全 文 ：第 30 卷 第 8 期
2004 年 8 月 　739～744 页
作 　物 　学 　报
ACTA AGRONOMICA SINICA
Vol. 30 , No. 8
pp. 739 - 744 　Aug. , 2004
反义 trxs 基因的导入对小麦种子发芽的影响
刘　雷　尹　钧 3 　任江萍　韩锦峰 Ξ
(河南农业大学 ,国家小麦工程技术研究中心 ,河南郑州 450002)
摘　要 　用基因枪将反义 trxs 基因导入小麦幼胚 ,经组织培养获得了抗性再生植株。PCR 及限制酶切检测显示 ,反义
trxs 基因在转基因植株中基本完整。生化指标测定及发芽特性试验表明 ,与对照相比 ,转基因籽粒中 Trx h 活性明显降
低 ;水溶蛋白和醇溶蛋白中巯基含量比率以及α2淀粉酶活性都有所下降 ;转基因种子的发芽势明显降低 ,但种子最终发
芽率变化不大。
关键词 　硫氧还蛋白 h ;反义基因 ;发芽 ;α2淀粉酶 ;小麦
中图分类号 : S512
Effects of Antisense trxs on Germination of Transgenic Wheat Seeds
LIU Lei ,YIN Jun 3 ,REN Jiang2Ping ,HAN Jin2Feng
( National Engineering Research Center for Wheat , Henan Agricultural University , Zhengzhou 450002 , Henan , China)
Abstract 　Antisense gene of thioredoxin s (anti2 trxs) was transformed into wheat by biolistic gun1 PCR and restriction
endonuclease digestion analysis proved that anti2trxs in the transgenic plants was basically intact1 The investigation of com2
parison between transgenic seeds and non2transgenic indicated that Trx h activity was lowered distinctly in transgenic seeds ,
α2amylase activity and the ratio of reducted sulfhydryl in water soluble protein / total protein and alcohol soluble protein/ to2
tal protein were also decreased1 These changes might result in the decrease of germinating vigor of the transgenic seeds1
Key words 　Thioredoxin h ; Antisense gene ; Germination ;α2amylase ; Wheat
　　二硫键是决定蛋白质三维构象和生理活性的重
要因素之一 ,其氧化还原状态直接或间接影响许多
酶的活性。硫氧还蛋白 h (thioredoxin2h , Trx h) 是一
种能催化二硫键氧化还原反应的蛋白质 ,它参与诸
如酶活性调节、抗胁迫、信号传导等许多重要的生命
活动[1～4 ] 。Suske 等[5 ]证明小麦籽粒中有 Trx h。此
后的研究发现 ,种子发芽时 Trx h 能促进淀粉酶和
蛋白质酶的活性提高 ,增加贮藏蛋白的水溶性 ,使种
子中贮藏的营养物质更易于水解以及启动胚乳中的
碳氮代谢 ;这些功能与 Trx h/ NADP 系统还原种子
中蛋白质和酶的抑制物有关[6～8 ] 。
Joshuan[9 ]曾就 Trx h 活性上升对种子发芽的影
响进行研究 ,发现随着 Trx h 活性的上升 ,种子中淀
粉酶活性、贮藏蛋白的相对还原状态以及发芽势都
有所上升。关于 Trx h 活性下降对种子发芽的影响
尚未见报道。
源于 Phalaris coerulescens 的 trxs 基因 (thioredoxin
s , trxs)与小麦硫氧还蛋白 h 基因 (thioredoxin h , trx
h)同属于硫氧还蛋白基因家族 ,测序结果显示它们
的 cDNA 有 94 %的同源性。为降低种子中 Trx h 的
表达水平和活性、研究 Trx h 活性下降与种子发芽
特性间的关系 ,本研究采用反义 RNA 技术将反义
trxs 基因导入小麦 ,测定了转基因种子中 Trx h 活
