全 文 ：第 27 卷 第 6 期 作　物　学　报 V o l. 27, N o. 6
2001 年 11 月 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA N ov. , 2001
水稻 S -c 座位的 PCR 标记精细定位及分子标记辅助选择Ξ
张泽民　张桂权ΞΞ
(华南农业大学植物分子育种研究中心, 广东广州, 510642)
提　要　以粳型品种台中 65 及其近等基因 F 1 不育系 T ISL 5 为材料, 利用 ST S 和 SSL P 标记对水稻
F 1 花粉不育基因座位 S 2c 进行了精细定位, R G227ST S 和RM 218 分别位于 S 2c 的两侧, 与 S 2c 的距离
分别为 0. 3 cM 和 4. 3 cM。通过对 40 个籼、粳和中间型品系标记基因型的鉴定, 分析了分子标记基因
型与 S 2c 基因型之间的关系, 建立了以 PCR 为基础的分子标记辅助选择体系。利用 R G227ST S 和
RM 218 标记对来自 T ISL 5 的 S 2ciöS 2ci 基因型的选择, 准确度达 100%。
关键词　杂种不育性; 基因定位; ST S; SSL P; 栽培稻
F ine M app ing of the S -c L ocus and M arker-a ss isted Selection using
PCR M arkers in R ice
ZHAN G Ze2M in　ZHAN G Gu i2Q uan
(P lan t M olecu lar B reed ing R esearch Cen ter, S ou th Ch ina A g ricu ltu ra l U niversity , Guang z hou , Guang d ong 510642, Ch ina)
Abstract　　To estab lish m arker2assisted select ion (M A S) fo r F 1 po llen sterility locu s S 2c,
the R FL P m arker R G227 w h ich clo sely linked w ith the locu s w as converted to ST S m arker.
A SSL P m arker, RM 218, w as found to link w ith the S 2c locu s. F lank ing S 2c locu s,
R G227ST S and RM 218 w ere 0. 3 cM and 4. 3 cM respect ively aw ay from the locu s. Tw o
alleles a t the R G227ST S locu s and fou rteen a lleles a t the RM 218 locu s w ere detected and
their linkage rela t ion sh ip w ith the S 2c geno types w as iden t if ied. T he tw o PCR m arkers w ill
be u sed fo r m arker2assisted select ion of the geno types a t the S 2c locu s in rice b reed ing
p rogram s.
Key words　　H yb rid sterility; Gene m app ing; ST S; SSL P; O ry z a sa tiva
籼粳亚种间杂种一代具有强大的优势。袁隆平[ 1 ]认为籼粳亚种间的杂种优势是水稻超高
产育种的重要途径之一。张桂权和卢永根[ 2 ]认为籼粳亚种间育种是继矮化育种和品种间杂种
优势利用之后水稻育种的第三次革命。但是籼粳亚种间普遍存在着杂种不育性, 妨碍了籼粳
亚种间杂种优势的利用。如何克服籼粳亚种间的杂种不育性, 前人已经做了大量的探
索[ 3～ 10 ]。张桂权等[ 3～ 7 ]的研究表明, 水稻籼粳亚种间的杂种不育性由多个座位的基因控制。
在这些基因座位上, 籼稻品种通常携带 S iöS i, 粳稻品种通常携带 S j öS j , 在它们之间的杂种
中, S i 基因与 S j 基因互作使携带 S j 基因的雄配子败育。张桂权等[ 3～ 7 ]从栽培稻中已鉴定出 6ΞΞΞ 通信作者
收稿日期: 2000206212, 接受日期: 2001203219
Received on: 2000206212, A ccep ted on: 2001203219基金项目: 国家高技术研究发展计划 (Z16202201) ; 广东省自然科学基金 (960424)作者简介: 张泽民 (1973) , 男, 湖南衡阳市人, 硕士, 从事水稻分子育种研究

个这样的 F 1 花粉不育基因座位, 或称特异亲和基因座位。这 6 个座位是S 2a、S 2b、S 2c、S 2d、
S 2e 和S 2f 。庄楚雄等[ 11, 12 ]利用R FL P 标记把S 2a 座位定位在第 1 染色体上, 把S 2c 座位定位
