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第 28卷 第 5期 作 物 学 报 Vol.28,No.5
2002年 9月 709～712页 ACTAAGRONOMICASINICA pp.709～712 Sept
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.,2002
研究
简报
农杆菌真空渗透法转化花粉获得棉花转 >?@A基因植株B
李 晓1 王学德1 朱玉贤2 卢迎春2 赵向前1
C1浙江大学农业与生物技术学院,浙江杭州 D10029E2北京大学生命科学学院,北京 100871F
GHIJKLMJNO>?@APQRRQJSTIJRKUVRINJMWVXYIOZZ[\J]NTRHIRNQJQ]SQTTMJ N^R_
‘abcd>?efbghiehifj>?gfk@
lImnoo1 pANGmqerse1 tuvwqrmnox2 lvwnxyrCzqx2 tuAOmnoxyr{nox1
C1|}~tofAgricultur},Biot}chnology,Zh}jiangUniv}rsityHangzhou,D10029E2|}~t.ofBiology,P}kingUniv}rsity100871,ChinaF
本文以花粉作为受体细胞,在农杆菌介导下将
外源基因导入花粉中,然后通过人工授粉获得转化
种子。以花粉作为受体的转化方法,其优点是它避
开了传统基因转化方法所需的组培过程,含外源基
因的花粉可与卵细胞自然结合,产生的转化体不存
在转化与非转化细胞间的嵌合现象。
1 材料和方法
1.1 农杆菌菌株和棉花品种
所用菌株为带有双元载体 pCAMBIA1D01的
GVD101农杆菌C由北京大学朱玉贤教授提供F,它
带的载体有一个 GUS基因、潮霉素抗性基因和从
木质醋杆菌中克隆的纤维素合成酶基因 acsBE基因
表达是由 CoMVD5s启动子驱动的,且 GUS基因还
含有内含子,只能在真核生物中表达。受体作物为
棕色棉的雄性不育的恢复系G007,在授粉的前
一天傍晚去雄并套袋隔离。去雄时所收集的花粉
C连花瓣F置 4℃备用于次日的转化。
1.2 转化方法
从固体平板上挑取农杆菌单菌落,在液体培养
基中培养,当菌液的 Os600值为 0.5～0.8时,离心
CD000r/mnx,10mnxF收集菌体,重悬于花粉萌发
培养基C50%的蔗糖中含有 400µmol/l硼酸,400
µmol/l硝酸钙和 700µmol/l硫酸镁F中。收集新
鲜花粉于该菌液中浸泡并抽真空C压力:-80Po,
时间:D0mnxF,然后授粉于已去雄套袋隔离的柱头
上,继续套袋隔离直到种子成熟,收获种子备用。
1.3 筛选与检测方法
1.D.1 转化体的抗生素筛选
1.D.1.1 在抗生素培养基上进行种子萌发筛选
实验采用的外源基因CacsBF表达载体含有植物筛
选标记基因:潮霉素抗性基因。将转化处理所获种
子经硫酸脱绒并消毒后,接种于含不同潮霉素浓度
C0my/l,15my/l,D0my/l,50my/l,100my/
lF的 MS培养基中。暗培养 D天后,移至光下C温
度 28℃,光暗比为 16/8F,观察种子的萌发及无菌
苗的生长情况。
1.D.1.2 温室抗生素涂抹筛选 将由抗生素培
养基上筛选获得的抗性苗移栽至温室,为减少因种
子本身而造成的逃逸现象,用叶片涂抹法进行潮
霉素抗性的第二次筛选。以带有 D～5片真叶的对
照棉花C非转基因棉花F的平展子叶为材料,设置潮
霉素梯度浓度液C150my/l,D00my/l,500my/
l,700my/l,1000my/lF,D～5天后观察被涂抹
叶片的敏感性,以选择最适浓度潮霉素,用于转化
体的第 2次筛选。
1.D.2 转化体的 GUS组织化学检测 外源基因
CacsBF载体 pCAMBIA1D01质粒除了潮霉素抗性
B 基金项目:国家转基因植物研究与产业化开发专项CJOOrBr002r10F、国家高技术研究发展计划C86D计划,2001AA212081F和国家教
育部科技研究基金C重大 0114F资助项目
作者简介:李晓,女,1977年生,浙江永嘉县人,硕士研究生,现主要从事植物生物技术研究
RecenvedoxC收稿日期F:2001r08r08EAcceptedoxC接受日期F:2002r0Dr02
基因外,还含有 GUS基因。取二次筛选后转化体
开花后 5天的胚珠及纤维进行 GUS组织化学染色
(GUS染色液参照王关林等)。染色后的组织于脱
色液(70%乙醇:冰醋酸=9:1)中脱色 12h,即可
观察。GUS组织化学检测为第 3次转化体的筛选。
1.3.3 转化体的 PCR检测 取三次筛选获得的
转基因棉花叶片,按 CTAB法提取总 DNA进行
PCR扩增。所用引物序列为专化于木质醋杆菌的纤
维素合成酶基因 acsB的两端序列:
P1:5-GCGCGGATCCGAACCGTGAAAATGGTTTCG-3,
P2:5-CCCCAAGCTTTCGTTTATGGGTCACGACTT-3。
反应总体系为 25µL,2×GCbufferⅠ 12.5µL,
dNTP(浓度为 2.5mmol)4µL,P1和 P2(浓度为 10
mmol)各 1µL,TaqaLA0.2µL,加 ddH2O至 25
µL(PCR试剂盒购于 TaKaRa公司)。反应程序为:
95℃ 5min;然后 94℃ 30s,55℃ 1min,72℃ 2