性、水溶蛋白和醇溶蛋白的还原状态以及α2淀粉酶
活性的变化 ;并就通过调节 Trx h 活性改变种子发
芽特性作一探讨。
1 　材料与方法
111 　植物材料
　　以小麦品种豫麦 34 为转化的材料 ,T1 代植株作Ξ基金项目 :国家自然科学基金 (30370877)和河南省杰出人才创新基金 (121000800) 。
作者简介 :刘雷 (1972 - ) ,男 ,四川遂宁人 ,河南农业大学作物栽培学与耕作学国家重点学科博士生 ,从事转基因作物研究。3通讯作者 :尹钧 ,教授 ,博士生导师。Tel :037123558203 　E2mail :xmyj @2631net
Received(收稿日期) :2003204216 ,Accepted (接受日期) :20032082061

为分子检测的材料 ,T2 转基因籽粒作为生化项目的
检测材料。
112 　质粒
反义 trxs 基因和筛选标记 bar 基因由澳大利亚
阿德莱德大学 (Adelaide University) 引进 (国家 948 项
目) 。含反义 trxs 基因的质粒结构为 trxs 基因反向
连接在小麦醇溶蛋白启动子的下游 , 插入载体
pBluescript SK+ 的多克隆位点 ;含 bar 基因的质粒结
构为 bar 基因连接在 CaMV35S 启动子的下游 ,插入
载体 pBluescript SK+的多克隆位点。
113 　培养基
愈伤组织诱导、筛选和分化培养基参考张晓东
等[10 ]方法配制。
114 　转化、筛选与再生
按黄粤等[11 ]方法制备基因枪转化的受体 ,微弹
制备和高渗处理见安海龙等[12 ]方法。用 PDS21000/
He 基因枪转化 ;可裂膜与载弹片间距 215 cm ,载弹
片与阻挡网间距 111 cm ,阻挡网与受体材料间距
515 cm ,轰击气体压力 61205～71584 MPa ,真空度
31916 MPa ,每枪微弹量 50μg。轰击后 6 h 将幼胚材
料转移到不加 PPT的愈伤组织诱导培养基上进行恢
复培养 ;1 周后 ,转至加有 3 mg/ L PPT的愈伤组织诱
导培养基上 ,26 ℃暗处培养。4～6 周后 ,选择直径
大于 5 mm 的胚性愈伤组织转移到含有 5 mg/ L PPT
的分化培养基上 ,在 16 h/ d 的光照 (3 000 lx)和 26 ℃
下进行愈伤组织分化培养。当小芽长到 2～3 cm
时 ,转到含有 2 mg/ L PPT的生根培养基上生根。将
根系发育良好的再生植株置 4 ℃冰箱春化 ,1～2 周
后将再生植株置 20 ℃下 2～3 d ,然后移栽入花盆
中。
115 　转基因植株的分子检测
11511 　DNA 提取方法及引物设计 　　用 SDS 法提
取转基因后代的 DNA[13 ]用于转基因植株的分子鉴
定。根据反义 trxs 基因的 DNA 序列 ,设计了 3 条
PCR引物。上游引物 ( P1) 的序列为 5′2GCA GGA
GCA AAC AAG GAT GGG23′,下游引物序列为 (P2) 5′2
CCA AGT TCT GTG CCA GCC ATG C23′和 ( P3) 5′2
AGT GCC ACC GAA CAC AAC ATA CC23′。引物由上
海生工生物工程公司合成。
11512 　嵌套 PCR 的方法　　第 1 轮 PCR 以基因组
DNA 为模板用引物 P1 + P2 做 PCR ,第 2 轮 PCR 以
第一轮 PCR 产物为模板 ,用引物 P1 + P3 做嵌套
PCR。
11513 　酶切检验 　　由反义 trxs 基因的 DNA 序列
可知 ,引物 P1 + P2 的扩增片段上有两个 Csp6 Ⅰ酶
的酶切位点 ( GTA ↓C) ;经 Csp6 Ⅰ酶切后 ,将出现
109、263 和 555 bp 三个片段。
根据三条引物在反义 trxs 基因上的结合位点以
及 Csp6 Ⅰ酶在反义 trxs 基因上的酶切位点可绘出嵌
套 PCR 方案和酶切片段模式图如下。
图 1 嵌套 PCR方案和 Csp6 Ⅰ酶切片段模式
Fig11 Pattern of nest2PCR and Csp6 Ⅰdigest fragment
116 　种子发芽试验
T2 代种子经 70 %的酒精浸泡 1 min 后用无菌水
冲洗 3 次 ,再用 011 %的 HgCl2 浸泡 5 min ,无菌水冲
洗 3 次。经表面消毒和浸种处理后的种子置 24 ℃
培养箱进行 1～5 d 的发芽处理。
117 　转基因种子和生化特性测定
11711　Trx h 待测样品的制备与测定 　　参照
Myeong[14 ]的方法制备 Trx h 待测样品。用二硫苏糖
