全 文 ：Vol. 30 , No. 2
pp. 186～188 　Feb. , 2004
作 　物 　学 　报
ACTA AGRONOMICA SINICA
第 30 卷 第 2 期
2004 年 2 月 　186～188 页
研究
简报 氯化镧和三氟乙酸对壳寡糖诱发棉花细胞抗性的影响
郭红莲　白雪芳　杜昱光　李曙光 Ξ
(中国科学院大连化学物理研究所 ,辽宁大连 116023)
Effects of LaCl3 and TFA on Oligochitosan Induced Cotton Cell Resistance
GUO Hong2Lian , BAI Xue2Fang , DU Yu2Guang , LI Shu2Guang
( Dalian Institute of Chemical Physics , Chinese Academy of Sciences , Dalian 116023 , Liaoning , China)
　　激发子诱发植物抗病性的报道很多 ,其中相当一部分源
于生物激发子 ———寡糖类激发子 ,尤其对源于大豆大雄疫霉
( Phytophthora megasperma f . sp . glycinea)的寡聚半乳糖醛酸激
发子的研究较为深入。许多人认为寡糖激发子可能是通过
激发细胞内抗性信号物质的转导来激活植物的防御反应体
系 [1～3 ] 。植物体内苯丙氨酸解氨酶 (PAL) 是莽草酸途径衍生
的苯丙烷类代谢途径的关键酶和限速酶 ,主要影响木质素前
体的形成 ,其活性常被看成是植物防卫反应的指标。超氧化
物歧化酶 (SOD)是细胞膜脂过氧化防御系统的主要保护酶 ,
在植物体内的主要作用是清除代谢过程中产生的超氧阴离
子自由基 (O -·2 ) ,催化活性氧发生歧化反应产生无毒的分子
氧和过氧化氢 ,从而使植物免于遭受各种伤害 ,较高的 SOD
活性是植物抗病的生理基础 [4～6 ] 。
Ca2 + 是植物体内主要的第二信使 ,在植物发生抗性反应
过程中 ,Ca2 + 与 CaM结合活化其靶酶而调节生理过程。氯化
镧 (LaCl3 )是细胞内钙离子通道的竞争性抑制剂 ,三氟乙酸
(TFA)是细胞内 CaM 专一性的拮抗剂[7～9 ] ,两者都可阻遏
Ca2 + ΠCaM信号的转导。但在植物诱导抗病性的研究中 ,尚未
见到有关诱导抗性与钙信使关系方面的报道。
来源于海洋生物的寡聚氨基葡糖 (壳寡糖) 可以诱导多
种植物如棉花黄萎病、烟草病毒病等的抗性 [10 ,11 ] ,其诱导抗
性的机理目前尚不清楚。本文研究在壳寡糖诱导的棉花悬
浮细胞中加入LaCl3 和 TFA 的各种处理条件下 ,细胞内 PAL
酶活性的变化和 SOD 酶活性的变化 ,以探讨壳寡糖的诱抗过
程与 Ca2 + ΠCaM的关系。
1 　材料和方法
1. 1 　材料
　　棉花品种为陆地棉中棉 12 号 ( Gossypum hirsutum var.