min共 30个循环;72℃ 10min。以受体恢复系(非
转化体)为对照,对转化体的 PCR产物进行电泳分
析、观察和照相。这是转化体的第 4次检测。
1.3.4 转化体的 Southern杂交检测 用 CTAB
法提取转基因棉花基因组 DNA,取 10µgDNA分
别用 HindⅢ和 BamHⅠ于 37℃酶切过夜,经电泳
分开后转印于尼龙膜,预杂交、杂交和探针的同位
素标记均按 Fermentas试剂盒说明书进行。杂交膜
用 2倍的 SSC、0.1%SDS(5min,2次),以及 0.1
倍的 SSC、0.1%SDS(68℃,15min,2次)的溶液
漂洗后,压 X射线片进行放射自显影后观察结果。
经潮霉素抗性、GUS表达、PCR产物和 Southern
杂交检测均为阳性的转化体,定为转基因棉花。
2 结果与分析
2.1 转化花粉授于柱头后的结铃率、不孕籽率及
转化率
对受体恢复系G007次日欲开花的花蕾进行
人工去雄,去雄花在次日 9:00时左右用经农杆菌
介导处理的花粉授粉。从所结棉铃的性状看,表现
出处理对花粉有较大的损害。由表 1可知,与正常
(未处理)状况相比,采用该方法授粉后的当代棉铃,
虽仍有 22.7%的结铃率,但可能由于在转化过程中
花粉受损,从而使当代棉铃易形成畸型铃(25.2%)
和僵瓣,且僵瓣的棉籽大部分为不孕籽(35.1%)。但
经检测后在获得的后代中其转化率仍有 1.4%。
表 1 经农杆菌感染和介导处理的花粉授于去雄柱头后棉铃性状和转化率
Table1 Thepropertitiesofcottonbolsandthetransformationrateoftheplantsobtained
byvacuuminfiltrationofpolenwithAgrobacteriumtumefaciens
授于柱头的
花粉类型
Differenttypes
ofthepolen
授粉子房数
No.of
polinated
ovary
结铃数
No.of
effective
bol
结铃率
Rateof
effective
bol(%)
畸形铃数
No.of
abnormal
bol
畸形铃率
Rateof
abnormal
bol(%)
不孕籽率
Rateof
aborted
seed(%)
转化率
Transformed
rate
(%)
处理花粉
Polenswith
treatment
942 214 22.7 54 25.2 35.1 1.4
未处理花粉
Polenswith-
outtreatment
327 188 57.5 16 8.5 9.7 -
2.2 转化种子对潮霉素的抗性检测
未转化种子对 15mg/L潮霉素不敏感,依旧能
够发芽和生长,且胚根亦不会褐化,与对照相比只
是生长速度稍慢。30mg/L潮霉素对未转化种子的
发芽已有一定的影响,但有一部分棉花种子还是能
发芽和生长,但胚根褐化,下胚轴生长缓慢。50
mg/L和 100mg/L的潮霉素浓度不论对未转化种
子的发芽还是对苗的生长都有很大的影响,胚根一
接触培养基就立即褐化,胚轴生长停滞。因此,50
mg/L的潮霉素浓度对转化种子进行筛选最为适
宜。本研究采用 50mg/L潮霉素浓度的培养基对收
获的转化种子进行筛选,最后获得了第一次筛选选
取的抗性苗占总数的 7%。(图 1A)
2.3 转化绿苗对潮霉素的抗性检测
为进一步避免假阳性转化苗的存在,本研究对
第一次选取的抗性苗进行了二度抗性筛选。首先确
定涂抹实验中潮霉素的浓度:选取 3～5片真叶的
非转基因棉花苗,涂抹新配制的潮霉素梯度浓度液
(150mg/L,300mg/L,500mg/L,700mg/L,
1000mg/L),3～5天后发现,用 150mg/L的潮霉
017 作 物 学 报 28卷
图 1(A) 种子在含 50mg/L潮霉素培养基上发芽
与生长,抗性苗发芽与生长正常(箭头所示),
非抗性种子发芽后不生长
Fig.1(A) Theseedsweregerminatedinmedium
containing50mg/LHygromycin,andthe
resistantseedlingwasindicated
byanarrow
图 1(B) 用 500mg/L潮霉素溶液涂抹棉叶后的
抗性反应,抗性苗无枯斑(左),非抗
性苗有枯斑(箭头所示)
Fig.1(B) Theseedlingleaveswerescribbledwith
500mg/LHygromycinsolution,andtheseedling
withoutwithereddot(indicatedbyanarrow)
wastheputativetransgenicseedlings
图 2 用农杆菌介导法,含潮霉素抗性基因、GUS基因
和纤维素合成酶基因的 Ti质粒转化棉花花粉,并授粉于去
雄棉花柱头,所获棉花种子和苗,经潮霉素抗性筛
选后,再用 GUS组织化学染色法检测转化体:
阳性反应的胚珠(A)和纤维(B)呈蓝色(箭头
所示),阴性反应不显色
Fig.2 TheGUSactivityassayofthetransgenicplants
A:Theblueovules(indicatedbyanarrow)wasderived
fromtheputativetransgenicplants,andthe
otherswerethenegativecontrol.
