全 文 ：APETALA1突变影响WRKY基因的基础表达
张利平1,2,余迪求1*
(1中国科学院西双版纳热带植物园,云南 昆明暋650223;2中国科学院研究生院,北京暋100049)
摘要:拟南芥APETALA1 (AP1)既是一个花分生组织特征基因又是一个花器官特征基因,在花器官发
育中控制花萼和花瓣的发育。通过GUS染色进一步证实AP1主要在茎尖、花萼、花瓣和花托的位置表
达。启动子分析发现,AP1启动子区包含了包括 W灢box在内的大量顺式作用元件,暗示相关转录调控因
子参与了对AP1的调控。21个WRKY基因单突变后并不改变AP1在花中的表达,但是AP1突变则增强
了检测的10个WRKY基因中7个WRKY基因的表达,暗示AP1参与了对WRKY 基因的基础表达的调
控。这个结果也暗示AP1可能通过控制花萼和花瓣的发育从而参与了对花的基础抗性。
关键词:AP1;W灢box;WRKY;基础表达;基础抗性
中图分类号:Q945,Q75暋暋暋暋暋文献标识码:A暋暋暋暋暋暋文章编号:0253灢2700(2010)04灢355灢06
MutationofAPETALA1AffectstheBasal
ExpressionofWRKYGenes
ZHANGLi灢Ping1,2,YUDi灢Qiu1*
(1XishuangbannaTropicalBotanicalGarden,ChineseAcademyofSciences,Kunming650223,China;
2GraduateUniversityofChineseAcademyofSciences,Beijing100049,China)
Abstract:ThefloralhomeoticgeneAPETALA1(AP1)specifiesfloralmeristemidentityandsepalandpetal
identityinArabidopsis.GUSstainingshowedthattheexpressionofAP1mainlyfocusonshootapex,sepal
andpetal,floralmeristem,junctionofsiliquesandpedicels.Sequenceanalysisshowedthatnumerouscis灢ele灢
mentswerefoundintheAP1promoter,includingtheW灢box,whichindicatedtheregulatedexpressionof
AP1bycertaintranscriptionalfactors.21independentwrkysinglemutantsdidnotaffecttheexpressionof
AP1ininflorescence,however,mutationofAP1enhancedthebasalexpressionofseven WRKYgenesa灢
mongthe10geneschecked.ThisresultimpliedthatAP1mayparticipateinthebasalresistanceofflower
throughcontrolingthedevelopmentofbothsepalsandpetals.
Keywords:AP1;W灢box;WRKY;Basalexpression;Basalresistance
暋 花是高等植物生活史中连接孢子体与配子
体的纽带,花的发育是高等植物发育过程中最引
人瞩目的事件。植物成花调控的发生是由两个相
互联系的阶段组成:第一阶段是从营养分生组织
转换为花序分生组织,受外部和内部环境信号制
约。第二个阶段是从花序分生组织转换为花分生
组织,再由花分生组织产生花器官,此阶段不受
环境信号影响。
在拟南芥中,花分生组织特征基因AP灢
ETALA1 (AP1) 是开花转变以及花器官分化
所必须的。AP1基因是编码 MADS的转录调控
因子,其最早出现在花原基刚刚从花序分生组织
侧端发生时,并在整个花原基中表达,花器官原
基形成后在内两轮的表达降低,后期只在外两轮
云 南 植 物 研 究暋2010,32(4):355~360
ActaBotanicaYunnanica暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋DOI:10灡3724/SP灡J灡1143灡2010灡09250
* 通讯作者:Authorforcorrespondence;E灢mail:ydq@xtbg灡ac灡cn
收稿日期:2009灢12灢22,2010灢02灢04接受发表
作者简介:张利平 (1979-)女,博士研究生,主要从事植物基因功能分析研究。E灢mail:zlp@xtbg灡org灡cn
