全 文 ：第26卷 第4期 作　物　学　报 V ol. 26, N o. 4
2000 年7月 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA July, 2000
过氧化物酶同工酶与棉花黄萎病抗性的相关研究X
马峙英1　刘叔倩1　王省芬1　张桂寅1　孙济中2　刘金兰2
(1河北农业大学, 河北保定 071001; 2华中农业大学, 湖北武汉 430070)
提　要　对20个来源及抗性不同的海岛棉和陆地棉品种和2个陆地棉 (S) ö 海岛棉 (R ) 杂交组合的亲本、
F 1、F 2世代的 POX 同工酶研究表明, 接种黄萎病菌前后, 棉花叶片中的 POX 同工酶酶谱发生明显变
化, 抗病品种与感病品种的阴性 POX 同工酶谱带均由原来的3条增至6条, 但两者之间不存在明显差
异; 阳性 POX 同工酶谱带接种前后均只有1条 (POX2PC1) , 抗病品种接种前后该酶带无明显变化, 而
感病品种接种后活性增强。遗传分析表明, 海岛棉对黄萎病的抗性和 POX2PC1酶带基因具有显性单基
因遗传特征, 并推测 PC1基因受抗病基因调控, 在生化水平上进一步证明海岛棉抗性为显性单基因遗
传。POX 在棉花抗黄萎病中的作用并非十分重要, 但 PC1酶带的表现与棉株黄萎病抗性显著相关,
PC1酶带弱, 棉株抗病, PC1酶带强, 棉株感病, 从而证明 POX2PC1同工酶可作为遗传标志在育种上加
以利用。
关键词　棉花; 黄萎病; 抗病性; 过氧化物酶 (POX) ; 同工酶
Rela tion sh ip between Perox ida se Isozymes and Resistance to Vertic il-
l ium W ilt in Cotton
M A Zh i2Ying1　L IU Shu2Q ian1　WAN G X ing2Fen1　ZHAN G Gui2Yin1　SUN J i2Zhong2　
L IU J in2L an2
(1 H ebei A g ricultural U niversity , B aod ing , H ebei 071001; 2 H uazhong A g ricultural U niversity , W uhan, H ubei 430070)
Abstract　Perox idase (POX) isozym e patterns w ere investigated in the m aterials including P1,
P2, F 1 and F 2 of two crosses betw een suscep tible U p land co tton cultivars and a resistan t Sea
Island co tton variety, and 20 co ttons belonging to G. barbad ense and G. h irsu tum w ith differen t
levels of V erticillium w ilt resistance. T here w ere th ree POX isozym e bands of anode in bo th the
suscep tible and resistan t co ttonsw hen no pathogen stress, and after inoculation, th ree new bands
of anode appeared in all the m aterials. O n the o ther hand, one band of cathode, nam ed POX2
PC1, w as differen t betw een the suscep tible and the resistan t m aterials befo re inoculation, and the
band of the suscep tible varietiesw asmore in tensive than that of the resistan t. A fter inoculation,
the PC1 band of the resistan t w as stillw eak, but the band of the suscep tible w as m uch stronger
than that of un inoculated p lan ts. T h rough the analyses to the PC1 band of F 1 and F 2 populations,
it w as show n that almost all the bands of F 1 p lan tsw ere w eak, and the segregation ratio s of w eak
and strong bands in F 2 populations w ere 3 ÷ 1. Since the resistance of the G. barbad ense variety
w as con tro lled by a single gene, the PC1 band gene w ith the characteristic of single gene could be
regulated o r con tro lled by the resistan t gene. In the F 2 generation of two com binations, it w as
observed that there w as a sign ifican t relationsh ip betw een in tensiveness of PC1 band and
X 河北省自然科学基金和河北省教委博士基金资助项目
收稿日期: 1998208211, 接受日期: 1999205204

V erticillium w ilt resistance, w ith the perfo rm ance of ligh t2co lo red band p lan t show ing resistan t
and deep2co lo red band p lan ts suscep tible. T herefo re, the POX2PC1 isozym e can be used as a
genetic m arker app licable to the future co tton breeding.
