全 文 ：第27卷 第3期 作　物　学　报 V ol. 27, N o. 3
2001 年5月 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA M ay, 2001
利用 cDNA—AFLP 技术研究玉米基因的差异表达Ξ
吴敏生　高志环　戴景瑞
(中国农业大学遗传育种系, 北京 100094, 中国)
提　要　利用 cDNA 2A FL P 技术, 对玉米强优势组合和弱优势组合及其双亲自交系在苗期和雄穗生长
锥伸长期的基因表达进行了分析。结果表明, 玉米强优势组合和弱优势组合的基因表达有明显差异,
基因表达有多种类型, 表现出质和量的差异, 不仅有增强, 也有双亲沉默, 弱优势组合双亲沉默的数
量在苗期和雄穗生长锥伸长期均高于强优势组合, 杂种优势的大小可能与双亲基因间的抑制有关。
关键词　基因表达; cDNA 2A FL P 技术; 杂种优势; 玉米
Studies on D ifferen tia l Gene Expression of M a ize ( Zea m ays L. ) by
M ean s of cD NA- AFL P Techn ique
WU M in2Sheng　GAO Zh i2H uan　DA I J ing2R ui
(D epartm ent of Genetic and B reed ing , China A g riculture U niversity , B eij ing 100094, China)
Abstract　　Gene exp ression of m aize fo r h igh heterosis com bination (P167×F349) and low het2
erosis com bination (F349×M o17) and their paren ts at seedling stage and elongation stage of tas2
sel vegetative cone w as analyzed by m eans of cDNA 2A FL P techn ique. T he results indicated that
the patterns of gene exp ression differ sign ifican tly betw een h igh and low heterosis com binations.
T here w ere m any patterns of gene exp ression, including gene overexp ression and gene silencing.
T he bands of gene exp ression in h igh heterosis com bination w ere more than that in low one w hat2
ever at seedling stage o r elongation stage of tassel vegetative cone. H eterosis m aybe associated
w ith the inh ibition betw een genes from two paren ts.
Key words　　Gene exp ression; cDNA 2A FL P; H eterosis; M aize (Z ea m ay s L. )
近年来利用mRNA 差异显示技术研究杂种优势基因表达虽取得一些结果, 但由于该技
术假阳性较高[ 1～ 5 ] , 需要大量的重复才能解决[ 6 ]。本研究首次采用 cDNA 2A FL P 技术分析了
玉米强优势组合和弱优势组合在苗期和雄穗生长锥伸长期 (营养生长向生殖生长转化的重要
时期)的基因表达, 揭示出一些重要现象。
1　材料与方法
1. 1　材料
1) 玉米自交系 P167、F349、M o17及由它们组成的杂交种 P167×F349和 F349×M o17,
P167与 F349亲缘关系远, F 1为强优势组合 (HH F 1) , F349与M o17亲缘关系近, F 1为弱优势组Ξ 国家自然科学基金资助项目 (39570456)
收稿日期: 1999212206, 接收日期: 2000204220
Received on: 1999212206, A ccep ted on: 2000204220

合 (L H F 1) , 均由中国农业大学遗传育种系提供
2) cDNA 2A FL P 法所用接头和引物: 均由加拿大 Sangon 公司合成, 其序列如下:
T aqÉ 接头: 5′- GA CGA T GA GTCCT GA C
TA CTCA GGA CT GGC- 5′
T aqÉ 预扩增引物: 5′- GA CGA T GA GTCCT GA CCGA
T aqÉ 选择性扩增引物: 5′- GA T GA GTCCT GA CCGANN (N 代表A、T、G、C 中一种)
A seÉ 接头: 5′- CTCGTA GA CT GCGTA CC
CT GA CGCA T GGA T- 5′
A seÉ 预扩增引物: 5′- CTCGTA GA CT GCGTA CCTAA T
A seÉ 选择性扩增引物: 5′- GA CT GCGTA CCTAA TNN
1. 2　方法
1. 2. 1　田间取样　　将5个材料同时播种于大田, 管理条件一致, 当玉米植株长到5～ 6叶
(苗期)和雄穗生长锥伸长期时, 分别取5g 叶片, 洗净, 液氮冷冻后保存备用。
1. 2. 2　总 RNA 提取及 cDNA 合成　　5g 玉米叶片, 在液氮中冷冻并研磨成粉末, 悬于4
