全 文 ：Vol. 30 , No. 7
pp. 692 - 696 　July , 2004
作 　物 　学 　报
ACTA AGRONOMICA SINICA
第 30 卷 第 7 期
2004 年 7 月 　692～696 页
外源 AsA 对盐胁迫下水稻叶绿体活性氧清除系统的影响
华　春1 　王仁雷1 　刘友良2 Ξ
(1 淮阴师范学院生物系 , 江苏淮安 223001 ; 2 南京农业大学农业部作物生长调控重点实验室 , 江苏南京 210095)
摘 　要 　研究了外源 AsA 对盐胁迫下不同耐盐性水稻品种 Pokkali (耐盐)和 Peta (盐敏感)叶绿体中活性氧清除系统的影
响。结果表明 :盐胁迫下 ,外源 AsA 能提高不同耐盐性水稻品种叶绿体中 SOD、APX、GR 活性 ,增加叶绿体内 AsA 和 GSH
含量 ,减少 H2O2 和 MDA 含量 ,提高叶绿体中活性氧的清除能力。在盐胁迫或同时加入 AsA 条件下耐盐品种 Pokkali 叶绿
体中 AsA 含量均比盐敏感品种 Peta 高出 40 %。说明 AsA 可以防止盐胁迫下类囊体膜脂的过氧化。
关键词 　盐胁迫 ;水稻 ;叶绿体 ;AsA ;活性氧清除系统
中图分类号 :S511 ,Q945
Effect of Exogenous Ascorbic Acid on Active Oxygen Scavenging System in Chloro2
plasts of Rice under Salt Stress
HUA Chun1 ,WANG Ren2Lei1 ,LIU You2Liang2
(1 Department of Biology , Huaiyin Teachers’College , Huai’an 223001 , Jiangsu ; 2 Key Lab of Crop Growth Regulation , Ministry of Agriculture , Nanjing Agricul2
tural University , Nanjing 210095 , Jiangsu , China)
Abstract 　With ascorbic acid ( AsA) treatment , the changes of antioxidant system in chloroplasts of rice cultivars
(Pokkali , salt2tolerant and Peta , salt2sensitive) under salt stress were studied. The results showed that the activities of
SOD , APX , GR and the contents of AsA , GSH in chloroplasts of two rice cultivars with AsA treatment under salt stress
were increased , while the contents of H2O2 and MDA decreased. The ability of active oxygen scavenging in chloroplasts of
rice was enhanced by treating with AsA. Under salt stress and with AsA treatment , AsA content in chloroplasts of cv.
Pokkali was 40 % higher than that of cv. Peta. It is suggested that AsA contributed to the protection of thylakoid membrane
lipids against oxidation in salt2stressed rice.
Key words 　Salt stress ; Rice ; Chloroplast ; AsA ; Active oxygen scavenging system
　　抗坏血酸 (AsA) 在植物体内起着抗氧化剂、酶
的辅因子和草酸与酒石酸合成前体的作用。它参与
了包括光合作用、光保护作用、细胞壁生长与细胞扩
展 ,乙烯、赤霉素、花色素苷、羟脯氨酸的合成 ,以及
对环境胁迫的抗性等生理过程[1 ] 。AsA 是叶绿体中
AsA2GSH循环的重要组成成分 ,能够清除 O -·2 歧化
生成的 H2O2[2 ] 。已有报道 ,盐胁迫下 ,叶绿体内
H2O2 含量增加 ,膜脂过氧化作用增强[3 ,4 ] 。而盐胁
迫下加入外源 AsA 能提高液泡膜 H +2ATPase、H +2
PPase 的活性 ,可以降低脂质过氧化作用和电解质的
渗漏引起的伤害 ,从而增强大麦的耐盐性[5 ] 。盐胁
迫下 ,外源 AsA 可以部分抑制番茄根、茎、叶的脂质
过氧化作用[6 ] 。但盐胁迫下外源 AsA 对叶绿体内
活性氧清除系统的影响至今尚未见报道。因此我们
用外源 AsA 处理盐胁迫下不同耐盐性水稻品种 ,测
定其叶绿体中抗氧化酶活性和抗氧化剂含量的变
化 ,以探讨外源 AsA 对水稻叶绿体耐盐害的机理。
1 　材料与方法
1. 1 　植物的培养与处理
选用水稻品种 Pokkali (耐盐)和 Peta (盐敏感) 为
材料。其种子用 0. 1 % HgCl2 消毒 10 min ,自来水充
分冲洗 ,然后用蒸馏水浸种 24 h。选取露白一致的
种子播于装有石英砂的塑料盆中 ,木村 B 溶液培
养 ,昼夜温度分别为 (30 ±2) ℃和 (24 ±2) ℃,光强 50
μmol·m - 2·s - 1 ,每天光照 14 h ,相对湿度 80 %。待主Ξ基金项目 :江苏省教育厅自然科学基金项目 (02KJB180007) 。
作者简介 :华春 (1963 - ) ,女 ,江苏江阴市人 ,副教授 ,从事植物生理学的教学和科研。
Received(收稿日期) : 2003201217 , Accepted(接收日期) : 2003208219.

