全 文 ：Vol. 29 , No. 4
pp. 541～544 　July , 2003
作 　物 　学 　报
ACTA AGRONOMICA SINICA
第 29 卷 第 4 期
2003 年 7 月 　541～544 页
基因枪法将 L EAFY基因导入甘蔗的研究
李克贵　潘大仁 3 　许莉萍 Ξ
(福建农林大学农业部甘蔗遗传育种重点开放实验室 , 福建福州 350002)
摘 　要 　利用基因枪介导的方法 ,以 L EAFY 基因为目的基因 , NPT Ⅱ为选择/ 标记基因进行共转化。对影响基因枪法转
化甘蔗的影响因素进行了探讨 ,结果表明转化前预培养 2 d 获得的转化效率最高 ,转化前后进行高渗处理可以提高转化
效率。大量转化后 ,将 L EAFY 基因导入到 3 个甘蔗品种 Badila、ROC22 和 ROC16 中去 ,获得了转 L EAFY 基因的甘蔗植株。
其中抗性愈伤组织的获得频率最高达 11. 2 % ,抗性植株的获得频率最高达 1. 22 %。转基因植株的 PCR 及 PCR2Southern
杂交检测结果表明 ,外源基因 L EAFY 已整合进了转基因植株基因组中。
关键词 　L EAFY 基因 ; 甘蔗 ; 开花 ; 基因枪
中图分类号 : Q943 ,S566 　　　文献标识码 : A
The Study on Transformation of L EAFY Gene into Sugarcane by Particle Bombard2
ment
LI Ke2Gui 　PAN Da2Ren 3 　XU Li2Ping
( Key Laboratory of Sugarcane Genetics & Breeding , Ministry of Agriculture , Fujian Agricultural and Forestry University , Fuzhou , Fujian 350002 , China)
Abstract 　L EAFY and NPT Ⅱgenes were co2transferred into sugarcane in this study. Sugarcane calli as target tissues
were bombarded by Biolistic PDS21000/ He Particle Delivery System (BIO2RAD) with the plasmid DNA coated to GOLD
Particle . The result demonstrated that pre2culture or mannitol treatment before bombardment could improved the regenera2
tion ability significantly. The highest transformation efficiency was 11. 2 % according to the estimation of the resistant calli
produced on the medium with kan. The highest regeneration frequency from resistant cultures was 1. 22 %. The transformed
plants were confirmed by PCR analysis and PCR2Southern blotting.
Key words 　L EAFY gene ; Sugarcane ; Transformation
　　开花是植物生长过程的重要质变历程[1 ] ,近年
来开花调控研究成为植物生殖发育研究的新热
点[2 ] 。人们通过突变体在拟南芥菜 ( Arabidopsis
thaliana) 中克隆到一系列控制开花过程的基因。
1992 年 ,Weigel [3 ]等从野生拟南芥中克隆了一个与
调控花分生组织启动相关的基因双链2L EA FY 基因。
该突变体表现为花序分生组织转变为花分生组织受
阻。单双基因突变、基因序列分析及表达模式和转
基因的研究表明 , L EA FY 基因在控制和启动开花过
程中起着重要作用 ,并且是在开花起始的早期起作
用[4 ] 。为了进一步鉴定它的功能 ,人们进行了一系
列的转化工作 ,35 S L EA FY 转化野生拟南芥、烟草和
杂种杨后均使这些植物提早开花 , 说明通过导入
L EA FY 基因 ,有可能调控开花的时间[5 ] 。
甘蔗只在低纬度地区开花 ,在包括海南省在内
的我国大部分蔗区都很难开花 ,这使得甘蔗有性杂
交育种难以进行[6 ] 。本研究用基因枪方法介导 ,选
择甘蔗胚性愈伤组织作为转化的受体材料 ,进行了
拟南芥 L EA FY 基因的转化。以研究 L EA FY 基因在
不同植物中的表达 ,并且为今后进一步开展应用基
因工程手段 ,诱导甘蔗开花打下良好的基础。Ξ基金项目 :农业部“948”项目资助 (971043 , 981016) 。
作者简介 :李克贵 (1976 - )男 ,山东昌乐人 ,硕士 ,研究方向 :植物基因工程。3 通讯作者 :潘大仁 (1949 - ) ,男 ,福建福州人 ,教授 ,研究方向 :基因工程。
Received(收稿日期) :2002207202 ,Accepted(接受日期) :2002210212.

