全 文 ：　　　
第 27 卷 第 6 期 作　物　学　报 V o l. 27, N o. 6
2001 年 11 月 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA N ov. , 2001
根癌农杆菌介导的甘薯遗传转化及转基因植株的再生Ξ
高　峰1　龚一富1　林忠平2　王小佳3
(1西南师范大学生命科学学院, 重庆 400715; 2 北京大学生命科学学院, 北京 100816; 3 西南农业大学园艺系, 重庆
400716)
提　要　以甘薯优良品种“新大紫”的茎尖培养再生植株为试材, 经根癌农杆菌介导将甘薯块根贮藏蛋
白启动子 (Spo ram in p romo ter)调控下的 10 kD 玉米醇溶蛋白基因导入到“新大紫”中, 并获得了转化植
株。甘薯品种“新大紫 ”再生植株的茎切段, 与携带有表达载体质粒 pSP10Z 的根癌农杆菌菌株LBA
4404 共培养后, 在含 75 m göL 卡那霉素 (Kan) 的筛选培养基上可产生抗性芽, 最高频率达 6. 2%。其
中, 32. 1% 的抗性芽可在含 100 m göL Kan 的培养基上生根, 从而形成转化植株。PCR 和 PCR 2
Sou thern 检测证实, 10 kD 玉米醇溶蛋白基因已导入并整合到甘薯品种“新大紫”的基因组中。
关键词　玉米醇溶蛋白基因; 根癌农杆菌; 转化; 甘薯
Agrobacter ium -m ed ia ted Genetic Tran sforma tion of Ipom oea ba ta ta s
and Regenera tion of Tran sgen ic Plan ts
GAO Feng1　GON G Y i2Fu1　L IN Zhong2P ing2 and W AN G X iao2J ia3
(1 S chool of L if e S cience, S ou thw est Ch ina N orm al U niversity , Chong qing 400715; 2 S chool of L if e S cience, P ek ing
U niversity , B eij ing 100816; 3D ep artm en t of H orticu ltu re, S ou thw est A g ricu ltu ra l U niversity , Chong qing 400716)
Abstract　　 In th is paper, the p lan t lets of sw eet po ta to ( Ip om oea ba ta tas L am. ) cv.
X indazi, ob ta ined by shoo t2t ip cu ltu re, w ere u sed as test m ateria l, the 10 kD z ein gene
regu la ted by spo ram in p rom o ter w as in troduced in to sw eet po ta to cv. X indazi by
A g robacterium 2m edia ted genet ic t ran sfo rm at ion, and som e tran sgen ic p lan ts w ere ob ta ined.
Excised stem s of sw eet po ta to cv. X indazi w ere co2cu ltu red w ith A . tum ef aciens st ra in LBA
4404 harbo ring a p lasm id pSP10Z, som e kanam ycin2resistan t (K an r) buds w ere fo rm ed on
the select ion m edium , w h ich con ta ined 75 m göL kanam ycin. T he frequency cou ld reach as
h igh as 6. 2%. 32. 1% of kanam ycin2resistan t buds roo ted on the m edium con ta in ing 100
m göL kanam ycin, and then fo rm ed perfect p lan ts. T he resu lts of PCR and PCR 2Sou thern
ana lysis confirm ed tha t the 10 kD z ein gene w as tran sferred and in tegra ted in to the genom e
of tran sgen ic p lan ts of sw eet po ta to cv. X indazi.