茎第 4 叶全展开后 ,进行处理。处理分为 : (1) 对照 ,
木村B 溶液 ; (2)含 200 mmol/ L NaCl 的木村B 溶液 ;
(3)含 200 mmol/ L NaCl 和 5 mmol/ L AsA 的木村B 溶
液 ; (4) 含 5 mmol/ L AsA 的木村 B 溶液。每处理 3
个重复。每 2 d 更换一次营养液。于处理后的 0、2、
4、6、8 d 取叶片进行测试。
1. 2 　方法
1. 2. 1 　叶绿体的制备 　　参照 Robinson 等[7 ]的方
法提取叶绿体。以缓冲液 (内含 0. 05 mol/ L 的 PBS ,
5 mmol/ L EDTA ,pH 7. 8)悬浮叶绿体 ,用于测定超氧
化物歧化酶 (SOD) 、抗坏血酸过氧化物酶 (APX) 、谷
胱甘肽还原酶 ( GR) 活性和谷胱甘肽 ( GSH) 、AsA、丙
二醛 (MDA)含量 ;以丙酮悬浮叶绿体用于测定叶绿
体 Chl 和 H2O2 含量。
1. 2. 2 　SOD 活性测定 　　按罗广华等[8 ]方法测定。
1. 2. 3 　APX 活性测定 　　参照 Nakano 等[9 ]的方
法。3 mL 反应混合液中含 50 mmol/ L K2HPO42
KH2PO4 缓冲液 (pH 7. 0) ,0. 1 mmol/ L EDTA2Na2 ,0. 3
mmol/ L AsA ,0. 06 mmol/ L H2O2 和 0. 1 mL 酶液。加
入 H2O2 后立即在 25 ℃下测定 10～30 s 内OD290值变
化 ,计算单位时间内 APX 活性。AsA 氧化量按消光
系数 2. 8/ (mmol/ L) cm 计算。
1. 2. 4 　GR 活性的测定 　　参照 Gamble 等[10 ]的方
法进行。酶活性测定介质总体积 1 mL ,含 40 mmol/
L Tricine2NaOH (pH 7. 8) , 0. 5 mmol/ L GSSG, 0. 1
mmol/ L NADPH ,加入 0. 2 mL 酶液启动反应 ,记录 3
min内 340 nm 波长下光吸收的变化。以 H2O 代替
GSSG作空白对照。
1. 2. 5 　AsA 和 GSH 含量测定 　　取 1. 2. 1 的叶绿
体悬浮液 1 mL ,加入 1. 5 mL 蒸馏水、2. 5 mL 5 %三
氯乙酸溶液 ,混匀 ,4 000 ×g 离心 10 min ,上清液定
容至 5 mL ,用于测定 AsA 和 GSH含量。
参照 Tanaka 等[11 ]的方法 ,取 0. 2 mL 样品 ,与
114 mL 75 mmol/ L NaH2PO4 (pH 7. 4) 混匀后 ,再依次
加入 10 %三氯乙酸 0. 4 mL ,44 %磷酸 0. 4 mL ,4 % 2 ,
22二联吡啶 (溶于 70 %乙醇) 0. 4 mL ,和 3 % FeCl3 0. 2
mL ,混匀后 37 ℃保温 1 h ,测定 525 nm 波长下的光吸
收值 ,根据标准 AsA 溶液所作标准曲线 ,计算样品
中 AsA 含量。
参照 Ellman[12 ] 的方法 ,取 0. 2 mL 样品 ,加入
150 mmol/ L NaH2PO4 溶液 (pH 7. 7) 2. 6 mL ,混合后
再加入 DTNB 试剂 (75. 3 mg DTNB 溶于 30 mL 0. 1
mol/ L 磷酸缓冲液 pH 6. 8) 0. 2 mL ,以加磷酸液代替
DTNB 试剂作空白。摇匀 ,于 30 ℃保温 5 min 后测定
412 nm 波长下的光吸收值。根据用标准 GSH 溶液
所作的标准曲线计算样品的 GSH含量。
1. 2. 6 　MDA 含量的测定 　　参照林植芳等[13 ]的方
法。吸上述叶绿体悬浮液 1 mL ,加入 1. 5 mL 蒸馏
水 ,2. 5 mL 含 0. 5 %硫代巴比妥酸的 20 %三氯乙酸
溶液 ,混合液于沸水浴中加热 15 min ,迅速冷却 ,以
4 000 ×g 离心 10 min ,上清液分别于 532、600 nm 波
长下测定光密度值 ,计算每 mg 叶绿素含 MDA 的
μmol 数。
1. 2. 7 　H2O2 含量的测定 　　参照林植芳等[14 ]的方
法。取丙酮悬浮叶绿体提取液 1 mL ,加 0. 1 mL 含
20 % TiCl4 的浓 HCl 液 ,0. 2 mL 浓氨水。生成的过
氧化物 - Ti 复合物用 1 000 ×g 离心 10 min ,沉淀再
用丙酮悬浮洗涤 5 次以减少色素的干扰。最后将沉
