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第 28 卷 第 6 期 作　物　学　报 V ol. 28, N o. 6
2002 年 11 月　 756～ 759 页 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA pp. 756～ 759　N ov. , 2002
红莲型水稻不育系和保持系线粒体基因组 BAC 文库的构建Ξ
易　平　汪　莉　万翠香　朱英国3
(武汉大学植物发育生物学教育部重点实验室, 武汉大学生命科学学院遗传研究所, 湖北武汉 430072)
摘　要　以红莲型 (HL ) 细胞质雄性不育系和保持系为材料, 构建了水稻线粒体基因组的BA C 文库。每个文库保存约
2300 个菌落, 外源插入片段介于 9～ 25 kb 之间。以线粒体基因为探针对文库进行菌落原位杂交验证, 均筛选到了阳性
克隆。构建的两个文库为进一步研究水稻线粒体基因组的结构特点, 为克隆与红莲型水稻细胞质雄性不育相关的线粒
体基因奠定了基础。
关键词　细胞质雄性不育; 线粒体基因组; BA C 文库
中图分类号: S511　　　文献标识码: A
BAC L ibrary Con struction for M itochondr ia l Genome of Ster ile and M a in ta iner
L ines from HL R ice
Y I P ing　WAN G L i　WAN Cui2X iang　ZHU Ying2Guo3
(T he K ey L aboratory of M O E f or P lant D evelopm ental B iology and Institu te of Genetics, College of L if e S ciences, W uhan U niversity , W uhan
430072, China)
Abstract　H igher p lan t m itochondria p lays a great ro le in the p rocess of m icrospo re developm en t, and is clo sely
associated w ith cytop lasm ic m ale sterility (CM S). T he library construction of m itochondrial genom e is a neces2
sary step to clone gene and research the structure of the genom e. So here, the sterile line and m ain tainer lines of
HL 2type rice w ere used asm aterials, and BA C libraries of their genom e w ere constructed. Each library consist2
ed of about 2300 clones w ith in sert size ranging from 9 to 25 kb. W ith m itochondrial genes as p robes, positive
clones w ere found. It w as calculated that each library con tain s app rox im ate 40 tim es of the rice m itochondrial
genom e.
Key words　Cytop lasm ic m ale sterility; M itochondrial genom e; BacterialA rtificial Ch romosom e (BA C)
　　高等植物线粒体基因组包含的功能基因不多,
非编码序列及基因间序列占据了绝大部分[ 1 ] , 但高
等植物线粒体基因组却是真核生物中最大的, 也是
结构最复杂的。其大小介于 200～ 2500 kb, 较动物
和真菌的大 15～ 150 倍[ 2 ]。DNA 分子存在形式多
样是高等植物线粒体基因组结构复杂的表现之一,
如水稻的线粒体基因组是由一群 10～ 150 kb 大小
的DNA 分子构成的复杂集合体, 有线状、环状和
超螺旋三种形态[ 3 ]。此外, 存在于高等植物线粒体
基因组内的线状、环状DNA 或双链 RNA 分子[ 2 ] ,
以及来自叶绿体和细胞核的漫游DNA [ 4 ]也是其复
杂性的表现。线粒体DNA 分子内或分子间存在着
大量的不均一的重复序列, 由这些重复序列介导的
频繁重组是造成高等植物线粒体基因组结构复杂的
主要原因[ 5 ]。
细胞质雄性不育 (Cytop lasm ic m ale sterility,
CM S) 普遍存在于高等植物中, 它是生产上广泛利
用杂种优势的基础。国内外大量的研究结果表明,
CM S 与线粒体基因组的突变有直接关系[ 5, 6 ]。线粒