Key words　　z ein gene; A g robacterium tum ef aciens; T ran sfo rm at ion; Ip om oea ba ta tas
甘薯 ( Ip om oea ba ta tas L am. ) 的蛋白质品质改良已成为当前国内外甘薯品质育种的三大
主攻方向之一[ 1 ]。植物基因工程的兴起, 使人们可以通过将经修饰的或全新的高必需氨基酸
基因 (H EA A E ) 导入甘薯的基因组中, 以培育出营养价值更高, 各类氨基酸配比更合理的甘Ξ 国家自然科学基金资助项目 (批准号 39670471)和重庆市科委资助项目
收稿日期: 1999212213, 接受日期: 2001203213
Received on: 1999212213, A ccep ted on: 2001203213

薯新品种或新类型。Dodds 等用改建的发根农杆菌R i 质粒介导, 将人工合成的高必需氨基酸
基因导入甘薯, 经 Sou thern 吸印杂交, 证实外源 H EA A E 已转入并整合到甘薯的基因组
中[ 2～ 3 ]。
玉米醇溶蛋白是玉米籽粒形成过程中合成的一组贮藏蛋白, 其主要成分包括 27 kD、22
kD、19 kD、15 kD 及 10 kD 等多肽。其中, 10 kD 玉米醇溶蛋白中甲硫氨酸分子数占 21% ,
半胱氨酸分子数占 3. 9% , 就分子数而言, 含硫氨基酸占 25% [ 4 ]。王广立等用 PCR 技术从我
国玉米品系“中丹 120”中克隆出了 10 kD 玉米醇溶蛋白基因 (10 kD z ein gene) 的编码区[ 5 ]。
本文旨在将置于甘薯块根贮藏蛋白启动子 (Spo ram in p rom o ter) 调控下的 10 kD 玉米醇溶蛋
白基因导入甘薯基因组中, 为用基因工程技术进行甘薯的蛋白质品质改良开辟新的途径。
1　材料与方法
1. 1　植物材料
供试的植物材料为甘薯品种“新大紫”, 是从夹沟大紫×华北 52- 45 的杂交后代中选育
而成, 为一种食用和制粉用的甘薯优良品种[ 6 ]。本试验以“新大紫”的无菌试管苗为试材, 系由
茎尖培养并经体细胞胚胎发生获得的离体再生植株 (中国农业大学刘庆昌教授惠赠)。“新大
紫”无菌试管苗在无激素的固体M S 培养基上离体扦插繁殖。
1. 2　菌株及其质粒
本试验所用的根癌农杆菌 (A g robacterium tum ef aciens) 为携带表达载体质粒 pSP10Z 的
菌株LBA 4404。质粒 pSP10Z 含筛选标记基因新霉素磷酸转移酶基因 (np t2Ê ) 和甘薯块根贮
藏蛋白基因的启动子 (P sp )调控下的 10 kD 玉米醇溶蛋白基因。质粒pSP10Z 的结构如图 1 所
示。
图 1　　质粒 pSP10Z 的结构图
F ig. 1　　Structure of vecto r p lasm id pSP10Z
1. 3　甘薯外植体的感染与再生
1. 3. 1　诱芽和生根选择压的确定　
　诱芽选择压的确定: 无菌条件下,
将“新大紫”无菌试管苗的茎、叶柄和
叶片切成长约 0. 5 cm 的切段 (茎段带
节) 或 0. 5 cm ×0. 5 cm 的切块, 分别
接种于附加 0、 25、 50、 100、 150
m göL Kan 的诱芽培养基 (M S +
1 m göL NAA , 简写为M SN )。培养 3
周后, 调查试验结果并确定抑制芽分
化的最低 Kan 浓度。
生根选择压的确定: 切去“新大
紫”无菌试管苗的根部后, 将其插入
附加 0、25、50、100、150 m göL Kan
的无激素M S 培养基。培养 3 周后, 调查试验结果并确定抑制生根的最低 Kan 浓度。
1. 3. 2　根癌农杆菌菌液的准备　　将含有质粒 pSP10Z 的农杆菌接种于附加 100 m göL Kan
+ 100 m göL Sm (链霉素) + 50 m göL R if (利福平)的 YEB 培养基中, 28℃振荡培养 15 小时左
右。用液体M SN 培养基稀释菌液, 使OD 600值达 0. 3 或 0. 6。
257　　　　　　　　　　　　　　　　　作　　物 　　学　　报　　　　　　　　 　　　　　　　　27 卷

1. 3. 3　外植体的感染和转化体的再生　　无菌条件下, 将“新大紫”无菌试管苗的茎、叶柄
和叶片切成长约 0. 5 cm 的切段 (茎段带节) 或 0. 5 cm ×0. 5 cm 的切块。以其为感染外植体,
比较了不同感染处理对外植体形成 Kan r 芽的影响。试验共 6 种处理 (表 1)。
表 1　　不同感染处理
Table 1　　Var ious treatmen ts for infection
处理
T reatm ent
菌液浓度
Bacterial
concentration