淀溶于 3 mL 1 mol/ L H2SO4 中 ,于 410 nm 波长测定
光吸收。按同样过程制备 H2O2 标准曲线。
1. 2. 8 　叶绿素含量的测定 　　按 Arnon[15 ]的方法。
以上各处理均为 3 个重复。
2 　结果
2. 1 盐胁迫下外源 AsA 对水稻叶绿体中 H2O2 和
MDA含量的影响
加入外源 AsA 后 , 可以降低未经盐胁迫的
Pokkali 和 Peta 叶绿体中 H2O2 含量 ,8 d 时 , Pokkali
和 Peta 分别比对照下降 20. 0 %和 13. 6 %。盐胁迫
同时加入外源 AsA ,同样可以降低由于盐胁迫所造
成的叶绿体中 H2O2 含量的增加 ,8 d 时 ,Pokkali 叶绿
体中 H2O2 含量比盐胁迫处理的低 19. 1 % ,而 Peta
则低 24. 8 %(图 12A ,B) 。
外源 AsA 可降低未经盐胁迫和盐胁迫的供试 2
品种叶绿体中 MDA 含量。盐胁迫 8 d 时 ,外源 AsA
处理的 Pokkali 叶绿体中 MDA 含量比未加 AsA 的低
30. 6 % ,而 Peta 低 41. 8 %(图 22A ,B) 。
2. 2 　盐胁迫下外源 AsA对水稻叶绿体中 SOD 活性
的影响
外源AsA 对未经盐胁迫的供试 2 品种叶绿体中
SOD 活性没有明显的影响 ,但能增加盐胁迫下叶绿
体 SOD 活性。Pokkali 和 Peta 中 SOD 活性在盐胁迫
8 d 时 ,外加 AsA 的比不加 AsA 的分别高 27. 8 %和
144. 5 %(图 32A ,B) 。
396　7 期 华 　春等 :外源 AsA 对盐胁迫下水稻叶绿体活性氧清除系统的影响 　　　

图 1 盐胁迫下外源 AsA对水稻 Pokkali( A)和 Peta( B)叶绿体中 H2O2 含量的影响
Fig. 1 Effect of exogenous AsA on H2O2 content in chloroplasts of Pokkali( A) and Peta( B) under salt stress
图 2 盐胁迫下外源 AsA对水稻 Pokkali( A) 和 Peta( B) 叶绿体中 MDA含量的影响
Fig. 2 Effect of exogenous AsA on MDA content in chloroplasts of Pokkali( A) and Peta( B) under salt stress
图 3 盐胁迫下外源 AsA对水稻 Pokkali( A)和 Peta( B)叶绿体中 SOD 活性的影响
Fig. 3 Effect of exogenous AsA on SOD activity in chloroplasts of Pokkali( A) and Peta( B) under salt stress
2. 3 　盐胁迫下外源 AsA对水稻叶绿体中 APX活性
的影响
外源 AsA 处理后 ,Pokkali 和 Peta 叶绿体 APX活
性均明显上升。在 NaCl 和 AsA 处理的 2 d 内 ,
Pokkali 的 APX活性增加较快 ,而 Peta 增加缓慢 ,4 d
均达到高峰 ,此后开始下降。与单独盐胁迫相比 ,盐
胁迫外加 AsA 处理 8 d 时 Pokkali 和 Peta 叶绿体中
APX活性分别高 49. 2 %和 74. 8 %(图 42A ,B) 。
2. 4 　盐胁迫下外源AsA对水稻叶绿体中 GR活性的影响
外源 AsA 可以使未经盐胁迫处理的 Pokkali 和
Peta 叶绿体中 GR 活性一直增加 ,8 d 时 ,分别比对
照高 21. 3 %和 16. 7 %。盐胁迫下 ,供试 2 品种 GR
活性先升后降 ,外源 AsA 处理后 , Pokkali 叶绿体中
GR 活性稍有增加 ,而 Peta 在处理 4 d 后 , GR 活性增
加明显 ,8 d 时比不加 AsA 的高 47. 1 %(图 52A ,B) 。
2. 5 　盐胁迫下外源 AsA 对水稻叶绿体中 AsA 和
GSH含量的影响
外源 AsA 处理后 ,Pokkali 和 Peta 叶绿体中 AsA
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图 4 盐胁迫下外源 AsA对水稻 Pokkali( A)和 Peta( B)叶绿体中 APX活性的影响
