全 文 ：Science and Technology of Food Industry 研究与探讨
2014年第6期
山桃稠李果实花色苷对
Nrf2/Keap1通路的影响
刘 荣，姜元松，辛 越，王 蕾，杨巍巍
（东北林业大学，黑龙江哈尔滨 150040）
摘 要：目的：探讨山桃稠李果实花色苷对Nrf2/Keap1通路的影响。方法：质量浓度为0.05、0.2、0.8mg/mL的山桃稠李果
实花色苷分别作用于HepG2细胞24、48、72h，MTT法检测对HepG2细胞生长抑制率，检测各组细胞内谷胱甘肽（GSH）
含量及谷胱甘肽硫转移酶（GSH-ST）、磷酯酰肌醇-3-激酶（PI3K）活性变化；实时荧光定量RT-PCR实验方法检测山
桃稠李果实花色苷对HepG2细胞的Nrf2、Keap1、GSTP1的基因表达的影响。结果：随着花色苷质量浓度的增加，HepG2
细胞的谷胱甘肽（GSH）含量下降，谷胱甘肽硫转移酶（GSH-ST）、磷酯酰肌醇-3-激酶（PI3K）活性显著降低；Nrf2、
Keap1、GSTP1的基因表达下调。结论：山桃稠李果实花色苷能够通过对Nrf2/Keap1通路的调节来降低HepG2细胞的抗
氧化能力。
关键词：山桃稠李，花色苷，HepG2细胞，Nrf2，Keap1
Effect of Prunus Maackii fruit anthocyanins on Nrf2/Keap1 pathway
LIU Rong，JIANG Yuan-song，XIN Yue，WANG Lei，YANG Wei-wei
（Northeast Forestry University，Harbin 150040，China）
Abstract：Objective：To study the effect of Prunus maackii fruit anthocyanins on Nrf2/Keap1 pathway. Methods：
The HepG2 cells were treatet with concentration of 0.05，0.2，0.8mg/mL Prunus maackii fruit anthocyanins
solution for 24，48，72h respectively. The growth inhibition rate of HepG2 cells and the content of glutathione
（GSH），activity of phosph oinositol-3-kinase（PI3K） of each group cells were determined by the method of
MTT. The real-time fluorescent quantitative RT-PCR method was used to study the effect of Prunus maackii
fruit anthocyanins on Nrf2，Keap1，GSTP1 in HepG2 cells in genetic expression. Results：The results showed
that as the content of anthocyanins increased，the content of GSH of HepG2 cells deceased，and the activity of
glutathione s-transferases（GSH-ST） and PI3K decreased significantly. The Nrf2，Keap1，GSTP1 gene expression
level dropped. Conclusion：the Prunus maackii fruit anthocyanins could reduce antioxidant capacity of HepG2
cells by adjusting the Nrf2/Keap1 pathway.