(OD 600)
共培养时间 (天)
D uration
of co2cu ltu re
(days)
共培养条件
Condition
of co2cu ltu re
1 0. 1 2 黑暗　D ark
2 0. 3 2 　　　D ark
3 0. 1 4 　　　D ark
4 0. 3 4 　　　D ark
5 0. 1 2 光照　L igh t
6 0. 3 2 　　　L igh t
　　其中, 感染和筛选的基本操作步
骤为, 外植体在根癌农杆菌菌液中浸
泡 3～ 5 分钟后, 用无菌滤纸吸干表
面菌液, 并转移至固体M SN 培养基
上共培养, 培养温度为 28±1℃。共
培养后, 外植体直接转入筛选培养
基。筛选培养基为含 75 m göL Kan 和
500 m göL 羧苄青霉素 (Carben icillin,
Cb)的M SN 培养基。
经上述感染和筛选处理的外植体
在筛选培养基上继续进行筛选, 并每
隔 2～ 3 周转接一次。光照条件下的共培养和所有的筛选处理均在L RH 22500G 型恒温光照培
养箱内进行, 培养温度为 28±1℃, 每日光照 16 小时, 光照强度为 2000 lx。感染 6 周后, 统计
试验结果, 并将外植体上长度在 1 cm 以上的抗性芽切下, 扦插于成苗培养基 (M S+ 50 m göL
Kan+ 500 m göL Carb, 简写为M SKCb) , 以使抗性芽抽长和生根。
1. 4　转化植株的鉴定
1. 4. 1　10 kD z ein 基因的 PCR 检测　　切取待检测植株和对照植株的茎段, 分别转接于含
抗生素或无抗生素的成苗培养基中, 使其进一步繁殖, 而将其叶片、叶柄和根用于提取植物
总DNA。提取方法为改良CTAB 法[ 7 ]。
参照 Sam b rook 等[ 8 ]的方法进行 PCR 检测, 试材包括随机抽取 9 株 Kan 抗性植株 (编号
L 1～ 9) , 并设阳性 (质粒 pSP10Z DNA 为模板) 和阴性对照 (未感染的新大紫DNA 为模板)。
PCR 的反应体积为 25 ΛL , 反应参数为: 94℃ 10 m in→94℃ 45s, 56℃ 45s, 72℃ 1 m in (30 次
循环)→72℃ 10m in。反应终止后, 经溴乙锭2琼脂糖电泳并摄影记录。
1. 4. 2　10 kD z ein 基因的 PCR 2Sou thern 检测　　PCR 反应产物经溴乙锭2琼脂糖电泳后,
将DNA 转移至带电荷的尼龙膜 (M o lecu lar Sigm a B io logy 公司产品)。以 (Α232P) dA T P 标记
的 10 kD z ein 基因为探针, 进行分子杂交, 经 2×SSCö0. 1% SD S 及 1×SSCö0. 1% SD S 洗
膜, 用X 感光片压片[ 8 ]。
2　结果与分析
2. 1　甘薯离体遗传转化基本条件的确定
2. 1. 1　选择压的确定　　经对不同浓度 Kan 下外植体的诱芽率和生根率进行比较后发现,
Kan 对诱芽的抑制明显强于其对生根的抑制, 50 m göL 的Kan 对芽的诱导具有明显的抑制作
用, 75 m göL 的 Kan 可完全抑制芽的产生。对于生根的抑制, 表现出明显抑制作用的 Kan 浓
度为 100 m göL。因此, 本试验将芽诱导和根分化的 Kan 选择压分别确定为 75 m göL 和
100 m göL。
3576 期　　　　　　　　高　峰等: 根癌农杆菌介导的甘薯遗传转化及转基因植株的再生　　　　　　　　　

图 2　　甘薯品种“新大紫”的茎切段与
农杆菌菌株LBA 4404öpSP10Z 共培养后,
在含 Kan (75 m göL )的培养基上茎切段
的切口处产生出 K an r 芽
F ig. 2　　A fter co2cu lt ivation w ith A g robacterium
tum ef aciens LBA 4404öpSP10Z, an excised shoo t
fo rm ed a K an r bud from its wounded cutt ing site
on the m edium contain ing kanam ycin (75 m göL ) 2. 1. 2　外植体类型影响　　新大紫无菌试管苗的茎、叶柄和叶片的切段或切块经根癌农杆菌菌液感染后,其在抑菌和筛选培养基上的表现是不同的。培养 4 周后, 感染后的叶柄和叶片的切段或切块, 虽获得了一些抗性愈伤组织, 但未获得抗性芽的再生; 而感染后的茎段在切口处即出现肉眼可见的小的抗性芽 (图 2)。2. 2　抗性芽的获得在本试验的所有感染处理中, 由叶柄切段或叶片切块均未获得 K an r 芽, 而仅由茎段外植体获得了K an r 芽。因此, 本文主要报道由感染茎段所获得的结果, 并初步比较了不同感染处理对甘薯品种“新大紫”茎段外植体再生 K an r 芽的影响。试验结果表明 (表 2) , 菌液浓度、共培养时间和共培养条件对 K an r 芽的获得率有较大的影响。菌液浓度太低, 在共培养未见到外植体四周出现菌液, 经在含 Kan 的培养基上筛选后, 获得的也较少。然而,共培养时间太长 (4 天) 或在黑暗条件下进行共培养,
