZT、2iP 的次序递增[ 14 ]L 因而我们在近期的试验中用2iP 代替 ZT 进行了重复试验L 诱
导虽能获得直接胚胎发生K但效果远不如 ZT K这可能与两类激素的浓度效应有关L
　　外植体种类也是影响棉花直接诱导获得胚性愈伤组织和体细胞胚的重要因素L 在本试验
中K子叶虽然诱导获得愈伤组织的能力不如下胚轴K但诱导获得直接胚胎发生的能力则最
强K在仅附加0. 1 m g ö L ZT 的改良M S 培养基上有6. 78% 的外植体直接诱导获得了胚性愈伤
组织和体细胞胚K占诱导愈伤组织的15. 38% K胚根次之K下胚轴最差; 表1GL
与其它报道一样K本实验中诱导获得的愈伤组织也可分为两类K即胚性愈伤组织和非胚
性愈伤组织L 所不同的是我们直接从中棉所19的子叶、胚根和下胚轴等多种外植体直接诱导
获得了胚性愈伤组织和体细胞胚K而前人的报道大多是先诱导获得愈伤组织K然后再诱导获
得胚性愈伤组织和体细胞胚L 这样既拓宽了棉花组织培养植株再生的基因型范围K也缩短了
培养周期K简化了培养过程L
在本实验中K我们还观察到同一外植体往往只产生一类愈伤组织K即要么是胚性愈伤组
织K要么是非胚性愈伤组织L 非胚性愈性组织往往产生时间较早K一般接种后7～ 10天就可产
生M而胚性愈伤组织产生的时间则较晚K一般需要70～ 80天的连续培养才可产生L 产生非胚
性愈伤组织的外植体一般不再直接产生胚性愈伤组织M但胚性愈伤组织的产生往往与根的分
化有一定的关系K在本实验中凡直接产生胚性愈伤组织的子叶均有分化根的形成L
虽然在含有2K42D 的培养基上K外植体不能即刻产生胚性愈伤组织K但其诱导产生的愈伤
组织经过2～ 4次的继代培养一般也可分化出胚性愈伤组织K只是开始时胚性愈伤组织的量较
少K发现后应及时将其挑选出来K放在胚性愈伤组织增殖培养基;M S+ B 5+ 0. 1 m g ö L 2K 42D
+ 0. 1 m g ö L ZT G上增殖K先前有关诱导获得棉花胚胎发生的报道均是通过这种方法进行的L
初始诱导获得的胚性愈伤组织K其胚胎发生能力一般均较弱K此时可通过两种方法来提
高其胚胎发生能力K一是在含有2 g ö L 活性炭的固体培养基上培养K二是在含有0～ 0. 1 m g ö L
ZT 或2iP 的液体培养基上悬浮培养K通过这两种方法也可筛选出高频胚胎发生能力的细胞
系L 棉花高频胚胎发生能力的细胞系的典型特点是P 愈伤组织呈金黄色K米粒状K在水中易
分散成较小的颗粒体L 我们就是利用这种方法诱导、筛选获得了中棉所19的高频胚胎发生细
胞系L
将诱导获得的中棉所19的胚性愈伤组织转入附加0. 1m g ö L ZT或2iP的液体或固体培养基
1422期　　　　张宝红等P 棉花优良品种中棉所19高频体细胞胚胎发生细胞系筛选与植株再生　　　　　　

图1　棉花优良品种中棉所19组织培养胚胎发生
与植株再生培养程序的建立
F ig. 1　Culture p rocedure of som atic em bryogenesis and p lan t
regeneration fo r Gossyp ium h irsu tum L. cu lt ivar CCR I 19
上培养K可产生大量的胚状体K但畸形
胚的比率较高K主要表现为无子叶胚、
生长点异常胚等多种K畸形胚的大量存
在严重影响了棉花体细胞胚的萌发和植
株再生K这与我们先前的报道相似[ 15 ]L
将诱导获得的体细胞胚转入附加0. 1
m g ö L ZT 和0. 1 m g ö L NAA 的培养基
上培养K有利于体细胞胚的萌发和植株
再生K其大约有20%～ 30% 左右的胚状
体可萌发成苗L 活性炭的添加也有利于
部分体细胞胚的萌发和正常小植株的形
成L
在上面研究的基础上K我们建立了
中棉所19的高频胚胎发生与植株再生体
系; 图1GK并利用该体系诱导获得了中
棉所12、泗棉3号、抗虫双隐核不育系、
珂字201、珂字312等10余个品种的胚胎
发生和植株再生L 该体系与先前的报道
相比具有以下特点P ① 拓宽了棉花组
织培养体细胞胚胎发生和植株再生的基
因型范围K该体系既适合于模式品种珂
字201、珂字312等的组织培养K也适合
于中棉所19、中棉所12、泗棉3号等优
良品种的组织培养M② 简化了培养过程K缩短了培养时间K该体系可直接诱导大多数品种获
得胚性愈伤组织和体细胞胚K而不需要繁琐的继代培养K因而培养程序大大简化K培养时间
大大缩短L 该体系的建立K有利于我国棉花生物技术的发展L
参　考　文　献
1　V oo K SKC L RughKJ C Kam alay. In v itro Cell. D av. B iol. K1991K27PP 117～ 124
2　Shoem aker R CK I J CoucheKD W Galbraith. P lan t Cell R esp ortsK1986K3; 3GP 178～ 181
3　T ro lider N L KJ R Goodin. P lan t Cell R ep ortsK1986K6; 3GP 231～ 234
4　陈志贤K李淑君KN L T ro lider. 中国农业科学K1987K20; 4GP 6～ 11
5　张宝红. 科学通报K1994K39; 14GP 1340～ 1342
6　张大力K王吉吉之. 植物学报K1989K31; 2GP 161～ 163
7　刘春明K姚敦义. 植物学报K1991K33P 378～ 384
8　张宝红K丰　嵘. 农业生物技术学报K1996K5; 2GP 44～ 50
9　张献龙K孙济中K刘金兰. 遗传学报K1991K18P 461～ 467
10　F iner J JKP lan t Cell Repo rtsK1988K7P 399～ 402
11　张宝红K赵宝升主编. 棉花生物技术及其应用. 北京P 中国农业出版社K1997
12　ZHAN G Bao2HongKL i X iu lanKL i Fenglian et al. A cta A g ricu ltu rae B orea li2occid en ta lis S in icaK1995K4; 4GP 11～ 16
13　ZHAN G Bao2Hong. Ch inese S cience B u lletinK1999K44; 8GP 766～ 767
14　张宝红K刘　方K姚长兵. 作物学报K2000K26; 1GP 125～ 126
15　张宝红K李秀兰K李付广等. 作物学报K1996K22; 1GP 107～ 111
242　　　　　　　　　　　　　　　　　作　　物 　　学　　报　　　　　　　　 　　　　　　　　26卷