1 　材料与方法
111 　材料
　　植物材料 : 3 个甘蔗品种 Badila、ROC16 和
ROC22 ,均取材于福建农林大学农业部甘蔗遗传育
种重点开放室农场。
质粒及菌种 :含有 CaMV35S 启动子的全结构
L EA FY 基因的重组质粒 pBIL (如图 1) 由海南热带作
物生物技术国家重点实验室邵寒霜博士[5 ] 惠赠。
E1 coliDH5α由本实验室保存。
图 1 pBIL 植物表达载体示意图
Fig11 The structure of pBIL plasmid
　　试剂 :质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒和 PCR
引物购自上海生工生物工程公司 ,限制性内切酶购
自华美生物工程公司 ,杂交试剂盒购自 Roche 公司。
112 　质粒的酶切鉴定及 PCR分析
采用柱式质粒大量提取试剂盒提取质粒 ,然后
进行 Hind Ⅲ单酶切和 EcoR Ⅰ+ Hind Ⅲ双酶切鉴
定[7 ] 。根据 L EA FY 基因两端序列设计并合成一对
引物进行 PCR 扩增。
引物 1 :5’2CGGTGGAACCCAACGAGAG
引物 2 :3’2TGTAACAAGCCTGACGCCATGAG
113 　受体材料的预处理
轰击前 ,将受体材料甘蔗胚性愈伤组织转至分
化培养基 (MS + 2 mg/ L BA) 预培养 2 d ,然后转入含
甘露醇和山梨醇各 012 mol/ L 的高渗培养基进行高
渗处理 8 h。
114 　转化
将质粒 pBIL 与金粉充分混合后 ,制备微弹载
体 ,然后以基因枪 (Biolistic PDS - 1000/ He Particle
Delivery System) 为介导 ,将含有 L EA FY 基因的重组
质粒射入靶材料的细胞内。
115 　转化细胞筛选
以卡那霉素为筛选剂进行筛选。作为靶材料的
胚性愈伤组织在轰击后 ,转入含甘露醇和山梨醇各
012 mol/ L 的高渗培养基进行高渗处理 16 h ,再转入
不加任何筛选剂的培养基过渡培养 1 周 ,然后转入
含卡那霉素的选择继代培养基 (MS + 2 mg/ L 2 ,42D
+ 280 mg/ L kan + )上筛选抗性愈伤组织。连续筛选
3 代 (2 周/ 代) 。
116 　抗性愈伤组织分化与植株再生
将生长旺盛的抗性愈伤组织转至含卡那霉素的
选择分化培养基 (MS + 2 mg/ L BA + 280 mg/ L kan + )
上分化成苗。在相同培养基上连续筛选 2 代 (2 周/
代) 。获得生长健壮的抗性苗 ,然后转入促根培养基
(MS + 3 mg/ L NAA + 011 mg/ L BA) 促根壮苗 ,获得
再生植株。
117 　转化植株总 DNA 的 PCR与 PCR2Southern 杂
交分析
从 kan +抗性植株及未进行转化的植株上剪取
少量叶片 , 经液氮速冻后 , CTAB 法微量提取总
DNA[8 ] ,用 RNase 消化样品中所含的 RNA。然后以
质粒 pBIL 为阳性对照 ,以未转化植株总 DNA 为阴
性对照 ,进行 PCR 扩增。植株总 DNA 经 PCR 扩增
获得阳性条带后 ,将凝胶上的 DNA 转移到硝酸纤维
素膜上[9 ] ,制备 L EA FY 基因的 EcoR Ⅰ+ Hind Ⅲ双酶
切片段作为杂交探针 ,进行 PCR2Southern 杂交。
2 　结果与分析
211 　质粒酶切鉴定与 PCR分析
　　质粒经 Hind Ⅲ单酶切和 EcoR Ⅰ+ Hind Ⅲ双
酶切后 ,获得了预期大小的片段。质粒经 PCR 扩增
后 ,获得了预期的 960 bp 大小的条带。
212 　预培养对基因枪法转化甘蔗效率的影响
在对愈伤组织进行轰击前 ,先将其转入分化培
养基预培养 ,表 1 列出了不同的预培养天数对基因
枪法转化甘蔗效率的影响。可以看出 ,转化前预培
养 2 d 可以获得相对较高的转化效率。
213 　高渗处理对基因枪法转化甘蔗效率的影响
在轰击前 6 h ,轰击后 18 h 进行甘露醇和山梨
醇的高渗处理。甘露醇与山梨醇的浓度均为 012
mmol/ L。从表 2 中可以看出 ,受体组织转化前后 ,进
行高渗处理 ,可以提高基因枪转化甘蔗的效率。
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表 1 预培养对基因枪法转化甘蔗效率的影响
Table 1 Effect of preculture before
bombardment on transformation efficiency
品种
Cultivar
预培养时间
Days of
preculture (d)
GUS +表达块数
Tissues with
GUS + (A)
总组织块数
Total tissues
(B)
A/ B
( %)
ROC22 0 1 30 313
1 1 30 313
2 3 30 10
3 2 30 617
ROC16 0 2 30 617
1 1 30 313
2 4 30 1313
3 1 30 313