在第 3 染色体上。本研究通过把与 S 2c 座位紧密连锁的R FL P 标记转变为 ST S 标记, 并筛选
出与 S 2c 座位连锁的 SSL P 标记, 对 S 2c 座位作了精细定位, 并建立了以 PCR 为基础的分子
标记辅助选择体系, 为在育种中有效地选择 S 2c 基因型提供了技术手段。
1　材料和方法
1. 1　材料
定位实验材料为粳型品种台中 65 (简称 T 65) 及其近等基因 F 1 不育系 T ISL 5。T ISL 5 是
以 T 65 作母本, 与籼型品种 Peh2ku 杂交, 然后用 T 65 作轮回亲本经 11 代连续回交育成[ 13 ]。
在 S 2c 座位上, T 65 和 T ISL 5 的基因型分别为 S j öS j 和 S iöS i [ 5, 8 ]。
分子标记辅助选择材料包括 T 65 近等基因系 32 个, 粳型地方品种 10 个, 籼型地方品种
19 个, 中间型品种 (系) 11 个, 共 72 个品种 (系)。这 72 个品种 (系) 在 S 2c 座位的基因型已被
鉴定[ 4, 8 ]。
1. 2　方法
花粉育性鉴定及 F 2 分离群体中可育株和不育株的划分按张桂权和卢永根[ 3 ]的方法进行。
DNA 提取的方法基本采取M u rray 和 T hom p son [ 14 ]的 CTAB 法进行。SSR 扩增按照 Chen
等[ 15 ]的方法进行。ST S 引物按傅延 (私人交流) 提供的 R FL P 标记R G227 的序列设计如下引
物: 正 向 引 物 为 5′ 2T GAA CT TCT GTAA GGCCCT GC23′, 反 向 引 物 为 5′2
A TCT T GGTCGCTCCA CAA GTC23′。PCR 在 PE9700 热循环仪上进行, PCR 扩增产物用
H indË 等内切酶进行酶切。电泳后凝胶成像。
用M A PM A KER öEXP V ER S ION 3. 0[ 16 ]的多点分析作图。
2　结果和分析
2. 1　S -c 座位的 PCR 标记的精细定位
2. 1. 1　F 1 和 F 2 植株的花粉育性　　分析了 F 1 和 F 2 群体的花粉育性 (表 1)。结果表明两个
亲本的花粉育性正常, 而 F 1 的可育花粉率为52. 1% , F 1 败育花粉的形态为染败, 其体积明显
小于正常花粉。F 2 群体可明显划分为可育株和不育株两类, 可育株的平均可育花粉率为
96. 7% , 与亲本相似; 而不育株的平均可育花粉率为 52. 6% , 接近 F 1 的花粉育性。F 2 中可育
表 1　　T65×TISL 5 组合中 F1 和 F2 的花粉育性 (% ±sin - 1)
Table 1　　Pollen fertil ity of F1 and F2 in the cross of T65×TISL 5
花粉类型
T ype of po llen
亲本　Paren ts
T 65 T ISL 5
F1
F2
可育株
Fertile p lan t
不育株
Sterile p lan t
ς2
1F∶1S
FP 98. 3±2. 10 99. 5±1. 72 52. 1±0. 98 96. 7±1. 79 52. 6±1. 71 0. 21
SA P 0. 1±1. 87 0. 1±1. 87 47. 5±1. 07 2. 6±5. 26 47. 3±3. 58 P> 0. 5
EA P 1. 6±1. 78 0. 4±1. 65 0. 4±1. 30 0. 7±2. 40 0. 1±1. 23
N 25 25 4 90 84
　　注 (N o te) : FP = 可育花粉 (Fert ile Po llen) ; SA P = 染败花粉 (Stainab le abo rtive po llen) ; EA P = 空败花粉 (Emp ty
abo rtive po llen)
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株与不育株的分离符合 1∶1。这一结果与前人观察的结果[ 3, 5 ]是一致的。
2. 1. 2　亲本间的多态性分析
2. 1. 2. 1　ST S 分析　　利用R G227ST S 进行 PCR 扩增, 双亲的 PCR 产物无多态性, 分子
量均约 700 bp。利用内切酶H indË、S caÉ 和H aeË 分别对 PCR 产物进行了酶切。在H indË 酶切产物中产生了多态性, 其中 T 65 的扩增产物被切成约 200 bp 和 500 bp 的两条带, 而
T ISL 5 的扩增产物没有被酶切 (图 1)。
2. 1. 2. 2　SSL P 分析　　根据 S 2c 座位的R FL P 定位的结果[ 11 ] , 从 SSL P 图谱[ 17 ]中选择 S 2c
座位附近区段的 4 个 SSL P 标记RM 251、RM 232、RM 218 和RM 7, 对 T 65 和 T ISL 5 作多态
性筛选, 结果 RM 218 在 T 65 和 T ISL 5 之间出现了多态性。T 65 的扩增片段的长度小于
T ISL 5 扩增片段的长度 (图 2)。
图 1　　T 65 和 T ISL 5 的RG227ST S 扩增产物
经H indË 酶切产生的多态性