Key words　Cotton; R esistance to V erticillium w ilt; Perox idase (POX) ; Isozym e
植物体内原有的或经病原菌侵染后诱导产生的一些寄主酶与植物的抗病性有密切关系。
许多研究表明, 过氧化物酶 (POX)参与一些植物抗病作用的生化反应事件, 且可作为鉴定寄
主抗病性的指标[ 1～ 6 ]。但 POX 同工酶与棉花黄萎病抗性的关系, 国内外尚未见报道。本研究
拟对此问题进行初步探讨, 以为棉花黄萎病抗性机制和抗病遗传育种研究提供理论依据。
1　材料和方法
1. 1　供试材料
选择20个来源和抗病性不同的棉花品种 (表1) 和2个陆地棉ö 海岛棉杂交组合, 作为分析
寄主同工酶的材料。
表1　　供试棉花品种的名称、来源及黄萎病抗性反应
Table 1　　Cotton var ieties used and the ir resistance to Vertic il l ium wilt
编号
No.
棉种及品种
Species and variety
抗性反应3
Reaction
type
编号
No.
棉种及品种
Species and variety
抗性反应3
Reaction
type
1 吐海2号 Tuhai2 R 11 唐棉2号 Tangm ian2 R
2 海 吉扎70 Giza70 R 12 苏2028 Su2028 R
3 岛 比马90253 P im a90253 R 13 陆 冀棉2号 J im ian2 S
4 棉 海7124 Hai7124 R 14 中棉所8号 Zhongm iansuo8 S
5 5010夫 5010F R 15 地 鲁棉1号 L um ian1 S
6 农大9427 Nongda9427 R 16 冀棉11号 J im ian11 S
7 陆 省94217 Sheng94217 R 17 棉 邯208 Han208 S
8 地 张仲3号 Zhangzhong3 R 18 衡9273 Heng9273 S
9 棉 省557 Sheng557 R 19 冀棉8号 J im ian8 S
10 保89S225 Bao89S225 R 20 鄂荆1号 E jing1 S
　　3 黄萎病反应型根据人工室内接种鉴定和田间病圃鉴定结果确定。　Reaction type of V erticillium w ilt w as determ ined
by identification of grow th cham ber and the disease nursery in Hebei A gricultural U niversity.
1. 2　试验方法
1. 2. 1　棉苗培育及接种方法　　采取营养钵育苗和定量注菌液接种法[ 7 ]。接种黄萎病菌为
中等致病力菌系V J 61。
1. 2. 2　取样方法　　分别对供试杂交组合的亲本、F 1和 F 2群体的棉苗单株编号, 接种前1天
和接种后7天、14天按单株编号顺序取样。每株棉苗剪取子叶0. 1 g 装入小塑料袋中, 迅速用
液氮冷冻, 转入- 80℃冰箱保存。对供试的不同棉花品种, 分别在接种前1天、接种后1、4、
7、10、14天取样, 每次对每品种50～ 55株棉苗取子叶少许, 混合后用液氮冷冻, 转置280℃冰
箱保存。
1. 2. 3　同工酶提取　　将冷冻的叶片放入冰浴研钵中, 按每克叶片加5 mL 预冷提取液 (1. 0
