全 文 ：V o l. 29, N o. 3
pp. 478～ 479　M ay, 2003
作　物　学　报
A CTA A GRONOM ICA S IN ICA
第 29 卷 第 3 期
2003 年 5 月　478～ 479 页
研究
简报 棉花高质量总 RNA 提取的一种有效方法
Ξ
窦道龙1, 2　王冰山2　唐益雄2　王志兴2　孙敬三1, 3
(1中国科学院植物研究所, 北京 100093; 2中国农业科学院生物技术研究所, 北京 100081)
A Sim ple and Eff ic ien tM ethod for Extraction of H igh Qua l ity RNA from Cot2
ton
DOU D ao2L ong1, 2　WAN G B ing2Shan2　TAN G Yi2X iong2　WAN G Zh i2X ing2　SUN J ing2San1, 3
(1 Institu te of B otany , Ch inese A cad emy of S ciences, B eij ing　100093; 2 B iotechnology R esearch Institu te, Ch inese A cad emy of A g ricu ltu ral S ci2
ences, B eij ing　100081, Ch ina)
　　棉花抗病虫基因工程和纤维品质改良一直是国内外研究
的热点之一, 近年来许多实验室又开展了棉花功能基因组学
研究, 在这些研究中都需要提取高质量的RNA , 但目前广为
使用的 T riZo l reagen t k it 和异硫氰酸胍2酚2氯仿一步提取法
从棉花中难以纯化出完整的RNA , 尽管许多学者针对棉花也
发展出了几种有效的方法, 但是这些方法一般都费工、费时。
本文综合比较这些技术, 并对热CTAB 法加以改进, 提出了一
种较为可行的提取高质量棉花总RNA 的简便方法。
1　材料与方法
111　植物材料
海岛棉 7124 (Gossyp ium barbad ense)两周龄的叶片。
112　试剂
所有容器和试剂均按《分子克隆》(第二版, 343～ 344) 要
求处理
RNA 抽提液: 2%CTAB (w öv) , 2% PV P K25 (w öv) ,
100 mmo löL T ris2HC l (pH 810) , 25mmo löL sodium 2ED TA
(pH 810) , 210 mo löL N aC l, 混匀灭菌, 用前加入终体积为
2%的 22巯基乙醇; 氯仿; 异丙醇 (24∶1) ; 10 mo löL L iC l;
95% 乙醇; 3 mo löL 醋酸钠 (pH 512)。
113　总 RNA 提取程序
11 700 ΛL buffer 加入 2% 终体积的巯基乙醇后, 65℃温
育;
21 100 m g 组织液氮研磨后置于 65℃抽提液中, 剧烈震
荡;
31 等体积氯仿ö异丙醇抽提 1～ 2 次, 离心 (10 000 rö
m in, 4℃, 10 m in) ;
41 上清加入 1ö4 体积的 10 mo löL L iC l, 混匀, 4℃过夜
沉淀;
51 离心 ( 10 000 röm in, 4℃, 10 m in ) , 溶于 50 ΛL
RN ase2free 水;
61 加入 1ö10 体积的 3 mo löL 醋酸钠 (pH 512) , 215 倍
体积的乙醇, - 70℃, 沉淀 10～ 30m in;
71 离心 (10 000 röm in, 4℃, 10 m in) , 70% 乙醇洗沉淀;
81 溶于 15 ΛL 水, - 70℃保存, 检测备用。
114　RNA 分析 (产量、完整性)
取 1 ΛL 所提RNA 稀释至 150 ΛL 测定A 260和A 280, 取 4ΛL 进行电泳检测。
115　m RNA 提取
按 P rom ege 使用说明书进行。
2　结果与讨论
棉花组织棉酚、萜类、多糖含量较高, 干扰完整 RNA 的
提取。酚类氧化后与RNA 不可逆结合, 在氯仿抽提时造成
RNA 的丢失; 萜类化合物造成 RNA 的降解; 多糖与 RNA
性质类似, 提取时两者难以分开, 目前广为使用的 T riZo l
reagen t k it 和异硫氰酸胍2酚2氯仿一步提取法很难从中提取
出高质量完整的总 RNA , 而用这两种方法我们实验室可以
从拟南芥、烟草、水稻和向日葵中提出高质量的RNA。
针对植物次生代谢类物质的干扰, 研究者提出了一些相
应的对策, 并且成功地应用于山核桃1、松树2、食虫植物茅膏
菜3 和棉花4, 5等植物的RNA 提取, 综合比较这些方法 (见表
1) , 热CTAB 抽提法所用的都是常规试剂, 尽管需过夜沉淀
但操作简单。我们将此方法首次应用于棉花叶片RNA 的提
取, 证明该法易于重复, 可以纯化出高质量完整的总 RNA ,
并且能满足许多分子生物学试验进一步操作的要求。
热 CTAB 抽提法利用L iC l 沉淀和碱性、高盐离子条件
下氯仿抽提去除多糖的干扰, 利用螯合剂 PV P 结合多酚, 加Ξ基金项目: 国家自然科学基金 (30170637)、国家转基因研究与产业化专项 (ZJY2A 201)资助项目。
作者简介: 窦道龙 (19732) , 中国科学院植物研究所在读博士生, 研究方向: 植物分子生物学。3 通讯作者A utho r fo r co rrespondence
Received (收稿日期) : 2002202228, A ccep ted (接受日期) : 2002205214.