醇 (dithiothreitol , DTT) 还原牛胰岛素的反应来检测
Trx h 的催化活性[15 ] 。牛胰岛素 (insulin) 被还原后 ,
分子中两个亚基间的二硫键断裂 ,产生难溶的自由
态B 亚基 ,呈白色沉淀状 ,并在 650 nm 处有最大吸
光值。Trx h 能催化这一还原反应 ,白色沉淀的产生
速度反映了 Trx h 的催化活性的高低。
反应方程式 :DTT2( SH) 2 + insulin2S2 　Trx h 　
DTT2S2 + insulin2(SH) 2
设非转基因种子的 Trx h 提取物为阳性对照
(CK) , 未处理样品的 Trx h 提取液为阴性对照
(Blank) 。
11712 　水溶蛋白和醇溶蛋白组分的提取及巯基还
原状态的测定 　　以转基因种子为材料 ,按陈毓
荃[16 ]的方法取得水溶蛋白和醇溶蛋白组分。取等
体积的待测样两份 ,一份用于测定反映巯基含量的
OD412[17 ] ,另一份用于测定蛋白质总量的 OD280[18 ] 。
设 K = OD412/ OD280 ,为待测样中巯基含量与蛋白质
总量间的比率。
208 　　　作 　　物 　　学 　　报 30 卷 　

11713 　α2淀粉酶待测样品的制备及活性测定 　　
发芽的种子每天取样一次 ,每次 015 g ,共计 5 次。
用DNS法测定α2淀粉酶活性[19 ] 。活性单位按 1 g
植物材料 1 min 水解淀粉产生的麦芽糖量 ( mg)
计算。　
2 　结果与分析
211 　转基因植株的分子检测
　　经转化、筛选和再生 ,共得到 3 株可育的抗性植
株 (T0 植株) ,T1 代材料在温室中加代繁殖。提取 T1
代植株的 DNA ,用引物 P1 + P2 对 T1 代植株做 PCR
检测 ,部分植株的检测结果见图 2。在 2、3、4、5、6 这
5 条泳道中有较清楚的约为 900 bp 的目的片段。
图 2 T1 代部分植株的 PCR检测结果
Fig12 PCR analysis of T1 transgenic plants
N :非转基因阴性对照 ,1～7 :T1 代植株 ,M:分子量标记 DL2000
N :negative control ;1 - 7 :transgenic plants(T1) ;M:Marker DL2000
以嵌套 PCR 和限制酶酶切 PCR 产物的方法 ,进
一步检测了 PCR 产物的特异性和 T1 代植株中外源
基因结构完整性。先回收 4、6 泳道 (图 2) 中目的片
段 ,以此为模板进行 P1 + P2 的再扩增 PCR 和 P1 +
P3 的嵌套 PCR ,然后取部分引物 P1 + P2 再扩增的
PCR 产物 ,用 Csp6 Ⅰ限制性酶酶切 ,检测结果见图
3。1、2 泳道是用引物 P1 + P2 再扩增所得产物 ,泳
道中都有约为 900 bp 目的片段 ;3、4 泳道中是引物
P1 + P2 再扩增 PCR 产物经 Csp6 Ⅰ酶切后得到的片
段 ,在这两个泳道中都有约为 550、260、110 bp 的 3
条带 ,这与预期的 555、263 和 109 bp 三个目的片段
基本一致 ;5、6 泳道是引物 P1 + P3 的嵌套 PCR 产
物 ,泳道中出现了约为 700 bp 的目的片段。参照图
1 可知 ,经 PCR、嵌套 PCR 和酶切后 ,得到了与预期
长度相符合的 DNA 片段。嵌套 PCR 扩增对靶序列
的选择很严格 ,能降低由引物错配导致的错误扩增
率 ,其检测结果更真实。本研究通过嵌套 PCR 检测
证明了 T1 代植株中含有反义 trxs 基因。基因缺失
或交换等变异可使原有序列上的酶切位点发生变
化 ,酶切片段长度若发生改变 ,则说明基因出现了变
异。我们对部分 T1 代材料的 PCR 产物进行限制酶
酶切检测 ,得到与反义 trxs 基因上酶切位点相符的
DNA 片段 ,此结果表明存在于 T1 代植株中的反义
trxs 基因结构基本完整。
图 3 PCR产物及其 Csp6 Ⅰ酶切片段
Fig13 PCR products and Csp6 Ⅰdigested fragment
M:分子量标记 DL2000 ;1 ,2 :再扩增的 PCR 产物 ;
3 ,4 :再扩增的 PCR 产物 Csp6 Ⅰ酶切后的产物 ;
5 ,6 :嵌套 PCR 的产物。
M: Marker DL2000 ;1 ,2 : PCR products with P1 + P2 ; 3 ,4 : fragments
of 1 and 2 digested by Csp6 Ⅰ; 5 ,6 : nest2PCR products
of 1 and 2 with P1 + P3.