molö L T ris2HC l, pH 8. 0)研磨, 0～ 4℃ 10000 r ö m in 离心20 m in, 取含酶上清液用于电泳。
1. 2. 4　电泳及酶带显色　　采用聚丙烯酰胺等电聚焦电泳法[ 8 ]。凝胶浓度7. 0% , 胶联度
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3. 0% , 2. 5% 两性电解质 pH 为3. 5～ 10. 0。阳极液为1 molö L H 3PO 4, 阴极液为1 molö L
N aOH , 样品点样量10 LL。点样时, 以感病亲本的酶液作对照。电泳程序为: 4 ℃条件下, 60
V 预电泳30 m in, 加点样纸, 再60 V 电泳 15 m in, 然后恒流 12. 5 mA 至电压升至550 V , 去
点样纸, 最后恒压 580 V 至电流降为0. 2 mA。电泳持续2. 5 h。电泳完毕, 用醋酸联苯胺法染
色[ 9 ]。
2　结果和分析
2. 1　亲本品种及杂种后代 POX 同工酶酶谱表现
2. 1. 1　接种前后亲本品种 POX 同工酶酶谱变化　　比较抗病品种比马90253和感病品种鲁
棉1号接种前后 POX 同工酶谱, 可见棉株叶片内 POX 同工酶带集中分布于正、负两极。在未
接种时 (图1) , 不论是抗病品种比马90253, 还是感病品种鲁棉1号, POX 同工酶酶谱的正极
(A node)均有3条酶带, 其中 PA 1、PA 2为强带, PA 3为弱带。在负极 (Cathode) 都仅具有1条
PC1酶带, 但感病品种鲁棉1号的 PC1 带明显强于抗病品种比马90253, 而同一品种的不同个
体之间无明显差异。接种后7天, 棉苗未出现明显病症, 但2个亲本品种叶片的 POX 同工酶谱
已发生明显变化 (图2) , 二者在正极原有的3条酶带都有不同程度的加强, 其中 PA 3由弱带变
为强带。此外, 正极还出现3条新的酶带, 即 PA 4、PA 5、PA 6, 其中 PA 4、PA 5较强, 而 PA 6
较弱。在负极, 仍只有1条酶带, 抗病品种比马90253仍表现为弱带, 而感病品种鲁棉1号的
PC1带比接种前颜色加深, 变为更强的酶带。同工酶带等电点测定表明, PA 1、PA 2、PA 3、
PA 4、PA 5、PA 6的 p I 值分别为3. 8、4. 1、4. 3、4. 5、4. 7、4. 9; PC1的 p I= 8. 0。
图1　　接种前抗、感品种个体的 POX 同工酶酶谱
F ig. 1 　　POX isozym e patterns of individuals in P im a 90253 (R) and L um ian1 (S) before inoculation
图2　　接种后抗、感品种个体的 POX 同工酶酶谱
F ig. 2　　POX isozym e patterns of individuals in P im a 90253 (R) and L um ian1 (S) after 7 days of inoculation
由上述结果可见, 抗、感品种之间 POX 同工酶谱的正极酶带数及其强弱, 在接种前和接
3344期　　　　　　　　马峙英等: 过氧化物酶同工酶与棉花黄萎病抗性的相关研究　　　　　　　　　　