Fig. 4 Effect of exogenous AsA on APX activity in chloroplasts of Pokkali( A) and Peta( B) under salt stress
图 5 盐胁迫下外源 AsA对水稻 Pokkali( A)和 Peta( B)叶绿体中 GR活性的影响
Fig. 5 Effect of exogenous AsA on GR activity in chloroplasts of Pokkali( A) and Peta( B) under salt stress
图 6 盐胁迫下外源 AsA对水稻 Pokkali( A)和 Peta( B)叶绿体中 AsA含量的影响
Fig. 6 Effect of exogenous AsA on AsA content in chloroplasts of Pokkali( A) and Peta( B) under salt stress
含量明显比对照高 ,8 d 分别高出 36. 8 %和 62. 5 %。
盐胁迫下 ,外源 AsA 同样增加叶绿体中 AsA 的含
量 ,8 d 时 Pokkali 和 Peta 分别比未加 AsA 的高出
2613 %和 70. 6 %(图 62A ,B) 。
外源 AsA 处理后 ,Pokkali 和 Peta 叶绿体中 GSH
含量分别比对照高 14. 9 %和 23. 0 %。盐胁迫下 ,外
源 AsA 对供试 2 品种叶绿体中 GSH 含量影响不明
显 (图 72A ,B) 。
3 　讨论
AsA 是叶绿体内一个重要抗氧化剂 ,能够直接
或间接地清除 O -·2 、H2O2、1O2、·OH 等活性氧[1 ] 。
APX是叶绿体内清除 H2O2 的关键酶 ,高浓度的 AsA
能够保证 APX 有足够的底物 ,促成叶绿体内 H2O2
的清除[2 ] 。实验结果表明 ,盐胁迫下外源 AsA 可以
减少水稻不同耐盐品种叶绿体内 H2O2 的含量 ,降低
膜脂的过氧化作用 (图 1 ,图 2) ,这一结果与 Shalata
等[6 ]在番茄体内的结果相似。在盐胁迫下外源 AsA
也能抑制向日葵幼苗的脂质过氧化作用[16 ] 。我们
的实验还表明 ,盐胁迫下外源 AsA 能提高不同耐盐
性水稻叶绿体中 SOD、APX、GR 活性 ,增加叶绿体中
AsA 和 GSH含量 (图 3～图 7) ,外源AsA 可以促进盐
胁迫下叶绿体中 AsA2GSH 的循环 ,提高叶绿体中抗
氧化酶活性和抗氧化剂含量 ,缓解由于盐胁迫引起
的过多活性氧对叶绿体的伤害。
596　7 期 华 　春等 :外源 AsA 对盐胁迫下水稻叶绿体活性氧清除系统的影响 　　　

图 7 盐胁迫下外源 AsA对水稻 Pokkali( A)和 Peta( B)叶绿体中 GSH含量的影响
Fig. 7 Effect of exogenous AsA on GSH content in chloroplasts of Pokkali( A) and Peta( B) under salt stress
　　各个不同处理中叶绿体 AsA 含量均表现耐盐
品种 Pokkali 比盐敏感品种 Peta 高约 40 % (图 6) ,
H2O2 的含量也小约 40 % (图 1) ,导致盐敏感品种
Peta 叶绿体内膜脂过氧化产物 MDA 含量增加
20 %～40 %(图 2) 。AsA 存在于类囊体膜和叶绿体
的基质中[6 ] ,而叶绿体中的α2VE 和β2胡萝卜素存在
于膜脂质中 ,并且分别与类囊体上的蛋白质结合[1 ] 。
这样 AsA 就可以通过清除或防止类囊体膜上形成
的·OH ,来保护α2VE 和β2胡萝卜素[17 ] 。在类囊体的
内表面 ,叶绿体中的 AsA 还可以通过α2VE 自由基到
α2VE 的循环来保护α2VE[1 ] 。α2VE 能与 AsA 协同作
用清除叶绿体中的1O2、O
-·2和·OH。盐敏感品种 Peta
叶绿体内 AsA 含量少 ,AsA 对α2VE 的保护作用相对
较小 ,其叶绿体内的膜脂过氧化也就增加。显然
AsA 可以防止盐胁迫下类囊体膜脂的过氧化作用。
AsA 在植物体内的代谢和作用目前还不十分清
楚[18 ] ,但我们在筛选耐盐作物品种时 ,可以将植物
体内的 AsA 含量作为一个指标 ,还可以根据对植物
体内 AsA 的研究 ,寻找并克隆出 AsA 生物合成的关
键酶基因 ,将其转移到某些植物体内或者叶绿体内 ,
通过其表达提高 AsA 含量 ,进而提高作物的抗
盐性。
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