入 22巯基乙醇防止酚类物质的氧化, 来去除植物中各种复杂
成分的干扰, 能从棉花叶片中提出高质量完整的 RNA (图
1)。对于RNA 电泳, 基本上所有的实验程序都要求对溶液和
器皿进行高温或其他特殊处理, 去除 RN ase, 进行变性胶电
泳, 涉及到D EPC (焦碳酸二乙酯, 致癌剂)操作。我们试验用
普通DNA 电泳操作方法, 提高电压 (200 V ) , 15m in 内完成
操作, 经多次实验证明能完全满足RNA 完整性鉴定的要求
(图 1)。
表 1　　各种 RNA 提取方法比较
Table 1　　Compar ison of methods for RNA extraction
方法
M ethod
植物
Species A 260öA 280 产率Yield (ΛgögFW ) 方法评价Evaluation of m ethod 参考文献Reference
锂抽提法
L ith ium extraction
山核桃
棉花
1. 9
ND
1000～ 1200
ND 操作简单, 需过夜, 普通试剂
[ 1 ]
[ 5 ]
热硼酸盐法
Ho t bo rate ex traction
N ucleon PhytoPureTM
棉花
多种植物
1. 3～ 1. 92
1. 1～ 210 512～ 1016240～ 3000 操作简单, 试剂比较昂贵, 难以购买操作最简单, 试剂很昂贵, 难以购买 [ 4 ][ 6 ]
热CTAB 法
Ho t CTAB buffer
松树
茅膏菜
棉花
117～ 210
ND
1191～ 1198 100～ 24070200～ 300 操作简单, 需过夜, 普通试剂 [ 2 ][ 3 ]本文, T h is study
　　ND , 无数据,N o t determ ined
图 1　RNA 的电泳图谱
F ig. 1　E lectropho resis of to tal RNA
图 2　全长 p g ip 基因 PCR 电泳结果图
F ig. 2　E lectropho resis of fu ll sequence of p g ip gene
　　经过 4 次重复实验,A 260öA 280分别为 1194、1198、1198 和
1191, 优于热硼酸盐法的结果。根据A 260的大小, 计算出每
100m g 叶片平均可以提取 20～ 30Λg RNA , 低于热硼酸盐法
的结果 (表 1) , 在提取液中加入蛋白酶 K (015 m gömL ) , 可以
使其产量提高 1 倍。
我们利用获得的总RNA , 设计简并引物, 进行R T 2PCR
(反转录 PCR )操作, 得到一条分子量约为 560 bp 的基因片
段 (图略) , 序列测定认为是棉花多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白
基因 p g ip 的一部分, 并且利用 RA CE (R ap id Amp llificat ion
of cDNA Ends) 技术克隆了该基因 993 bp 的全长序列 (图
2)。同时利用提取的总RNA 进一步分离mRNA , 分析其产
率约为 1%。我们还利用得到的mRNA , 构建了棉花黄萎菌
激发子诱导后的 cDNA 文库, 其滴度约为 1×107pfΛöΛg, 插
入片段大小在 500～ 2000 bp 范围内。表明所提取的RNA 完
全能满足mRNA 的分离、全长基因的克隆和 cDNA 文库的
构建等操作的要求。
Chang [2 ]和 Ildiko [3 ]等人应用热 CTAB 抽提法先后从高
度富含次生代谢物质的松树针叶和根以及食肉植物茅膏菜
中分离出高质量完整的 RNA , 本实验进一步验证在棉花上
有同样的可行性, 并证明在提取液中加入蛋白酶 K (015 m gö
mL ) , 可以使总RNA 产量提高 1 倍, 这对于从其它次生代谢
物质含量较高的植物中提取总RNA 有一定的借鉴意义。
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974　3 期 窦道龙: 棉花高质量总RNA 提取的一种有效方法