种后均无明显差异, 而负极的 PC1酶带 (POX2PC1) , 在接种前感病品种强于抗病品种, 接种
后二者差异更加明显, 表明 POX2PC1酶带可能与品种的黄萎病抗性有关。
2. 1. 2　抗、感品种杂种后代 POX 同工酶带及黄萎病抗性的遗传分析　　以感 ö 抗杂交组合
鲁棉1号ö 比马90253的 F 1、F 2为材料, 在接种后7天按单株编号取样, 测定了个体的 POX 同工
酶。结果发现, F 1、F 2所有个体的正极酶带均无差异, 而 F 1负极 PC1酶带均表现为弱带, F 2群
体中出现 PC1弱带和强带的分离。对该组合 F 2群体中 PC1弱带植株与强带植株分离比例的遗
传测验表明, 弱带型植株与强带型植株的分离比例均符合3 ÷ 1 (表2) , 可见 PC1酶带为弱带型
这一性状具有显性单基因遗传特征。用另一组合中棉所8号ö 比马90253的 F 1、F 2进行的试验
也得到类似的结果。
表2　　2个杂交组合 F2群体接种后 POX-PC1酶带的遗传分析
Table 2　　Genetic analysis of POX-PC1 band in F2 population from two crosses
组合
Com bination
总株数
Total p lant
弱带株数
No. of P3
强带株数
No. of p3
实际比例
O bserved
ratio
期望比例
Expected
ratio
V2c
概率
P robability
L um ian1 ö 108 82 26 3. 15 ÷ 1 3 ÷ 1 0. 01 > 0. 90
P im a90253
Zhongm iansuo8 ö 57 45 12 3. 67 ÷ 1 3 ÷ 1 0. 29 0. 50～ 0. 75
P im a90253
　　3 P—弱带棉株; p—强带棉株。P—p lant w ith ligh t co lored PC1 band; p—p lant w ith deep colored PC1 band.
对上述2个杂交组合 F 1、F 2代黄萎病抗性的遗传分析 (表3) 表明, 抗病基因呈显性单基因
遗传。结合前述结果, 推测 POX2PC1酶带基因可能受抗病基因调控。
表3　　2个杂交组合后代的黄萎病抗性遗传分析
Table 3　　Genetic analysis of two crosses between susceptible and resistant parents
组合
Com bination
世代
Generation
总株数
Total p lant
抗病
株数
No. of R 3
感病
株数
No. of S3
实际比例
O bserved
ratio
期望比例
Expected
ratio
V2c
概率
P robability
L um ian 1 ö
P im a90253
F1
F2
20
108
20
79
0
29 2. 72 ÷ 1 3 ÷ 1 0. 31 0. 50～ 0. 75
Zhongm iansuo8 ö
P im a90253
F1
F2
44
57
39
39
5
18 2. 17 ÷ 1 3 ÷ 1 0. 98 0. 25～ 0. 50
　　3 R—抗病棉株; S—感病棉株。R—resistant p lant; S—suscep tible p lant.
2. 2　POX-PC1酶带与棉花黄萎病抗性的相关分析
从以上分析中得知, POX2PC1酶带与棉花黄萎病抗性间可能存在遗传上的相关性。如果
这种遗传相关确实存在, 则无论是纯系品种群体, 还是杂种后代个体, 都必然是 PC1为弱带
时表现为抗病, PC1为强带时表现为感病。反之, 亦是如此。基于此, 以20个抗、感不同的纯
系品种和2个杂交组合的 F 2分离群体为材料, 对 POX2PC1酶带与棉花黄萎病抗性的关系作进
一步分析和验证。
对20个抗、感不同的棉花纯系品种接种前后 POX 同工酶酶谱的比较研究表明, 接种前,
12个抗病品种的 PC1酶带均较弱, 其中5个海岛棉品种 (1- 5) 的酶带比7个陆地棉品种 (6-
12 ) 的酶带还弱些; 而8个感病品种的 PC1酶带都较强 (图3)。接种后7天测定, 抗病海岛
棉和陆地棉品种的PC 1酶带均明显比所有感病品种 (13- 20) 的PC 1酶带弱。品种的POX 2
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图3　　接种前20个棉花品种 POX 同工酶酶谱