F ig. 1　　T he po lymo rph ism detected
from RG227ST S p roducts of T 65
and T ISL 5 digested by H ind Ë 图 2　　T 65 和 T ISL 5 在RM 218 扩增产物的多态性F ig. 2　　T he po lymo rph ism of theamp lified p roducts of RM 218from T 65 and T ISL 5
表 2　　 (T65×TISL 5) F2 群体中分子标记基因型的分离
Table 2　　Segregation of marker genotypes in F2
population from the cross of T65×TISL 5
标记
M arker
基因型　Geno type
1 2 3
RG227ST S 2 84 88
RM 218 3 86 85
　　注 (N o te) : 1= T 65 的纯合基因型 (Homozygous fo r
T 65 allele) ; 2= 杂合体 (H eterozygous) ; 3= T ISL 5
的纯合基因型 (Homozygous fo r T ISL 5 allele)。
2. 1. 3　R G227ST S 和 RM 218 标记在 F 2 群体
中的偏态分离　　分析了两个标记R G227ST S
和RM 218 在 F 2 群体中基因型的分离。两个标
记 R G227ST S 和 RM 218 的基因型在 F 2 群体
中出现了偏态分离 (表 2)。在 174 株的 F 2 群体
中, R G227ST S 座位上与 T 65 相同基因型的纯
合体只有 2 株, 而与 T ISL 5 相同基因型的纯合
体却有 88 株。RM 218 座位上与 T 65 相同基因
型的纯合体只有 3 株, 而与 T ISL 5 相同基因型
的纯合体却有 85 株。但是, F 2 群体中纯合基
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因型植株与杂合基因型植株的比率符合 1∶1 (ς 2= 0. 21, P> 0. 5)。这是由于在 S 2c 座位上,
S 2ci 和 S 2cj 等位基因互作使携带 S 2cj 基因的雄配子败育的结果[ 5 ]。
图 3　　T 65×T ISL 5 组合 F2 群体中, 花粉育性与RG227ST S 标记基因型的共分离
F ig. 3　　Co segregation of the pheno type and RG227ST S geno type in the F2 population from the cro ss T 65×T ISL 5
注 (N o te) : F= 可育 (Fert ile) ; S= 不育 (Sterile) ; 1= 带型与 T 65 一致 (homozygous fo r T 65 allele) ;
2= 杂合带型 (heterozygous) ; 3= 带型与 T ISL 5 一致 (homozygous fo r T ISL 5 allele) ;
M = 分子量标记 (M arker fo r mo lecu lar w eigh t)
图 4　　水稻第 3 染色体上两个
PCR 标记和 S 2c 座位的连锁图
F ig. 4　　T he linkage m ap of the
two PCR m arkers and S 2c
locus on rice ch romo som e 3
2. 1. 4　S 2c 座位与 PCR 标记之间的连锁分析　　分析了 T 65
×T ISL 5 的 174 株的 F 2 群体中 S 2c 座位与 R G227ST S 和
RM 218 标记之间的连锁关系 (图 3)。结果显示, R G227ST S
与 S 2c 座位之间除 1 株发生重组外, 173 株呈共分离。而
RM 218 与 S 2c 座位之间, 除 14 株发生重组外, 160 株呈共分
离。用M A PM A KER öEXP 3. 0[ 16 ]分析表明, 标记R G227ST S
和RM 218 与 S 2c 之间的距离分别是 0. 3 cM 和 4. 3 cM , 它们
分别位于 S 2c 的两侧 (图 4)。
2. 2　S -c 座位基因型的分子标记辅助选择
2. 2. 1　杂交后代的分子标记辅助选择　　分析了来自T ISL 2
×T ISL 5、T ISL 4×T ISL 5 和 T ISL 24×T ISL 25 三个组合共
32 个近等基因系的 R G227ST S 和 RM 218 的标记基因型。这
32 个品系在 S 2c 的基因型全部为 S iöS i [ 8 ]。对这 32 个近等基
因系的标记基因型与亲本的标记基因型进行比较, 发现这 32
个品系无论在 R G227ST S 还是在 RM 218 的基因型均与
T ISL 5 相同。也就是说, 在这些品系中, 这两个标记的基因型
与S 2c 的基因型是完全一致的, 均来源于 T ISL 5。用这两个标
记检测 S 2c 基因型的符合率达 100%。
2. 2. 2　水稻种质资源中 S 2c 基因型的分子标记辅助筛选　　