B:Thebluefiber(indicatedbyanarrow)wasderived
fromtheputativetransgenicplants,andtheother
wasthenegativecontrol
素溶液涂抹叶片后,未发生明显的反应,300mg/L
的潮霉素溶液涂抹的叶片部分出现了褐色的干枯斑
点,500mg/L的潮霉素溶液涂抹的叶片都出现了
褐色的干枯斑点,700mg/L和 1000mg/L的潮霉
素溶液涂抹的叶片则出现了大范围的干枯坏死斑。
根据此实验结果,本研究选用 500mg/L的潮霉素
溶液进行转化棉花苗的叶片筛选鉴定,弃去一部分
假抗棉苗,留下的无坏死斑的抗性苗 9株(图 1B),
移至田间让其生长发育,以供进一步检测。
2.4 转化体的 PQR表达检测
用于 GUS检测的组织有:开花后 5天的胚珠
和纤维,均取自于第二次潮霉素抗性检测为阳性的
抗性株,其中有 S株被检测植株的组织出现了GUS
阳性(图 2),而对照植株无任何显色反应。
2.T 转化体的 UVW检测
本研究根据专化于木质醋杆菌的纤维素合成酶
基因 XYZ[的序列而设计 \]^ 引物,以质粒 _‘A
为阳性对照,以未转化的棕色棉恢复系为阴性对
照。在获得的GUS阳性植株中,有 a株出现了与质
粒 _‘A相同迁移率的片段,即为 \]^ 阳性植株
(图 3),这表明目的基因确已存在于转化体中。但
经 GUS检测后,仍有 2株无 \]^ 产物,这些 \]^
表现为阴性的可能是由于片段的不完全插入,或者
是没有稳定地插入到植物染色体组中,或是由于在
棉株生长的过程中外源基因的丢失等。
2.b 转化体的 cdefghij杂交检测
该分子杂交以质粒 _‘A为阳性对照,以未转
化的棉花 _‘A为阴性对照,以 XYZ[为探针进行
的。阴性对照未出现任何杂交信号,而 a个转化体
单株都杂交出了与阳性对照相同大小片段的杂交
带,且是一条杂交带,这说明外源基因已整合到棉
花染色体基因组中,且为单拷贝整合。(图k为部分
转化单株)
1175期 李 晓等:农杆菌真空渗透法转化花粉获得棉花转 XYZ[基因植株
图 3 PCR检测 acsB:1为 marker,2为阳性对照,3为阴性
对照,4～8为被检测的转化体,其中 8为假阳性
Fig.3 ThePCRamplificationassayofthetransgenicplants
1.marker,2.plasmid,3.Thenegativecontrol,
4～8Thetransformants图 4 以 acsB基因为探针的 Suthern杂交:1.为阳性
对照,2～3为被检测的转化体,4为阴性对照
Fig.4 TheSouthernhybridizationassayofthe
transgenicplants.1.plasmid,2～3.transformed
plants,4.thenegativecontrol
3 讨论
迄今为止,以花粉为受体的植物转基因已有不
少 的 研 究,但 他 们 大 多 是 采 用 基 因 枪 轰 击
法[1,3,5,9～8,10]或电激法[2,4],还有一部分是直接用
质粒 DNA与花粉相混合然后授粉。尽管以上几种
以花粉为受体的转化都取得了很大的进展,但大多
都只得到 GUS基因的瞬时表达,而未能获得稳定
表达的转基因植株,且其转化和整合的机制还不很
清楚。而利用农杆菌真空渗透法转化植株却仅有一
例,Tjokrokusumoetal.[9]利用该法转化矮牵牛,
并最终获得了转基因植株。该法使用真空渗透,与
不使用相比可以更容易的让农杆菌液渗入花粉,从
而在一定程度上提高了其转化率。本研究在他的基
础上进行了改进应用于棉花遗传转化,结果也支持
该方法在棉花遗传转化中的可行性。
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