F ig. 3　　POX isozym e patterns of 20 cottons before inoculation
图4　　接种后20个棉花品种 POX 同工酶酶谱
F ig. 4　　POX isozym e patterns of 20 cottons before inoculation
PC1酶带强弱与黄萎病抗性相关符合率达100% (图4)。
进一步对2个杂交组合分离群体的单株 PC1酶带与其黄萎病抗性的对应关系分析表明,
在中棉所8号ö 比马90253组合的57个棉株个体中, PC1为弱带且抗病的个体38株, PC1为强带
且感病的个体11株, PC1酶带强弱与棉株黄萎病抗性相关符合率达85. 96% ; 在鲁棉1号ö 比马
90253组合的108个棉株中, 弱带、抗病的77株, 强带、感病的24株, 符合率为92. 52% (表4) ,
2个组合平均符合率为89. 24%。这表明 PC1酶带与黄萎病抗性之间确实存在高度的遗传相
关。
以2个海岛棉品种 (吐海2号和比马 90253)、2个陆地棉抗病品种 (唐棉2号和苏2028)和2个
感病品种 (邯208和衡9273) 为材料, 测定比较了接种前后 POX 同工酶的动态变化, 发现不论
是海岛棉抗病品种还是陆地棉抗病品种, 接种前1天和接种后1、3、7、10、14天的 PC1酶带均
为弱带, 且无明显变化, 而感病品种的 PC1酶带在不同时间均为强带, 只是接种后比接种前
有所增强。这表明 PC1酶带的表达不存在显著的时间特异性, 而是与品种的黄萎病抗性密切
相关。
3　讨论
本研究发现, 抗、感棉花材料接种黄萎病菌后, 阴性 POX 同工酶 (正极酶带)较接种前都
发生明显变化, 但抗、感材料间无明显差别。而阳性 POX 同工酶 (负极酶带) 的 PC1酶带在
抗、感材料间存在明显差异, 表明这一酶带与棉花的黄萎病抗性有很高的相关性。抗病材料
PC1酶带弱、活性低, 接种前后无明显变化; 感病材料 PC1酶带强、活性高, 接种后比接种前
明显增强。由于抗病材料的 PC1酶带表现为弱带而不是无带, 所以编码该酶带的基因在抗、
感材料中都存在, 是组成型的, 只是存在表达速度与表达量上的差异。
5344期　　　　　　　　马峙英等: 过氧化物酶同工酶与棉花黄萎病抗性的相关研究　　　　　　　　　　

表4　　鲁棉1号ö P ima90-53 F2单株 POX-PC1酶带与抗病性之间的对应关系
Table 4　　The relationsh ip between POX-PC1 band and resistance of F2 indiv iduals from Lum ian1 ö P ima90-53
植株编号
P lant
No.
PC1酶带
L or D 3
抗病性
R or S3
植株编号
P lant
No.
PC1酶带
L or D 3
抗病性
R or S3
植株编号
P lant
No.
PC1酶带
L or D 3
抗病性
R or S3
植株编号
P lant
No.
PC1酶带
L or D 3
抗病性
R or S3
1 L S 28 D S 55 L R 82 L R
2 D S 29 D S 56 L R 83 L R
3 L R 30 D S 57 L R 84 D S
4 D S 31 L R 58 L R 85 L R
5 L R 32 L R 59 L R 86 L R
6 D S 33 D S 60 D S 87 L R
7 L R 34 L R 61 D S 88 L R
8 L R 35 L R 62 L R 89 L R
9 L R 36 L R 63 D S 90 L R
10 L R 37 D S 64 L R 91 L R
11 D S 38 D S 65 L R 92 L R
12 L R 39 D S 66 L R 93 L S
13 D S 40 L R 67 L R 94 L R
14 L R 41 L R 68 L R 95 L R
15 L R 42 L R 69 D R 96 L R
16 L R 43 L S 70 L R 97 L R
17 L R 44 L R 71 D S 98 D S
18 D S 45 L R 72 D S 99 L S
19 L R 46 L R 73 L R 100 L R
20 L R 47 L R 74 L R 101 L R