Zhongmian 12 ) ,本研究室提供。棉花细胞由下胚轴愈伤组织
经悬浮培养得到 ,培养条件 :改良的 MS培养基 ,光照 12 hΠd ,
光照度 1500 lx ,温度为 (25 ±1) ℃,110～120 rΠmin 摇床培养 ,
每 20 d 继代培养 1 次 ,稳定培养 1 年。
壳寡糖激发子由酶降解法获得 ,聚合度为 3～7 , LaCl3
和 TFA 购自百灵威化学试剂公司。
1. 2 　方法
1. 2. 1 　壳寡糖诱导处理 　以 4 500 ×g 离心收集培养细胞 ,
然后以培养基洗 1 次 ,按 500 ×g (细胞干重)ΠL 的浓度重新
悬浮在相同的细胞培养基中 ,在与处理前相同的培养条件下
维持 2 h ,依 0. 05 gΠL 的浓度加入壳寡糖作激发子 ,LaCl3 和
TFA 终浓度都分别为 0. 05 mmolΠL ,处理过程中细胞保持在悬
浮状态。
共 7 个处理 : (1)空白对照 ; (2)加入LaCl3 ; (3) 加入LaCl3
摇匀后随即加入壳寡糖 ; (4) 加入壳寡糖 ; (5) 加入 TFA 处
理 ; (6) 加入 TFA 摇匀后随即加入壳寡糖 ; (7) 加入 LaCl3 与
TFA 摇匀后随即加入壳寡糖。
1. 2. 2 　PAL 酶活性的测定 　参照 Koukol 等 [12 ] 方法。以 OD
变化 0. 01 的酶量作酶活性单位 U。
1. 2. 3 　SOD 酶活性的测定 　参照王爱国等 [13 ] 方法 ,以 NBT
光还原抑制率的 50 %做为酶活性单位 U。
1. 2. 4 　蛋白质浓度测定 　用 Bradford[14 ] 方法 ,以 BSA (牛血
清白蛋白)为标准蛋白。
2 　结果和分析
2. 1 　LaCl3 和 TFA 对棉花悬浮细胞 PAL 和 SOD 活性的影
响
LaCl3 和 TFA 分别为钙离子通道阻断剂和钙调蛋白的拮Ξ基金项目 :国家高技术研究发展计划“863”(2001AA620501) 、(2002AA245131)资助课题。
作者简介 :郭红莲 (1971 - ) ,女 ,黑龙江人 ,博士后 ,主要从事寡糖生物活性方面研究。Tel : 041124379061 , Fax : 041124379061
Received(收稿日期) :2002212204 ,Accepted (接受日期) : 2003205209.

抗剂 ,单独以LaCl3 或 TFA 处理时 ,对 PAL 酶活性变化的影响
与对照没有显著差异 ( P > 0. 05) ,对 SOD 酶活性的影响与对
照也没有显著差异 ( P > 0. 05) ,上述结果表明本实验中应用
钙离子通道阻断剂LaCl3 和钙调蛋白拮抗剂 TFA 对两种酶活
性的测定没有直接影响。
2. 2 　壳寡糖诱导增加棉花悬浮细胞 PAL 和 SOD 酶活性
棉花悬浮细胞在未处理时 ,其 PAL 和 SOD 酶活性波动范
围不大。当加入壳寡糖诱导时 ,悬浮培养细胞的 PAL 和 SOD
酶活性极显著增加 ( P < 0. 01) ,且增加值随诱导时间的延长
而呈增大趋势 (表 1) 。此种结果与壳寡糖在田间诱导棉花的
抗病性结果一致 [6 ] ,表明苯丙氨酸解氨酶和超氧化物歧化酶
活性增加可能是壳寡糖诱导抗性的一个主要原因。
图 1 LaCl3 和 TFA处理引起棉花细胞 PAL( A) 和 SOD( B) 酶活性变化
Fig. 1 Changes in PAL( A) and SOD( B) activities in cotton cells treated with LaCl3 and TFA
表 1 壳糖与 LaCl3 和 TFA处理引起棉花细胞 PAL( A) 和 SOD( B) 酶活性变化
Table 1 Changes in PAL( A) and SOD( B) activities in cotton cells treated with oligochitosan , LaCl3 and TFA
　　A 　　PAL activity [UΠ(mg protein·min) ]
Time
(min)
Control OC
LaCl3 +
OC
TFA +
OC
LaCl3 + TFA
+ OC
0 51. 00 49. 12 49. 43 49. 81 50. 06
20 50. 75 49. 12 51. 69 50. 50 51. 88
40 48. 56 55. 46 56. 27 52. 57 44. 54