体基因组分子内或分子间频繁重组所形成的异常嵌
合基因被认为是 CM S 产生的分子基础。红莲型
(HL ) CM S 是国内外公认的一类新的不育类型。它Ξ 基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (3070568)
作者简介: 易平, 女, 博士, 主要从事水稻细胞质雄性不育的分子机理研究; E2m ail: ypever@ sina. com
通讯作者: 朱英国, 男, 教授, 主要从事植物发育遗传学和植物雄性不育及育性恢复的分子机理等方面的研究, 博士生导师; 电话:
027—87684560, E2m ail: zhuyg@public. w hu. hb. cn
Received on (收稿日期) : 2001212205, A ccep ted on (接受日期) : 2002202204

的发现改变了我国杂交水稻亲本资源贫乏和不育胞
质单一的局面。HL 2CM S 也是当前超级杂交组合选
育的优质种质资源。为了深入研究水稻线粒体基因
组的自身特点, 并为克隆 HL 2CM S 相关的线粒体
基因提供条件, 本文以红莲型水稻细胞质雄性不育
系粤泰A 和保持系粤泰B 为材料, 构建了水稻线
粒体基因组的BA C 文库。
1　材料和方法
1. 1　材料
红莲型水稻细胞质雄性不育系粤泰A 和保持
系粤泰B。
1. 2　线粒体的提取
以水稻暗室培养 10 天的黄化苗为材料, 经差
速离心和蔗糖密度梯度离心, 分离并纯化无叶绿体
的线粒体, 具体操作详见文献[7 ]。
1. 3　线粒体D NA 的制备
具体操作步骤可参考文献 [ 8 ], 略有改动。将
分离纯化的线粒体悬浮于预冷的 SCE 缓冲液 (1
molöL 山梨醇, 0. 1 molöL 柠檬酸钠, 60 mmolöL
ED TA , pH 7. 0) 中, 并与 45℃恒温的用 SCE 配制
的 1% 低溶点琼脂糖等体积混合, 用 200 ΛL 的 T ip
头取样, 点于封口膜上, 形成大约 8 ΛL 的小珠,
4℃放置数分钟后收集到试管中, 加入 10 倍体积的
ESP 缓冲液 (0. 5 molöL ED TA pH = 9. 3, 1% 十二
烷基肌氨酸钠, 5 m gömL 蛋白酶 K)。37℃水浴 72
h, 中间更换两次缓冲液。上清, 收集琼脂糖小珠,
用含 1 mmolöL 苯基磺酰氟 (PM SF ) 的 T E 溶液透
析两次, 每次 1 h, 再用不含 PM SF 的 T E 溶液漂洗
3 次, 第三次在 4℃放置半小时。将琼脂糖小珠用 5
倍体积的 S au3A I1 倍酶切缓冲液悬浮, 换溶液 2
次, 间隔时间分别是 1 小时和 2 小时。去上清并分
装小珠, 70℃熔化 10 m in, 37℃保温 5 m in 后, 在
每管中分别加入 S au3A I 0. 05U、0. 08U、0. 1U、
0. 15U、0. 2U , 用枪头混匀, 37℃消化 15 分钟后,
加入 1ö10 体积的 0. 5 molöL 的 ED TA 终止反应。
检测酶切效果, 以主带集中在 10～ 25 kb 为最佳条
件进行大量酶切。用制备型低溶点琼脂糖胶回收和
B 2琼脂糖酶 (B. M. 公司) 消化的方法, 获得所需要
的DNA 片段, 检测质量和浓度。
1. 4　BAC 载体和感受态细胞的制备
详见文献[ 8, 9 ], 载体纯化后用B am H I 酶切,
C IA P (小牛肠碱性磷酸酯酶, P rom ega) 去除载体的
5′端磷酸根。
1. 5　连接、转化及文库构建
连接体系见文献 [ 9 ], 转化条件为 2500V , 待
菌落长出后, 用无菌牙签将白色菌落逐个点入 384
孔板, 每个文库保存约 2300 个菌落, 用 384 孔接种
针复制文库, 置于- 70℃保存。
1. 6　文库评价
每个文库随机选取 23 个克隆进行培养, 提取
质粒DNA , 用N otÉ 切下外源插入片段, 电泳检测
其大小, 计算文库大概的覆盖率。用 384 孔接种针
制备菌落原位杂交膜, 具体步骤见文献 [ 9 ], 以线
粒体特有的功能基因为探针对文库进行杂交检测。
随机引物标记试剂盒购自 G IBCO 公司。
2　结果
每个文库随机选取 23 个克隆, 外源插入片段
大小介于 9～ 25 kb 之间, 检测结果见图 1。个别插
入片段还含有N otÉ 的酶切位点。若水稻线粒体基
因组的大小按 500 kb 计算, 阳性克隆以 2300 个计
算, 插入片段平均为 15 kb, 则两个文库的基因组
覆盖率均超过了 40 倍。
图 1　　A 和B 分别是不育系和保持系线粒体基因组
BAC 文库插入片段的电泳检测结果
F ig. 1　　A and B show ed respectively the size range
of DNA inserts of BAC clones, w hich w ere random
selected from m itochondrial genom e libraries
of sterile and m aintainer lines.