21 L R 48 L R 75 L R 102 L R
22 L R 49 L R 76 L R 103 L R
23 L R 50 D S 77 L R 104 L R
24 L R 51 L R 78 L R 105 L R
25 D R 52 L R 79 D S 106 L R
26 L R 53 L S 80 L R 107 L R
27 D S 54 L R 81 L R 108 D S
　　3 L 表示弱带, D 示强带; R 示抗病, S 示感病。
L 2ligh t co lored band, D 2deep colored band; R2resistant p lant, S2suscep tible p lant
通过对 PC1酶带弱、抗病的品种与 PC1酶带强、感病的品种间杂交后代的分析, 进一步
证明了 PC1酶带与黄萎病抗性间的高度相关性, 还预示这种相关性的原因, 可能是抗病基因
对 PC1酶基因的表达有抑制作用。在抗病品种中, 由于受抗病基因产物的抑制, PC1基因关
闭或微弱表达, PC1呈弱带; 而感病品种不存在抗病基因, PC1基因自由表达, 表现为强带。
在杂交 F 1中, 若按同工酶具有共显性的特点[ 10 ] , PC1酶带的活性应该是抗、感亲本该酶带活
性的叠加, 表现为强带。但试验结果证明 PC1酶带仍表现为弱带, 说明 F 1杂合体中具有的显
性抗病基因仍起抑制 PC1酶基因表达的作用。F 2个体弱带一般表现为抗病, 强带一般表现为
感病, 亦证明抗病基因与 PC1基因密切关联。
抗病基因对 PC1基因的抑制作用在接种前后不发生变化, 由此推论, PC1基因不是主要
的棉花抗黄萎病的防卫反应基因。在接种后, 抗、感品种正极的阴性 POX 同工酶都出现3条
新的酶带, 原有的3条酶带也有不同程度的加强。这些同工酶的等电点非常接近, 在3. 8～ 4. 9
之间。由于抗、感品种这些同工酶的变化规律基本一致, 因而推测它们的表达与抗病基因无
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关, 而可能是在受到病菌侵染时, 由病菌细胞壁的某些成分或毒素激发而产生[ 2 ]。有的研究
表明, 阴性 POX 同工酶与木质素的合成有关[ 2 ]。诱导木质化作为一种抗病机制, 在植物抗病
反应中可起到一定作用, 但木质素并不总是有效的抗侵入和抗扩展屏障[ 2 ]。本研究结果似乎
也支持这一观点, 否则, 感病品种就不会由于大量合成 POX2PC1同工酶而加强木质化作用最
终又表现为感病。
从本研究结果可见, PC1酶带可以作为一种遗传标记在棉花育种中加以利用, 如用于种
质资源的抗性鉴定、亲本选择、分离世代抗病单株的筛选等, 可以缩短抗性鉴定周期, 提高
选择效率, 加快育种进程。检测 PC1同工酶, 技术简便, 成本不高, 电泳所需酶液量少 (10～
15 LL ) , 只需剪取少许叶片提取即可, 并不影响棉苗正常生长。为保证结果更为准确可靠,
也可在接种后 (如7天)再行鉴定。即使如此, 也较常规鉴定提早20～ 25天完成。
参　考　文　献
1　王立新, 苏　青. 华北农学报, 1996, 11 (1) : 30～ 35
2　董汉松主编, 植物诱导抗病性 原理和研究, 北京: 科学出版社, 1995. 160～ 170
3　桂美祥, 黄维玉, 倪楠君. 西北植物学报, 1992, 12 (3) : 173～ 179
4　徐朗莱, 叶茂炳, 徐雍皋等. 植物病理学报, 1991, 21 (4) : 285～ 289
5　Collinge, D. B. P lant M ol. B iol. , 1987, 9: 389～ 410
6　Q inghua Pan, L ing W ang, H irosh i Ikehash i et al. P hy topathology , 1996, 86 (10) : 1071～ 1075
7　马峙英, 王省芬, 张桂寅等. 棉花学报, 1997, 9 (1) : 15～ 20
8　宋晓轩, 朱荷琴, 邢金松. 植物生理学通讯, 1995, 31 (1) : 45～ 48
9　王秀芬. 河北农业大学学报, 1990, 13 (4) : 78
10　张维强, 唐秀芝编著. 同工酶与植物遗传育种. 北京: 北京农业大学出版社, 1993. 71～ 93
7344期　　　　　　　　马峙英等: 过氧化物酶同工酶与棉花黄萎病抗性的相关研究