常会因残留在外植体表面的根癌农杆菌生长过旺, 以
至掩埋整个外植体。随后即使再用含 500 m göL Carb 的液体M S 培养基洗涤, 也难以彻底除
菌, 并最终导致外植体变褐并死亡。因此, 经这些处理 (处理 1～ 4)获得的 K an r 芽的数量和频
率均很低。
表 2　　不同感染处理对甘薯品种“新大紫”茎段
外植体再生 Kan r 芽的影响
Table 2　　Effects of infection treatmen ts on the
frequency of Kan r shoot regeneration from
stem explan ts of sweet potato cv. “Xindaz i”
N o. of
infection
treatm ent
N o. of
exp lan ts
infected
N o. of exp lan ts
p roducing
K an r shoo ts
and frequency (% )
N o. of
K an r
shoo ts
1 178 0 (- ) 0
2 185 3 (1. 6) 3
3 182 0 (- ) 0
4 176 4 (2. 3) 5
5 167 7 (4. 2) 7
6 193 12 (6. 2) 13
　　观察和统计结果表明, 用OD 600 = 0. 3 的
菌液, 共培养 2 天且在光照条件下进行共培养
(处理 6) , 既有效地防止了根癌农杆菌的过度
生长, 又有利于茎段外植体的成活及抗性芽的
萌动与生长。按感染的外植体总数计, 抗性芽
的获得率为 6. 2%。
2. 3　抗性植株的再生
长度在 1 cm 以上的抗性芽插入至成苗培
养基 (M SKCb) 上培养。2 周后发现, 在获得的
28 个 K an r 芽中, 有 19 个 K an r 芽因未能生根
而逐渐死亡, 有 5 个 K an r 芽在其节上和切口
处生长出不定根, 从而再生成完整的 K an r 植
株, 成苗率为 32. 1%。K an r 植株在含 100
m göL Kan 的培养基上生长正常, 只是与未转化的对照植株相比, 叶色较浅 (图 3)。
2. 4　Kan r 植株的 PCR 和 PCR-Southern 检测
PCR 扩增产物的电泳分析结果表明, 待鉴定的 9 株 K an r 植株中, 有 5 株的DNA 能扩增
出分子量约为 450 bp 的特异条带, 阳性率为 55. 6% ; 而未转化的对照植株及其余的 K an r 植
株则无此条带, 从而初步证明这 5 株 K an r 再生植株为转基因植株。PCR 2Sou thern 检测结果
457　　　　　　　　　　　　　　　　　作　　物 　　学　　报　　　　　　　　 　　　　　　　　27 卷

图 3　　甘薯品种“新大紫”的 K an r 植株
F ig. 3　　K an r p lan tlet of sw eet
po tato cv.“X indazi”
表明, 5 株K an r 再生植株的 PCR 扩增条带均可特异性
地与 10 kD z ein 基因的探针杂交, 阳性率为 100% ; 而
对照植株及 PCR 阴性的 K an r 植株的扩增产物却无此
杂交带 (图 4)。由此证明了 PCR 扩增出的条带确为目
的基因 (10 kD z ein gene) , 同时进一步证实了此目的基
因已被导入并整合到转化植株的基因组中。
3　讨论
甘薯大部分品种块根中的蛋白质含量为 4. 4%～
5. 2% [ 9 ]。主要由两类蛋白质组成: 块根贮藏蛋白
(Spo ram in) 和 Β2淀粉酶。前者占块根总可溶性蛋白的
60%～ 80% ; 后者占 5% 左右[ 10 ]。甘薯的蛋白质含量较
图 4　　甘薯转化植株中 10 kD 玉米醇溶
蛋白基因的 PCR 2Southern 检测。
A. 阳性对照 (质粒 pSP10Z) ; B. 阴性对照
(未转化植株) ; C～ K. 拟转基因植株。
F ig. 4　　PCR 2Southern assay of 10 kD z ein
gene in transfo rm ed p lan ts of sw eet po tato
A. Po sit ive contro l (p lasm id pSP10Z) ; B. N egative
contro l (un transfo rm ed p lan t) ; C～ K.