中表达 (Mandel等,1992),此表达模式是与其
控制花分生组织特异性和花器官形态特征的功能
相一致。AP1突变抑制了花分生组织的形成,
使部分花变成花序状的特征;并且导致花器官的
花萼与花瓣的发育异常 (Bowman等,1993)。
而过表达AP1基因足以使得花序分生组织转变
成花,尽管它并不是特化花分生组织发育必需的
(MandelandYanofsky,1995)。AP1在花分生
组织中的表达还依赖于一些开花时间基因如FT
和FD ,FT作为一个开花的长距离信号,其蛋
白从叶片移动到茎顶端与FD相互作用来激活花
分生组织类别基因AP1的表达 (Abe等,2005;
Wigge等,2005)。
转录调控因子WRKY 基因家族是植物特有
的超级基因家族,其编码的蛋白质含有高度保守
的氨基酸序列 WRKYGQK和Cys2 His2或Cys2
HisCys锌指型结构 (Dong等,2003;Eulgem
等,2000)。WRKY蛋白质通过特异性地结合靶
基因启动子区域的特异序列 (T)TGACC(AT)
而调控相应基因的表达,发挥其分子生物学功能
(Eulgem等,1999;Yu等,2001)。大量的研究
证实 WRKY转录调控因子在植物生长发育、物
质代谢、耐逆等诸多方面发挥生物学功能 (Yu
等,2006)。
本文以拟南芥 (Arabidopsisthaliana)为
材料,利用GUS报告基因分析了AP1的表达模
式,分析了AP1的启动子上的顺式作用元件,
并结合 RT灢PCR 和 Northern 杂交发现22个
WRKY基因单突变不影响AP1的表达,但AP1
的突变影响了部分WRKY基因的表达。
1暋材料和方法
1灡1暋实验材料
选用拟南芥 (Arabidopsisthaliana)的生态型Co灢
lumbia (Col)和 Landsbergerecta(Ler)为实验材料。
种子表面消毒后均匀散布在1/2MS培养基上 (含0灡9%
agar),4曟春化3d,转移到22曟培养箱培养5~7d后
移栽到土中。收集 WT (Columbia)和遗传背景为Co灢
lumbia的各wrky突变体花序;WT (Columbia)和遗传
背景为Columbia的ap1突变体的花序 (ap1灢12和ap1灢
13,弱 突 变;ap1灢11,中 突 变),同 时 收 集 了 WT
(Landsbergerecta)和以Landsbergerecta为遗传背景的
ap1灢1强突变体花序;液氮冷冻并保存于-80曟备用。
1灡2暋质粒构建与农杆菌转化
根据NCBI公布的 AT1G69120序列设计用于AP1
启动子克隆的引物,并通过PCR方法从野生型 (Col)
拟南芥基因组DNA中扩增获得长约1灡7kb的AP1启动
子序列;然后将AP1 启动子插入到载体 pJS131B的
GUS表达框之前,经测序证实后进一步克隆到表达载体
pOCA28上,标记为pAP1暶暶GUS。
农杆菌转化按照CloughandBent(1998)的花序浸
染法操作。
1灡3暋GUS染色
GUS染色方法参考文献报道 (Molier等,1995)。
用预冷的90%丙酮于冰上固定材料20 min,用 GUS
Stainingsolution (withoutX灢Gluc)漂洗固定后的材料3
次 (在冰上进行),然后放入 GUSStainingsolution
(withX灢Gluc)中,并于冰上避光抽真空10min,最后
于37曟下放置12h。用70%酒精脱色后拍照。
1灡4暋Northern杂交
RNA提取采用Trizolreagent(Invitrogen)法。使
用1灡5%甲醛-MOPS琼脂糖凝胶分离RNA后,转移到
尼龙膜上。杂交温度为68曟;杂交液选用PerfectHybTM
Plusbuffer(Sigma灢Aldrich)。探针通过klenowfragment
(Takara)进行32P灢dATP标记。洗膜:2暳SSC和0灡5%
SDS,1次;每次10min;0灡5暳SSC和0灡1%SDS,2次,
每次20min;0灡1暳SSC和0灡1% SDS,1次,每次20
min,最后压片放射自显影。
1灡5暋RT灢PCR
提取拟南芥野生型和各wrky突变体材料的 RNA,
并用DNaseI处理,用来进行RT灢PCR实验。反转录总
体积为20毺l,包含1毺g总RNA,每个反转录产物用水
稀释20倍,然后取2毺l用作PCR模板,其它反转录产
物-80曟保存。ACTIN2作为内标基因;PCR循环数基
于预实验,选择适宜的次数;每组RT灢PCR重复3次以
上。用于 RT灢PCR的引物为:AP1:5曚灢GCACATCCG灢
CACTAGAAAAAA灢3曚and5曚灢CTTCTTGATACAGAC灢