Badila 0 0 30 0
1 1 30 313
2 1 30 313
3 1 30 313
表 2 高渗处理对基因枪法转化甘蔗效率的影响
Table 2 Effect of mannitol treatment before
bombardment on transformation efficiency
品 种
Cultivar
高渗处理
Mannitol
treatment
抗性愈伤组织
Resistant
calli (A)
总愈伤组织
Total calli
(B)
A/ B
( %)
ROC22 + 5 50 10
- 4 50 8
ROC16 + 4 51 8
- 3 50 6
Badila + 2 50 4
- 0 50 0
214 　不同甘蔗品种对基因枪法转化甘蔗效率的
影响 　
在建立了包含预培养与高渗处理等因素优化的
转化体系后 ,我们进行了大量转化。表 3 列出了不
同甘蔗品种对基因枪法转化甘蔗效率的影响。
从表 3 中可以看出 ,在 3 个参试品种中 ROC22
转化效率最高 ( 1122 %) , Badila 次之 ( 1121 %) ,
ROC16 最低 (01625 %) 。
表 3 基因枪转化 L EAFY基因的效率
Table 3 The transformation efficiency by bombardment
with L EAFY gene
品 种
Cultivar
轰击的组织
块数 Calli
bom2bardmented
(A)
卡那霉素抗
性组织块数
Calli with
kan2resistance
(B)
卡那霉素抗
性植株
Plants with
kan2resistance
(C)
B/ A
( %)
C/ A
( %)
ROC22 820 92 10 1112 1122
ROC16 320 28 2 8175 01625
Badila 164 12 2 9175 1121
215 　转基因植株的 PCR 及 PCR2Southern 杂交
分析
提取 14 棵推定的转基因植株的基因组 DNA 进
行 PCR 扩增 ,其中 4 棵获得 960 bp 大小的阳性条
带 ,片段大小和阳性对照的条带一致 (见图 2) 。PCR
结果转移到硝酸纤维素膜上同探针杂交 ,获得了阳
性条带 (见图 3) 。初步证明 L EA FY 基因已整合到这
些转化植株的基因组中。由于甘蔗植株生长缓慢 ,
目前我们只进行了分子生物学鉴定 ,后续的大田实
验有待进一步研究。
图 2 转基因植株的 PCR 分析
Fig. 2 PCR analysis of the kanamycin2resistant plant
Ma : GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder 1 为阳性对照 :质粒 :pBIL ;
2 为阴性对照 :未转化植株总 DNA ;3～7 为转化植株总 DNA
1. Positive control :plasmid pBIL ; 2. Negative control :total DNA form
normal plant ; 327. Total DNA from transformed plants
图 3 PCR2Southern 杂交分析
Fig. 3 PCR2Southern blotting analysis
2 为阴性对照 ;未转化植株总 DNA ; 1 ,3 为转化植株总 DNA
2 :Negative control :total DNA from normal plant ;
1 ,3 :Total DNA from transformed plants
3 　讨论
基因枪法介导的基因转化 ,在禾谷类作物上应
用比较广泛[10 ] 。影响基因枪法转化甘蔗的影响因
345　4 期 李克贵等 : 基因枪法将 L EAFY 基因导入甘蔗的研究 　　　

素有多种 ,在实验中 ,我们采取了促进基因枪法转化
甘蔗的必要措施。
转化前 ,将甘蔗胚性愈伤组织转入分化培养基
预培养 2 d ,可使愈伤组织的分生能力增强 ,细胞分
裂旺盛 ,DNA 大量合成。处于接受外源基因的最佳
时期 ,有利于外源 DNA 的摄入与整合。从而可以提
高转化效率。
应用甘露醇和山梨醇进行高渗处理 ,也可以提
高基因枪的转化效率[11 ] 。高渗处理影响转化效率
的可能机制是 ,细胞在高渗条件下发生了质壁分离 ,
从而减少了在微弹穿孔时细胞质泄漏 ,而提高了细
胞的生存力。不过 ,高渗处理必须掌握合适的浓度
和时间 ,低浓度短时间的处理不能很好地发挥作用 ,
而高浓度长时间的处理 ,会造成质壁分离的不可恢
复[12 ] 。对于不同植物来说 ,合适的处理时间和浓度
不尽相同。我们经研究认为 ,在轰击前 8 h 至轰击
后 16 h ,将愈伤组织置于含渗透剂 012 mol/ L 甘露醇
和 012 mol/ L 山梨醇的 MS培养基中进行高渗处理 ,
能提高外源基因的瞬间表达量并增加愈伤组织的分
化频率。
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