molöL 的异硫氰酸胍抽提液中, 再经酸性饱和酚和氯仿抽提后, 用异丙醇沉淀总RNA , 最后
溶于D EPC 处理的水中, - 70℃贮存。mRNA 从总RNA 中提取, 按照 P rom ega 公司试剂盒
Po lyA T tract (R ) mRNA Iso lation system s 介绍的方法完成。cDNA 第一链和第二链的合成, 按
照 P rom ega 公司U niversal R iboclone (R ) cDNA Syn thesis system 试剂盒介绍的方法进行。
1. 2. 3　cDNA 2A FL P 方法　　参照Bachem [ 7 ]所述方法进行。所有材料均用等量的 cDNA 进
行酶切、连接和扩增。
2　结果与分析
2. 1　自交系及其杂交种的田间试验差异
1998年, 将本试验用的3个自交系在张家口进行田间试验, 发现强优势组合单株粒重的
杂种优势是弱优势组合的2倍多, 强优势组合的杂种优势达250. 6% , P167和 F349属于不同优
势群, F349和M o17属于同一优势群[ 8 ]。表明亲缘关系不同的自交系所配制的杂交种将会产
生很大差异。
2. 2　玉米苗期 cD NA-AFL P 和m RNA 差异分析
利用8对引物组合对5个材料进行 cDNA 2A FL P 分析, 自交系和杂交种在苗期的基因表达
表现出一定的差异, 不仅有量的差异, 同时也有质的差异 (见图1, 其他引物组合扩增图未示
出) , 不同引物组合扩增结果不同。基因表达有许多类型, 但一对引物组合不能扩出所有类
型, 主要有以下六种: (1) 亲本与杂交种出现相同的带, 表现量上一致。(2) 子一代与单亲一
致, 另一亲本没有带。(3) 子一代表达减弱。 (4) 子一代基因沉默, 包括单亲沉默和双亲沉
默。(5) 双亲增强, 杂交种表现出量上超过双亲。(6) 出现特异的带, 即双亲没有, 而子代出
现, 在强优势组合和弱优势组合都有, 但此类型很少, 如何产生尚不清楚。
从8对引物组合可知, 在苗期, 不同自交系间、不同杂交种间以及自交系与杂交种之间表
达的基因数目有明显的差异 (表1)。自交系间相比, P167、F349表达的基因数目较多; M o17
表达的基因数目少。杂交种与自交系比较, 强优势组合的 F 1表达的基因数目高于两个亲本各
自表达的基因数目, 弱优势组合的 F 1表达的基因数目在双亲之间。杂交种之间比较, HH F 1基
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因表达的数量明显高于 L H F 1, 这可能与它们亲本的基因表达的数量不同有关, HH F 1和
L H F 1都有增强表达的基因, 而 HH F 1比L H F 1多。在我们的实验中, 还发现这样一种现象,
HH F 1出现而L H F 1不出现的带或者HH F1比L H F 1表达量增强的带总数为59条带, 而相反的情
况下, L H F 1有HH F 1无的只有26条带, 相差2. 3倍, HH F 1明显高于L H F 1。以上结果表明, 子
一代的杂种优势大小可能与基因表达的数量有关。
表1　　玉米杂交种及其亲本不同时期叶的mRNA 差异
Table 1　　mRNA difference of leaf for hybr ids and
the ir parents of ma ize at different stage
M aterial
Seedling stage
Total
bands
Specific bands
of hybrid
E longation stage of
tassel vegetative cone
Total
bands
Specific bands
of hybrid
P167 349 336
HHF1 372 59 371 92
F349 354 344
LHF1 332 26 335 21
M o17 275 289
2. 3　玉米雄穗生长锥伸长期 cD NA-
AFL P 和m RNA 差异分析
在玉米雄穗生长锥伸长期, 亲本
与亲本, 亲本与杂交种, HH F 1 和
L H F 1之间也存在6种基因表达类型 (图
1) , 但用一对引物组合也不能扩增出
所有类型。与苗期一样, 也有质和量
的差异。其中双亲增强类型, 强优势
组合比弱优势组合数目多, 而双亲沉
默或单亲沉默类型, 是弱优势组合比
强优势组合多。但从 HH F 1和L H F 1的差异来看 (表1) , HH F 1出现而L H F 1不出现的带或者
HH F 1比L H F 1表达量增强的带总数是92条带, 相反 L H F 1有 HH F 1无的总带数只有21条,
HH F 1显著高于L H F 1, HH F 1是L H F 1的4. 4倍。以上结果表明, 雄穗生长锥伸长期基因表达的
规律与苗期几乎完全一致, 不同之处是在玉米发育进入更关键的时期以后, 强优势组合中特
异表达和增强表达的基因数目有更为明显的增加。
2. 4　苗期与雄穗生长锥伸长期的m RNA 差异比较
苗期与雄穗生长锥伸长期基因表达比较, 结果表明, 除了上述的分析之外, 基因表达还
表现以下几个特点: (1) 在苗期与雄穗生长锥伸长期有一些基因表达的mRNA 是一样的, 强
优势组合和弱优势组合没有差异, 表明有些基因在植物发育过程中, 可长时间表达。 (2) 有
些基因只在苗期表达, 有些基因只在雄穗生长锥伸长期表达, 表明基因表达具有时空性。以
上两个特点, Edw ards[ 9 ]在研究玉米株高的Q TL 时也发现了类似的现象。 (3) 从强优势与弱
优势组合比较来看, 苗期强优势杂种比弱优势杂种特异表达的mRNA 数目多, 在雄穗生长锥
伸长期这种表达的差异更为明显, 苗期是2. 3倍, 雄穗生长锥伸长期是4. 4倍。这表明强优势