CACCCA灢3曚;ACTIN2:5曚灢TGTGCCAATCTACGAGGG灢
TTT灢3曚and5曚灢TTTCCCGCTCTGCTGTTGT灢3曚。
2暋结果与分析
2灡1暋AP1基因的表达模式
通过基因克隆和遗传操作技术获得了pAP1暶暶
GUS嵌合型基因表达载体。通过农杆菌介导法并
经筛选获得了转基因植株。为了分析其表达谱,
我们首先获得T2代转基因植株,并以此来进行
后续的表达分析工作。GUS染色分析显示 (图
1),AP1启动子驱动的 GUS主要在茎尖、花
653暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋 暋暋暋暋暋暋暋云暋南暋植暋物暋研暋究暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋第32卷
萼、花瓣和花托的位置表达,这与已有的研究结
果一致 (Mandel等,1992)。
图1暋pAP1暶暶GUS转基因植株的GUS染色
A.15天大的幼苗;B.花序;C.荚果
Fig灡1暋GUSstainingofpAP1暶暶GUStransgenicplants
A.15d灢oldseedling;B.inflorescences;C.siliques
2灡2暋AP1启动子分析
根据AP1的表达模式,我们发现AP1和一
些WRKY基因的表达模式存在重叠现象 (GUS
染色,microarrayanalysis),同时通过查询NC灢
BI数据库,我们也发现有大量的WRKY 基因在
花序中有表达,这些结果暗示AP1和WRKY 基
因之间存在某种表达调控关系。真核生物的转录
调控大多是通过顺式作用元件和反式作用因子复
杂的相互作用而实现的,因此可以通过分析靶基
因启动子上顺式作用元件来预测相关基因对靶基
因的调控。因此我们首先通过PLACE (http://
www灡dna灡affrc灡go灡jp/PLACE/signalscan灡html)
分析了AP1 启动子上的顺式作用元件来寻找
WRKY蛋白是否参与调控AP1基因的线索。如
表1所示在AP1长约1灡7kb的启动子上存在若
干顺式作用元件,如 G灢box,C灢box,LFY灢bs,
W灢box等。顺式作用元件的存在暗示了相关基
因对AP1的调控。这里我们将重心放在了 W灢
box,通过序列分析发现,在1灡7kb的启动子上
包含了8个完整的TGAC核心序列,其中7个
为完整的TTGAC序列 (W 盒)。从理论上讲,
靶基因启动子区域内的单个 W 盒序列就能有效
满足 WRKY 蛋白质的调控所需 (Eulgem 等,
1999),而AP1启动子区域内存在如此多的 W
盒序列,其表达应该受到WRKY基因的调控。
2灡3暋WRKY基因单突变不影响AP1基因的表达
AP1启动子区大量 W灢box的存在暗示在植
物体内 WRKY蛋白可能参与了对AP1基因的表
达调控。因此为了确定某个特异 WRKY蛋白是
否参与了对AP1 基因的表达调控,我们通过
RT灢PCR检测了AP1基因在21个WRKY 基因
单突变体的花序中的表达情况。如图2所示,与
WT相比,在所有检测的WRKY 基因单突变背
景下花序中AP1的表达没有多大区别,这与我
们观察到的所有WRKY 基因单突变花序和野生
型没有多大区别的结果是一致的。对于这种结
果,我们认为主要与在WRKY基因中存在的功能
上的冗余性有关,在Zhang (2003)的研究中也
指出了由于WRKY 基因之间存在冗余性,单个
WRKY基因的突变很少会显示出表型上的改变。
2灡4暋AP1突变影响了WRKY基因的基础表达
以上结果证实单个WRKY基因的突变不影响
AP1的表达,这可能是由于 WRKY蛋白之间功
能上的冗余性造成的,并不能排除WRKY 基因
对AP1的调控,因此我们也检测了若干WRKY
基因在ap1突变体背景下的表达。分别提取了
野生型拟南芥花 (Col生态型和Ler生态型),
7533期暋暋暋暋暋暋暋暋暋张利平和余迪求:APETALA1突变影响WRKY基因的基础表达暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋
表1暋拟南芥AP1基因启动子的顺式作用元件
Table1暋Cis灢actingelementsoftheAP1genepromoter
调控序列名称
Nameofregulatorysequences
核心序列Coresequence 作用Function
TATA灢box TATA Corepromoter
CAATBOX CAAT Tissue灢specificresponse
灢300ELEMENT TGHAAARK Enhancerandtissue灢specificresponse