图 4 转基因与对照小麦 Trx h 催化活性的比较
Fig14 Comparison of Trx h activities of CK, A and blank
212 　Trx h 的活性变化
Trx h 能催化 DTT 还原牛胰岛素的反应 ,白色
还原产物的产生速度越快 OD650上升越快 ,表明 Trx
h 催化活性越高。图 4 中阳性对照 (CK,非转基因
小麦的 Trx h 提取物) 反应体系中 OD650值上升明
显 ,而阴性对照 (Blank ,不含 Trx h 提取物) 的 OD650
值增长缓慢。这表明小麦 Trx h 提取物对 DTT还原
牛胰岛素的反应有明显的催化作用。转基因种子
(A)的反应体系中 OD650值增量低于阳性对照 ,说明
转基因种子的 Trx h 催化活性下降了。对还原产物
发生量进行回归分析 ,得出反映还原产物增长率的
回归线斜率分别为 : b阳 = 715 ×10 - 4 , bA = 117 ×
10 - 4 , b阴 = 014 ×10 - 4。由 b阳/ b阴 = 18175 可知小
麦 Trx h 提取物的催化作用使还原反应速度加快了
18175 倍 ;由 bA/ ( b阳 - b阴) = 0124 可知反义 trxs 基
308　8 期 刘 　雷等 :反义 trxs 基因的导入对小麦种子发芽的影响 　　　

因的导入使转基因材料的 Trx h 催化活性下降了
76 %。
213 　蛋白质组分中巯基含量的变化
种子中 Trx h/ NADPH 还原系统能提高胚乳的
还原状态 ,催化 S2S 还原形成还原态的巯基 ,因此巯
基含量反映着蛋白质的还原状态。本研究测定并计
算了水溶蛋白和醇溶蛋白中巯基量在蛋白总量中所
占的比率 K( K = OD412/ OD280) ,结果见表 1。表 1 显
示 ,转基因材料的 K水溶蛋白和 K醇溶蛋白比 CK分别下
降了 5124 %和 5156 %。说明含有反义 trxs 基因的
种子中巯基含量下降了 ,胚乳的还原状态较低。
表 1 水溶蛋白和醇溶蛋白中巯基含量/ 蛋白质含量
Table 1 Ratio of sulfhydryl in water soluble protein
and alcohol soluble protein
K水溶蛋白 K醇溶蛋白
CK
Non2transgenic seeds 0138 a 0147 a
转基因材料
Transgenic seeds 0136 b 0144 b
　　注 :a、b 不同字母表示 5 %的差异显著。
Note : Small letter a and b denote the significant difference ( P < 0105) 1
214 　α2淀粉酶活性比较
在 5 d 的测定时期内 ,转基因种子 (A) 和对照的
α2淀粉酶活性都呈上升趋势 ;CK的α2淀粉酶活性始
终高于转基因材料 (图 5) ,表明含有反义 trxs 基因
的转基因种子中α2淀粉酶活性降低了。对α2淀粉酶
活性的变化进行回归分析 ,得出反映α2淀粉酶活性
增加速率的回归线斜率如下 : bCK = 01639 , bA =
01485。斜率的绝对值越大 ,α2淀粉酶活性上升得也
越快。由 bA/ bCK = 0175 可知 ,同 CK相比转基因材
料的α2淀粉酶活性上升速率降低了 25 %。
图 5 转基因种子与对照α2淀粉酶活性变化
Fig15 Comparison ofα2amylase activity215 　种子发芽特性图 6 显示 ,在试验的前两天 ,转基因种子 (A) 的