M arker (ΚöE coRÉ ) : 23130 bp, 9416 bp, 6557 bp,
4361 bp, 2322 bp, 2027 bp
　　在对两个线粒体基因组的BA C 文库进行原位
杂交分析时, 所用的 4 个线粒体基因探针均筛选到
了阳性克隆 (表 1)。以 atp 6 基因的杂交为例 (图 2) ,
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该基因在不育系基因组文库中检测到了 44 个阳性
克隆, 在可育系中得到了 26 个。所用的 4 个线粒体
基因探针中以 atpA 基因筛选到的克隆数为最少。
表 1　两个线粒体基因组文库原位杂交筛选到的阳性克隆统计结果
Table 1　Number of positive BAC clones obta ined by screen ing
two m itochondr ia l genome l ibrar ies with 4
m itochondr ia l genes as probes
阳性克隆数
N um ber of positive clones
探针 P robe
atp 6 atpA cox Ê cob
不育系 Sterile line 44 13 19 39
保持系M aintainer line 23 16 17 21
3　讨论
植物线粒体作为能量代谢的细胞器, 控制并参
与许多重要的生命活动。线粒体不仅直接提供细胞
进行各种生命活动的能量, 而且随着植物组织器官
的逐渐成熟, 又成为碳骨架的供应基地[ 10 ]。大量的
研究还表明, 线粒体与细胞程序性死亡和衰老密切
相关。此外线粒体基因还控制着植物花粉的正常发
育过程[ 11 ]。植物线粒体基因组庞大而复杂, 直接进
行全序列分析尚有一定的困难, 因此, 线粒体基因
的克隆和线粒体基因组物理图谱的构建均是通过文
库来进行的[ 12 ]。
图 2　　A 和B 分别是 atp6 基因筛选不育系和保持系线粒体基因组文库的菌落原位杂交结果
F ig. 2　　A and B respectively show ed the screening results of m itochondrial genom e libraries of
sterile and m aintainer lines w ith atp 6 gene as p robe
　　目前构建线粒体基因组文库的载体多是质粒、Κ2噬菌体和粘粒。质粒文库用于基因克隆较为方
便, 但其容纳外源片段的能力有限, 只能克隆小于
10 kb 的片段, 且不易永久保存, Κ2噬菌体和粘粒文
库构建时, 连接、转化和筛选过程虽然易于操作,
但二者对外源DNA 的要求很高。外源DNA 分子
不仅要有足够多的数量, 还要有足够的长度, 以满
足部分消化、分级分离和构成串联体包装进噬菌体
内的各项要求[ 13 ]。Sh izuya 等[ 14 ]以大肠杆菌 F 因子
为基础, 采用 F 因子的复制起点, 以氯霉素抗性基
因为选择标记构建了细菌人工染色体 (Bacterial ar2
tificial ch romosom e, BA C) 载体。BA C 的插入片段
长度一般小于 350 kb, 虽不如 YA C 克隆片段长,
但有许多优点[ 14 ]: 外源片段一般不会发生嵌合和重
排; 采用电转化的方法极大提高了转化效率, 降低
了对外源DNA 量的要求; 可根据自己建库的目的
对DNA 片段的大小做相应的调整。此外, BA C 文
库稳定性好、筛选容易、克隆分离方便等优点也使
得BA C 载体被广泛的运用于构建各类基因组文库,
如人、水稻等生物的核基因组文库[ 15, 16 ]。由于玉米
线粒体基因组BA C 文的构建已有成功的报道[ 8 ] ,
在借鉴其成功经验的基础上, 我们选用了BA C 载
体来构建红莲型水稻细胞质雄性不育系和保持系的
线粒体基因组文库。
常规提取线粒体DNA 的过程很复杂, 在经过
差速离心、蔗糖梯度离心获取高纯度的线粒体后,
再进行裂解、抽提和沉淀DNA 分子的步骤。在苯
酚、氯仿等有机溶剂多次抽提的过程中, 极易发生
线粒体DNA 分子的随机断裂, 导致DNA 长度下
降, DNA 质量和数量均降低。因此, 一种常用于制
备大分子核DNA 的方法 低熔点琼脂糖包埋
法, 被用于提取植物线粒体DNA [ 8 ]。将纯化的线粒
体包埋, 原位裂解和部分消化, 再回收所需大小的
DNA 片段, 进行连接和转化。这一系列过程不仅
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避免了植物线粒体DNA 在传统提取方法中人为的
机械损伤, 还能够有效的提高线粒体DNA 分子的
得率。整个操作过程简单方便, 成功率高。
红莲型水稻细胞质雄性不育系和保持系的线粒
体基因组BA C 文库的构建, 为深入了解水稻线粒
体基因组的结构, 为加速克隆红莲型水稻细胞质雄
性不育线粒体相关基因, 为研究小孢子发育过程中
细胞核与线粒体的动态互作过程提供了条件。
致谢: 衷心感谢华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室的郑用
琏教授和张方东博士对本实验所给予的指导和帮助。
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《植物遗传资源科学》简介
　　《植物遗传资源科学》是中国农业科学院作物品种资源研究所和中国农学会遗传资源分会联合主办的专
业性学术期刊, 主要发表植物遗传资源研究报告, 介绍研究成果和学科进展, 进行学术交流。
读者对象: 从事植物遗传资源科学研究工作的人员, 各有关大专院校的师生, 农业行政和推广人员。
季刊。16 开本, 64 页。准印证号: 京内资准字 992L 0722。每期收工本邮寄费 5 元, 全年 20 元。本刊编辑部
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