60 51. 59 77. 16 57. 28 64. 74 49. 56
80 51. 06 83. 31 64. 68 63. 17 54. 08
100 45. 67 86. 76 72. 27 65. 62 54. 14
120 48. 37 91. 34 66. 00 64. 24 48. 62
　　B 　　SOD activity [UΠ(mg protein·min) ]
Time
(min)
Control OC
LaCl3 +
OC
TFA +
OC
LaCl3 + TFA
+ OC
0 51. 00 57. 51 49. 18 54. 33 51. 93
20 50. 75 60. 72 55. 52 54. 25 60. 95
40 48. 56 70. 80 57. 51 62. 68 59. 75
60 51. 59 74. 68 83. 71 71. 43 67. 41
80 51. 06 94. 79 84. 05 72. 12 76. 08
100 45. 67 101. 32 99. 36 77. 24 83. 21
120 48. 37 99. 17 99. 51 93. 42 90. 94
2. 3 　钙信使参与壳寡糖对棉花细胞的作用
壳寡糖处理棉花细胞 ,从第 40 分钟开始 PAL 酶活性即
迅速增加。再分别加入 LaCl3 和 TFA ,PAL 酶活性虽然增加 ,
但增幅远小于壳寡糖单独处理的增幅 (表 12A) 。 t 测验表
明 ,分别加入拮抗剂的 PAL 酶活性间差异不显著 ,加入上述
两种钙信使拮抗剂的 PAL 酶活性与未做处理的酶活性间差
异也不显著。这些结果表明壳寡糖激发子诱导 PAL 酶活性
的增加是经过 Ca2 + ΠCaM 系统而起作用 ,如果在某种水平上
抑制钙信使 ,则壳寡糖对棉花细胞的 PAL 酶的诱导也相应受
到抑制。
若在棉花细胞中加入壳寡糖后随即加入 LaCl3 (图 22B) ,
其 SOD 酶活性变化趋势与单用壳寡糖激发子诱导的变化差
异不显著 ,也即壳寡糖对 SOD 酶活性的激发作用不受钙离子
通道阻断剂的影响。相反 ,加入壳寡糖后随即加入 TFA ,壳
寡糖对棉花细胞 SOD 酶活性的激发作用降低。如果细胞悬
液中加入壳寡糖后随即加入 LaCl3 和 TFA ,其 SOD 酶活性与
壳寡糖加 TFA 共同处理的变化相似 ,都低于单独用壳寡糖处
理时 SOD 酶活性的增加量 ,而与未做任何处理的对照间差异
显著 ( P < 0. 05) 。表明壳寡糖对棉花 SOD 酶活性的激发作
用 ,受到钙调蛋白拮抗剂的抑制 ,如果阻断 Ca2 + ΠCaM信息传
781　2 期 郭红莲等 :氯化镧和三氟乙酸对壳寡糖诱发棉花细胞抗性的影响 　　　

递途径 ,壳寡糖仍可诱导 SOD 酶活性在一定程度上的增加。
3 　讨论
低聚糖可以用作诱抗剂 ,诱导植物产生抗病性。因其高
效无毒且来源广而被认为是很有开发潜力的生物农药 ,在许
多植物上应用效果很好 [9 ,15 ] 。植物防御酶系如苯丙氨酸解
氨酶、超氧化物歧化酶、过氧化物酶等活性的增加 ,有利于植
物保护自身免受外来病菌的浸染 [10 ] 。
环境胁迫如干旱、盐、病原菌等都可以引起植物细胞内
部发生相应的生理生化反应 ,其中许多可以诱发植物产生
Ca2 + 信号 ,引起钙信使系统的变化。小麦幼苗及悬浮培养细
胞在水分胁迫条件下 ,可以诱导一种 44. 2 kD 蛋白亚基的产
生或大量合成 ,钙信使系统参与了此过程 [2 ,12 ] 。本研究结果
证明 ,外源钙信使拮抗剂阻断了钙信使通道中钙离子通道或
者抑制钙依赖型钙调素的活性可以部分抑制壳寡糖诱抗作
用。壳寡糖处理时如果分别或同时加入两种拮抗剂 ,都能明
显降低壳寡糖对防御酶的诱导作用 ,因而表明钙2钙调素信
号系统参与了壳寡糖对棉花细胞的诱抗作用。
壳寡糖对植物防御酶 PAL 和 SOD 酶活性的激发途径不
同 ,对 PAL 酶的激发作用完全通过钙信使传递 ,而对 SOD 酶
活性的诱导激活只有部分通过钙信使传递 ,因为同时阻遏钙
离子通道和钙依赖型钙调蛋白后 ,壳寡糖处理的 SOD 酶活性
明显高于对照值。黄国存等 [5 ] 证明 CaM 参与了 SOD 活性的
调节 ,本实验也证明 SOD 活性的激发与钙依赖型钙调蛋白的
关系密切 ,影响钙调蛋白的因素 ,同样也影响 SOD 酶活性 ,加
入钙调素拮抗剂能抑制壳寡糖对 SOD 活性的激发。
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