发芽势明显低于对照 (CK) ,以后却大幅度上升 ,第 5
天时已接近对照。表明反义 trxs 基因对种子发芽势
的影响较大 ,而对种子的最终发芽率的影响并不明
显。
图 6 转基因种子与对照种子发芽率比较
Fig16 Comparison of germination percentage between
transgenic seeds and CK seeds
3 　讨论
较高的胚乳蛋白还原状态有利于 S2S 还原 ,能
促进蛋白水解 ,加速种子氮代谢的进程[20 ] 。本研究
发现 ,在含有反义 trxs 基因小麦种子中 ,水溶蛋白和
醇溶蛋白的还原型巯基含量都有所下降 ,说明转基
因种子的胚乳蛋白还原状态降低了 ,这种变化有可
能不利于蛋白水解 ,并延缓氮代谢进程。
α2淀粉酶是影响碳代谢的一个重要因素。本研
究显示 ,转基因种子中 Trx h 和α2淀粉酶的活性都
有所下降。Kobrehel [21 ]和 Joshuan[9 ]发现 Trx h 活性
上升可使种子的α2淀粉酶活性上升。这表明通过调
节 Trx h 的活性可以改变种子中α2淀粉酶的活性。
另据报道 ,除α2淀粉酶外 , Trx h 还能影响β2淀粉酶
和脱支淀粉酶活性[14 ,22 ] ,它们都是重要的淀粉水解
酶 ,对发芽时碳代谢活动有重要的影响。
上述分析表明 ,Trx h 活性变化关系到碳、氮代
谢的进程 ,而种子萌发所需的能量和物质来源于碳、
氮代谢 ,因此 Trx h 活性的变化将对种子发芽产生
影响。本研究证明 ,伴随着 Trx h 活性的降低 ,转基
因种子的发芽势明显下降。此外还发现种子最终发
芽率并不因 Trx h 活性的降低而明显变化。在测定
Trx h 活性的试验中 ,经过长时间的反应后 ,未加 Trx
h 提取物的空白和转基因材料两个反应体系的
OD412值都能上升到接近阳性对照的水平。表明 ,作
为一种催化物 ,Trx h 只影响 S2S 还原反应的速度 ,
其活性下降后 ,反应仍在缓慢地进行。由此推论 ,
408 　　　作 　　物 　　学 　　报 30 卷 　

Trx h 活性的下降使种子中与 S2S 还原有关的某些
生化反应 (如淀粉、蛋白质水解或其他酶活性调节
等)速度降低 ,并导致发芽势的下降 ,但那些生化反
应仍在进行 ,经过较长时间后仍能满足种子发芽的
要求 ,所以种子的最终发芽率变化不大。
结合图 5、图 6 可以看出在 5 d 的发芽试验中 ,
转基因种子和对照的发芽率都随α2淀粉酶活性上升
而上升 ,这与沈正兴等[23 ]的研究结果一致。第 5 天
的转基因种子发芽率与对照发芽率已很接近 ,但二
者间α2淀粉酶活性的差异仍较明显 ,在前人的研究
中也有类似现象[24 ,25 ]。说明α2淀粉酶活性与种子
发芽率在总的变化趋势上是一致的 ,但并不是发芽
率相同的种子就会有相同的α2淀粉酶活性。这可能
是因为α2淀粉酶催化淀粉水解的产物满足种子发芽
需求后 ,其活性的高低对发芽率的影响便不再明显
了 ,对此尚待进一步探讨。
反义 RNA 技术阻碍基因表达的效果具有准确、
高效性。本研究通过反义 RNA 技术降低了小麦籽
粒中 Trx h 活性、胚乳还原状态和α2淀粉酶活性 ,这
些变化影响着种子发芽时碳氮代谢 ,本试验中转基
因种子的发芽势有明显下降。结果表明 ,通过基因
工程调节 Trx h 活性的方法有望成为改变种子发芽
特性的新途径。
致 　谢 :李志岗、牛吉山二位老师在分子检测试验中
提供了帮助 ,在此表示感谢。
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