灢10PEHVPSBD TATTCT Lightresponse
G灢box CACGTG Lightresponse
GT1CONSENSUS GRWAAW Lightresponse
SORLREP3AT TGTATATAT Lightresponse
IBOXCORE GATAA Lightresponse
INRNTPSADB YTCANTYY Lightresponse
GATABOX GATA Lightandtissue灢specificresponse
EVENINGAT AAAATATCT Eveningelement
REALPHALGLHCB21 AACCAA Phytochromeregulation
circadian CAANNNNATC Circadiancontrol
CACTFTPPCA1 YACT Carbonmetabolism
DOFCOREZM AAAG Carbonmetabolism
GTGAmotif GTGA Polendevelopment
POLLEN1LELAT52 AGAAA Polendevelopment
CURECORECR GTAC Copperresponse
SURECOREATSULTR11 GAGAC Sulfur灢responsive
CCAATBOX1 CCAAT Heatresponse
CBFHV RYCGAC Coldresponse
LTRECOREATCOR15 CCGAC ColdandABAresponse
DPBFCOREDCDC3 ACACNNG ABAresponse
EBOXBNNAPA CANNTG ABAresponse
PYRIMIDINEBOXHVEPB1 TTTTTTCC GAandABAresponse
GADOWNAT ACGTGTC GAresponse
GARE2OSREP1 TAACGTA GAresponse
GAREAT TAACAAR GAresponse
PYRIMIDINEBOXOSRAMY1A CCTTTT GAresponse
ERELEE4 AWTTCAAA ETresponse
T/GBOXATPIN2 AACGTG JAresponse
NTBBF1ARROLB ACTTTA Auxinandtissue灢specificresponse
ARR1AT NGATT Cytokininresponse
MYB1AT WAACCA Dehydrationresponse
MYB2CONSENSUSAT YAACKG Dehydrationresponse
GT1GMSCAM4 GAAAAA Pathogenandsaltresponse
BIHD1OS TGTCA Defenceresponse
ASF1MOTIFCAMV TGACG Biotic/abioticresponse
W灢box TTGAC Biotic/abioticresponse,development
图2暋 AP1基因在wrky突变体中的表达分析
Fig灡2暋ExpressionanalysisofAP1insinglewrkymutants
AP1wasdetectedusingRT灢PCRafterRNAwasdigestedwithDNaseI.
Thisexperimentwasrepeatedforthreetimeswithsimilarresults
853暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋 暋暋暋暋暋暋暋云暋南暋植暋物暋研暋究暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋第32卷
ap1灢1 (Ler),ap1灢11,ap1灢12和ap1灢13 (Col)
4种ap1突变体花的总RNA,并通过 Northern
杂交检测了这10个WRKY 基因在突变体花中
的表达相对于野生型是否发生变化。如图3所
示,在这10个WRKY 基因中有7个WRKY 基
因 (WRKY7灡11灡15灡17灡32灡51灡70)在各ap1突
变体花中的表达相对于野生型中有较大幅度的提
高,同时越是强突变相应WRKY 基因的表达就
越强,这在Ler生态型中表现得更加明显 (图
2)。因此 AP1 基因的突变确实影响了相关
WRKY基因的表达,暗示着AP1基因可能参与
了WRKY基因的表达调控。
图3暋 WRKY基因在ap1突变体中的表达
(在检测的10个WRKY基因中,WRKY7,WRKY11,WRKY15,
WRKY17,WRKY32,WRKY51和WRKY707个 WRKY基因