Putative transgenic p lan ts
低, 故常将甘薯和大豆或鱼粉配合, 以组成
一种营养全面的理想食品或饲料。以杂交育
种为主的传统育种技术虽然在甘薯的品种
改良中取得了巨大的成就, 但由于甘薯在遗
传上高度杂合, 同时具有染色体的高倍性、
自交不亲和及远缘杂交困难等特性, 从而使
其在某些单一性状 (营养组成、抗性等) 的改
良中, 显得既费工费时, 又成效甚微。植物
基因工程的兴起和迅猛发展, 使其成为在短
期内改良由单基因或寡基因控制的质量性
状的一条有效途径。
关于甘薯的离体遗传转化方法, 国内曾
进行了野生型根癌农杆菌或发根农杆菌感
染甘薯[ 11～ 12 ]和用电激法观察GU S 基因在甘
薯原生质体中的瞬间表达[ 13 ] 方面的研究,
但均未获得转基因再生植株, 并且均是以摘
要形式发表。国外也先后开展了用根癌农杆
菌介导法、电激法和微弹轰击法离体遗传转
化甘薯, 但只有用根癌农杆菌介导法获得转基因甘薯植株, 并将人工合成的高必需氨基酸基
因 (H EA A E ) 导入到甘薯栽培品种中[ 3, 14 ]。将组织或器官特异性表达启动子与天然贮藏蛋白
基因融合并进行甘薯的遗传转化研究, 国内外迄今尚未见报道。在马铃薯中的研究表明, 采
用组织特异性表达启动子及天然外源基因是最终实现用基因工程方法进行马铃薯块茎营养改
良的关键措施之一[ 15 ]。
在植物离体遗传转化中, 选择压是直接影响转化子筛选和转化效率的主要因子之一。
Carelli 等的研究表明, 浓度为 50 m göL 的卡那霉素可完全抑制甘薯品种“宝石”叶外植体上
愈伤组织的形成, 浓度为 5 m göL 或 10 m göL 的卡那霉素可使芽的再生减少, 而浓度为
25 m göL 时, 芽再生完全被抑制。对于根的发育, 卡那霉素的浓度需达 100 m göL [ 16 ]。Gam a 等
5576 期　　　　　　　　高　峰等: 根癌农杆菌介导的甘薯遗传转化及转基因植株的再生　　　　　　　　　

在甘薯品种“白星”胚性愈伤组织的离体遗传转化研究中也发现, 抑制愈伤组织产生胚状体的
卡那霉素浓度为 25 m göL , 以 25 m göL 的卡那霉素作为选择压, 最终获得了转基因植株[ 17 ]。
本研究的结果表明, 甘薯品种“新大紫”对卡那霉素的耐性较强, 这可能是由于品种的差异以
及感染外植体是由茎尖培养并经体细胞胚胎发生获得的再生植株的缘故。
值得注意的是, 本试验获得的 K an r 芽在含 Kan 的成苗培养基上的生根率及 PCR 阳性率
均较低 (分别为 32. 1% 和 55. 6% )。这表明, 经 1～ 2 次筛选后, K an r 芽中转化细胞与非转化
细胞的“嵌合现象”还比较严重, 以致“逃逸芽”的比例仍较高。其原因可能与本试验中获得的
K an r 芽是通过离体器官发生途径 (即多细胞起源)产生的有关。因此, 采用本试验的感染和筛
选方法, 虽然获得了甘薯转基因植株, 但此操作程序尚需进一步优化。此外, 采用甘薯胚性愈
伤组织作为转化受体不失为另一条有效途径[ 17 ]。
本文报道了甘薯块根贮藏蛋白基因启动子调控下的高必需氨基酸基因已被导入到甘薯优
良栽培品种的基因组中, 并获得了经分子生物学检测与鉴定的转基因植株。这是国内关于获
得甘薯转基因植株及将外源目的基因导入甘薯的首篇报道。已有的研究表明, 甘薯块根贮藏
蛋白基因启动子在田间栽培植株中仅在块根中专一性启动表达, 而在离体培养或高浓度蔗糖
处理条件下, 它可在块根以外的器官中被诱导表达[ 18 ]。因此, 本研究结果, 一方面可为实现
外源基因在转基因甘薯的组织或器官中特异性表达及表达产物的组织或器官特异性积累奠定
基础; 另一方面, 可为研究此启动子的基因调控模式提供试验体系。目前, 外源基因在“新大
紫”转基因植株中的表达状况及遗传稳定性正在进一步研究之中。
参　考　文　献
1　陆漱韵, 刘庆昌, 李惟基. 甘薯育种学, 北京: 中国农业出版社, 1998. 249～ 283
2　Dodds J , C M erzdo rf, V Zam brano, C Siguβenεas. In: Sw eetp ota to P estM anag em en t: A G loble P ersp ective. Jansson R K