在水稻不同类型的 40 个品种 (系) 中, RM 218 共检测出 14 个
等位基因 (图 5) , 而 R G227ST S 共检测出 2 个等位基因 (图
1)。RM 218 的 14 个等位基因分别编号为 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,
7076 期　　　　　　张泽民等: 水稻 S 2c 座位的 PCR 标记精细定位及分子标记辅助选择　　　　　　　　　

8, 9, 10, 11, 12, 13 和 14。这 14 个等位基因扩增片段的长度大约在 110 bp 到 200 bp 之间。
R G227ST S 的 2 个等位基因分别编号为 1 和 2 (与T 65 相同的带型为 1, 与 T ISL 5 相同的带型
为 2)。
根据这 40 个品种 (系)在 S 2c 座位的基因型的鉴定结果[ 4 ] , 可以分析标记基因型与 S 2c 座
位基因型之间的关系。在这些材料中, RM 218 的 1、4、6、8、10 和 12 等位基因与 S 2ci 连锁,
RM 218 的 2、3、11、13 和 14 等位基因与 S 2cj 连锁, 而RM 218 的 5、7 和 9 等位基因与 S 2ci
和S 2cj 都存在连锁关系。R G227ST S 座位上的等位基因 1 只与S 2cj 连锁, 而等位基因 2 与S 2
c
i 和 S 2cj 都存在连锁关系。根据这种连锁关系, 可以利用 RM 218 和 R G227ST S 标记对水稻
种质资源中 S 2c 座位的基因型作辅助筛选。
图 5　　RM 218 座位的 14 个等位基因的带型
F ig. 5　　Band patterns of the 14 alleles at the RM 218 locus
注 (N o te) : 1, 2, 3, ⋯⋯, 14 表示等位基因的编号 (1, 2, 3, ⋯⋯, 14 are allele num bers)
3　讨论
庄楚雄[ 11 ]利用R FL P 标记对 S 2c 座位进行了定位。在这项研究中, R G227 与 S 2c 座位的
距离为 0。本研究将 R G227 的 R FL P 标记转换成了 ST S 标记。利用 174 株的 F 2 群体作图,
R G227ST S 与S 2c 座位的遗传距离为 0. 3 cM , 表明R G227 与S 2c 座位是有一定距离的。这一
结果更精确地反映了R G227 与 S 2c 座位的线性关系。同时在 S 2c 座位的另一侧的 4. 3 cM 处
还找到了 SSL P 标记RM 218。本研究的结果既丰富了与 S 2c 座位紧密连锁的分子标记, 又将
操作简单的 PCR 标记引入到 S 2c 座位的连锁图中, 为S 2c 座位的图位克隆提供了更加准确和
简便的检测手段。
水稻微卫星遗传图谱的建立[ 15, 17 ]和 ST S 标记的发展[ 18 ] , 为水稻重要基因的 PCR 标记定
位和以 PCR 为基础的分子标记辅助选择体系的建立奠定了基础。以 PCR 为基础的分子标记
辅助选择技术是分子育种的关键技术, 它具有操作简单、花费少、稳定性高等优点, 符合育种
过程中大规模检测的要求。本研究筛选到两个与 S 2c 座位紧密连锁的 PCR 标记, 建立了以
PCR 为基础的分子标记辅助选择的技术体系, 这一技术体系可以应用于水稻粳型亲籼系[ 7 ]的
选育中, 用来辅助选择 S 2c 座位的基因型, 以加速粳型亲籼系的选育。同时, 本研究明确了
R G227ST S 和RM 218 不同等位基因与 S 2c 基因型之间的关系, 这一结果可以用于水稻种质
资源中 S 2c 座位基因型的辅助筛选。本研究用于建立分子标记辅助选择体系的 40 个品种
(系) 虽然具有较广泛的来源, 但如果扩大材料范围, 将有可能检测到更多的分子标记等位基
因, 这将进一步提高R G227ST S 和RM 218 用于水稻种质资源中S 2c 座位基因型检测的准确性。
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参　考　文　献
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3　张桂权, 卢永根. 中国水稻科学, 1989, 3 (3) : 96～ 105
4　张桂权, 刘桂富, 杨进昌等. 植物遗传理论与应用研讨会论文集, 1990, 361～ 364
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6　张桂权, 卢永根. 遗传学报, 1993, 20 (3) : 222～ 228
7　张桂权, 卢永根, 刘桂富等. 遗传学报, 1993, 20 (6) : 541～ 551
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《中国农学通报》 双月 大 16 开 108 5 100026
《中国农业资源与区划》 双月 大 16 开 64 5 自办发行 100081
9076 期　　　　　　张泽民等: 水稻 S 2c 座位的 PCR 标记精细定位及分子标记辅助选择