在突变体中相对于野生型有较强表达)
Fig灡3暋ExpressionofWRKYgenesinap1mutants
MutationofAP1enhancedthebasalexpressionofseven WRKY
genes(WRKY7,WRKY11,WRKY15,WRKY17,WRKY32,
WRKY51andWRKY70)amongthe10geneschecked.Ethidium
bromidestainingofrRNAfortheblotisdisplayedtodemonstrate
equalloadingofRNAineachlane
3暋讨论
AP1作为重要的花调控发育基因,研究其
在转录水平上的作用具有重要的意义。通过报告
基因GUS染色我们进一步证实了AP1的表达模
式,和前期的工作一致,AP1主要在茎尖、花
萼、花瓣和花托等部位表达,这与AP1的功能
是相符的。
虽然前期已有大量的工作证实AP1受到众
多基因的调控,但是经过启动子分析,我们发现
AP1很可能受到包括比如WRKY基因在内的众
多其他转录调控因子的调控。前期的研究认为
WRKY转录调控因子蛋白通过结合靶基因启动
子上的核心或完整的 W 盒 (TTGACorTT灢
GACC/T)而起到调控作用的,并且认为核心
序列是TGAC的序列就具备一定的 W 盒功能
(Ciolkowsk等,2008)。启动子序列分析发现,
在AP1基因1灡7kb的启动子区域内,包含了8
个含有核心或完整的 W 盒。因此,我们认为
WRKY蛋白很可能参与了对AP1的调控。同时
通过对比AP1和部分WRKY基因的表达谱,我
们发现两者的表达模式存在重叠现象 (GUS染
色,microarrayanalysis),这 进 一 步 暗 示 了
WRKY蛋白对AP1的调控。
通过报告基因GUS接不同W盒突变的AP1
启动子后的GUS活性分析发现,单个 W 盒的
突变对于AP1启动子的活性的改变不是很大,
而当AP1启动子上的 W 盒全突变以后,发现
AP1启动子的活性发生了很大改变 (待发表资
料)。虽然已经证实单个 W 盒的存在对 WRKY
蛋白的结合调控就足够了,但是根据我们的结
果,我们认为 W 盒之间很可能存在冗余性,单
个 W盒的突变可以通过启动子其它位点 W 盒的
互补而得到补充。同时通常突变体的分析对于理
解调控网络具有重要的意义,因此我们也尝试了
AP1在不同WRKY基因突变体中的表达。我们
共检测了21个WRKY 基因突变体,发现AP1
在这些突变体中的表达没有多大改变,这与在表
型上单个WRKY突变体没有多少改变是一致的。
对于这种结果,我们认为是由于WRKY基因间存
在的功能上的冗余性造成的。在Zhang (2003)
的研究中也指出由于WRKY 之间存在冗余性,
单个WRKY基因的突变很少会显示出表型上的
9533期暋暋暋暋暋暋暋暋暋张利平和余迪求:APETALA1突变影响WRKY基因的基础表达暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋
改变。因此结合上述的结果,我们认为WRKY
基因和 W灢box一样,都存在冗余性,这在一定
程度上增加了我们鉴定 WRKY 基因功能的难
度。这个问题可能在未来通过构建WRKY 基因
多突变上得到一些线索。
目前WRKY基因的功能研究主要在抗逆性
特别是在生物逆境方面 (Yu等,2006),而目前
关于花生物逆境方面的研究甚少。花器官的缺失
可能会影响植物花对生物逆境或非生物逆境的抗
性,所以我们认为AP1也可能在抗逆性方面起
作用。在检测的10个 WRKY 基因中有7个
WRKY基因在AP1各突变体花中的表达相对于
野生型中有较大幅度的提高,同时越是强突变相
应WRKY基因的表达就越强,这在Ler生态型
中表现得更加明显 (图3)。这些结果暗示着AP1
基因可能参与对某些WRKY 基因的表达调控。
在这7个 WRKY 基因中,已经证实 WRKY7,
WRKY11,WRKY17和WRKY70在生物逆境中
起作用 (Kim 等,2006;Li等,2004;Journot灢
Catalino等,2006),因此这些WRKY基因表达的
改变,暗示AP1可能通过控制花萼和花瓣的发育
从而在花抗性方面起到调控作用。
致谢暋ZhixiangChen教授 (DepartmentofBotanyand
PlantPathology,PurdueUniversity,WestLafayette,In灢
diana,USA)赠送了T灢DNA插入的wrky突变体。
暡参暋考暋文暋献暢
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