and K V Ram an (Eds. ). W estview , Boulder, CO. 1991. 203～ 219
3　Dodds J H , J Benavides, F Buitron, et a l. In: Sw eetp ota to T echnology f or the 21st Cen tu ry , H illW A. C K Bonsi and
P A L o retan (Eds. ) , T uskegee U niversity, T uskegee. AL. U SA. 1992. 7～ 19
4　张德颐, 朱治平. 植物分子生物学与生物工程. 北京: 科学出版社, 1991
5　王广立, 潜忠兴, 林忠平. 植物学报, 1993, 35 (7) : 547～ 551
6　江苏徐州甘薯研究中心. 中国甘薯品种志, 北京: 农业出版社, 1993. 76
7　Doyle P. F ocus, 1990. 12: 13～ 15
8 　Sam brook J , E F F risch, T M aniatis. M olecu lar C lon ing: a L abora tory M anua l ( 2nd ed. ) , Co ld Sp ring H arbo r
L abo rato ry P ress. 1989
9　L i L. In: P roc. of 1 st In ter. S ym o. on Sw eet P ota to, 1982. 345～ 354
10　N akam ura K. In: Sw eetp ota to T echnology f or the 21st Cen tu ry. H ill W A , C K Bonsi and P A L o retan (Eds. ) ,
T uskegee U niversity, T uskegee, AL , U SA , 1992. 20～ 26
11　朱宝成, 王俊刚, 李庆余. 植物生理学通讯, 1991. 16: 310
12　Sun M , P Y L iu. In: P roc. of the lst Ch inese2J ap anese S ymp. on Sw eetp ota to and P ota to. L iu Q C and T Kokubu
(Eds. ) , Beijing: Beijing A gro. U niv. P ress, 1995. 386
13　Xue Q H. In: P roc. of the 1st Ch inese2J ap anese S ymp. on Sw eetp ota to and P ota to. L iu Q C and T Kokubu (Eds. ) ,
Beijing: Beijing A gro. U niv. P ress, 1995. 386～ 387
14　高　峰. 中国甘薯 , 1996. 8: 132～ 137
15　双　宝, 吕文河. 马铃薯杂志, 1996. 10 (1) : 49～ 54
16　CarelliM L D , D E Sk irvin, D E H arry. In: Sw eetp ota to Technology f or the 21st Centu ry. H illW A , C K Bonsi and P
A L o retan (Eds. ) , T uskegee U niversity, T uskegee, AL , U SA , 1992. 52～ 60
17　Gam a M I C S, R P J r. L eite, A R Co rdeiro, et a l. P lan t Cell, T issue and O rg an Cu ltu re, 1996. 46: 237～ 244
18　N akam ura K, M O h to, N Yo sh ida, K N akam ura. P lan t P hy siol, 1991. 96: 902～ 909
657　　　　　　　　　　　　　　　　　作　　物 　　学　　报　　　　　　　　 　　　　　　　　27 卷