杂种和弱优势杂种的双亲基因间的相互作用在不同的时期是不同的。
3　讨论
杂种优势的产生是一个很复杂的过程, 它涉及到两个遗传背景不同的体系的相互作
用[ 6 ] , 在相互作用过程中, 双亲间基因的相互促进和抑制决定了杂交一代基因表达, 从而在
子一代出现多种类型。本研究中子一代的基因表达, 不仅有双亲、单亲增强或减弱, 表现量
的差异; 而且有单亲沉默、双亲沉默, 表现质的差异。有的基因在两个时期均表达, 其作用时
间比较长; 而有的基因只在苗期表达或在雄穗生长锥伸长期表达, 它们的作用时间较短并表
现出基因表达的时空特性, 表明在玉米产量杂种优势形成的过程中基因作用的复杂性。
　　在苗期和雄穗生长锥伸长期, 双亲的基因在 F 1代的表达同时存在着多种模式, 即有些基
因间抑制, 有些基因间促进。这种基因间相互促进和抑制, 将会达成一个平衡。不同组合其
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图1　强优势组合和弱优势组合用引物组合
(A seÉ + CT, T aqÉ + A T )扩增的mRNA 差异
苗期　1. P167　2. HHF1　3. F349　4. LHF1
5. M ol17 雄穗生长锥伸长期
6. P167　7. HHF1　8. F349
9. LHF1　10. M o17
M : 100bp ladder m arker 箭头表示差异带
F ig. 1 mRNA difference betw een high heterosis
com bination and low heterosis com bination
amp lified w ith p rim er com bination
(A seÉ + CT, T ag É + A T )
Seedling stage: 1. P167　2. HHF1
3. F349　4. LHF1　5. M o17
E longation stage of: 6. P167　7. HHF1
8. F349　9. LHF110. M o17
tassel vegetative cone
M 为100bp L adder DNA M arker, The arrow s
indicate the differential bands
双亲来源不同, 亲缘关系不同, 基因间的抑制和促进
达成的平衡水平也就不同。对产量杂种优势而言, F 1
代来自双亲的基因总体上可分为有利基因和不利基因
两大类, 这两类基因在 F 1代的表达, 不同杂交组合处
于不同状态, 两者互作处于不同平衡, 有利基因表达
越充分, 不利基因越受到抑制, 平衡也越有利于杂种
优势的表现, 因此, 单独用显性, 超显性, 上位性假
说就难以完全解释杂种优势的机理。
本研究结果表明, 强优势组合和弱优势组合mR2
NA 差异与杂种优势有一定联系, 强优势组合和弱优
势组合均有基因沉默现象, 但弱优势组合基因沉默数
量更多。以前对转基因植物的研究发现[ 10 ] , 基因间存
在抑制现象, 其主要原因是多拷贝的基因连在一起,
发生甲基化而失活, 或者是外源基因与内源基因相互
作用产生共抑制, 或者是 RNA 2RNA 作用造成mR2
NA 降解而失活。玉米杂交种双亲亲缘关系不同, 则
相同的基因数目不一样, 出现共抑制或多拷贝串联甲
基化的可能性也不一样, 亲缘关系近的双亲出现共抑
制或多拷贝串联的机会就比亲缘关系远的多一些。这
一点与我们的实验结果也是十分吻合的, 因此, 杂种
优势与杂种中双亲基因间的抑制可能有一定关系, 基
因间的抑制如何影响杂种优势值得进一步探讨。
本研究结果表明, cDNA 2A FL P 技术是研究基因
表达的一种新方法, 有许多优点[ 7 ]。cDNA 2A FL P 由
于使用严格的 PCR 条件和加接头, 具有较高的重复
性, 不仅可以观察某一时期的基因表达, 而且可以同
时观察不同时期的基因表达, 有利于系统地研究杂种
优势形成过程中基因表达和基因间的相互作用。
参　考　文　献
1　Stuber C W , S E L incoln, D W W olff. Genetics, 1992, 132: 823～ 839
2　Xiao J inhua, L i J im ing, Y Longp ing. Genetics, 1995, 140: 745～ 754
3　Yu S B, L i J X, Xu C G. P roc N atl A cad S ci U SA , 1997, 94 (17) : 9226～ 9231
4　周建明, 朱　群, 白永延等. 科学通报, 1998, 43 (2) : 2419～ 2422
5　L i F S, E S Barnathan, K Kariko. N ucleic A cid s R es, 1994, 22 (9) : 1764～ 1765
6　程宁辉, 高燕萍, 杨金水等. 植物学报, 1997, 34 (4) : 379～ 382
7　Bachem C W B, S Rutger. Hooven V an der, B ruisn Steef m de. T he P lant J ournal, 1996, 9 (5) : 745～ 753
8　吴敏生, 戴景瑞, 王守才. 中国农业大学学报, 1998, 3 (5) : 97～ 100
9　Edw ardsM D , S Helentjaris, S W righ t. T heor A pp l Genet, 1992, 83: 765～ 774
10　华志华, 黄大年. 植物学报, 1999. 41 (1) : 1～ 5
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