Key words：Prunus maackii；anthocyanins；HepG2 cells；Nrf2；Keap1
中图分类号：TS201.1 文献标识码：A 文 章 编 号：1002-0306（2014）06-0116-04
收稿日期：2013－07－08
作者简介：刘荣（1971－），女，博士，副研究员，研究方向：食品营养学
与功能性食品。
基金项目：中央高校基本科研业务费专项资金（DL12CA11）。
山桃稠李（Padus maackii）为蔷薇科稠李属的三
种植物，在我国南北部地区均有分布生长，是多年生
的落叶乔木[1]。我国学者在此植物的种植技术等方面
研究颇多，而对其果实的花色苷抗氧化机制的研究
利用未见报道。
本实验以山桃稠李果实花色苷作为抗氧化酶的
诱导物，探究花色苷作用于HepG2细胞后，抗氧化系
统的分子机制。从mRNA水平上分析花色苷对HepG2
细胞的GSTP1、Nrf2、Keap1的基因表达的影响，探讨
PI3K-Nrf2/Keap1信号通路在HepG2细胞抗氧化机制
中的作用，以期为今后研究山桃稠李果实花色苷提
供理论依据。
目前研究发现，调控抗氧化酶的表达的途径较
多，其中诱导物对Nrf2/Keap信号通路的调控的途径
研究的比较明确[2-3]。在正常状态下，Nrf2/Keap1复合
物被控制在胞浆中，当受到诱导物的诱导后，Nrf2从
Nrf2/Keap1复合物上解偶联释放，进入核内与ARE相
互作用，促进抗氧化酶基因的转录。并且研究表明，
磷酯酰肌醇-3-激酶（phosph oinositol-3-kinase，
PI3K）能够激活Nrf2使其进入细胞核，并引起抗氧化
基因表达上调[4]。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
肝癌HepG2细胞 哈医大肿瘤医院馈赠；山桃
稠李 哈尔滨双环园林采摘；小牛血清 杭州四季
青产品；噻唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO） Sigma
进口分装；改良型RPMI 1640培养基 赛默飞世尔生
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研究与探讨
2014年第6期
Vol . 35 , No . 06 , 2014
物化学制品有限公司；胰蛋白酶（2×105U/g） Sigma
公司；双抗试剂（100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素）
北京索莱宝试剂公司；磷酯酰肌醇-3-激酶（PI3K）、
焦炭酸二己醋（DEPC） Sigma公司；Trizol氯仿、总
RNA提取试剂盒 北京赛百盛基因技术有限公司；
RT-PCR试剂盒 宝生物工程（大连）有限公司；
2000bPDNALadder 宝生物工程有限公司。
DF-110型电子分析天平 中国轻工业机械总
公司；GL-16G-C型高速冷冻离心机 上海科兴仪器
有限公司；低温冰箱 美国FORMA公司；酶标仪 美
国Biocell公司；CO2培养箱 Thermo Forma公司；倒置
显微镜 Nikon公司；ABI PRISM 7500型荧光定量
PCR扩增仪 Applied Biosystems公司。
1.2 实验方法
1.2.1 花色苷的制备 分别取山桃稠李果实适量剪
枝，榨汁，同pH=2的酸化乙醇按照料液比1∶4（W∶V）
混合，提取2次，每次提取12h，合并提取液，旋转蒸发
除去乙醇后，经X-5大孔树脂上柱纯化，减压浓缩，真
空冷冻干燥得到山桃稠李果实花色苷粉末，-20℃保
存。实验时将山桃稠李果实花色苷用PBS缓冲液稀释
到一定浓度，0.22μm滤膜过膜备用[5]。
1.2.2 细胞的复苏与培养 从液氮中取出冻存的
HepG2细胞迅速放入37℃水浴1min，并不断摇动使其
解冻。1000r/min离心5min，吸取上清液，培养于改良型
RPMI 1640培养基中加入l00U/mL青霉素，100μg/mL
链霉素以及10%的灭活胎牛血清的培养液中。将细
胞置于37℃，5% CO2培养箱中培养，HepG2细胞在细
胞培养瓶贴壁生长，每种培养液培养细胞均大于3
次，每3~4d传代一次。
1.2.3 MTT法检测HepG2细胞生长抑制率 参照文
献[6]，取对数生长期的HepG2细胞，经胰酶消化后，
调整细胞密度为1×105Cell/mL，接种于96孔培养板，每
孔100μL，将未经处理的细胞作为对照组，质量浓度
为0.05、0.2、0.8mg/mL的花色苷的细胞作为处理组，只
加花色苷和培养液而不含细胞的为空白组。其中处
理组、对照组及空白组每个浓度各设3个复孔。培养
24、48、72h后，每孔加入10μL MTT，继续培养4h，弃
上清液，每孔加入150μL DMSO，利用酶标仪在490nm
测A值，并计算细胞的生长抑制率。公式如下：
细胞生长抑制率（%）=[1-（处理组A值-空白组A
值）/（对照组A值-空白组A值）]×100
1.2.4 细胞内GSH含量与GSH-ST、PI3K活性的测定
参照文献[7]的作法并有所改进，取对数生长期的细
胞105Cell/mL均匀铺于24孔板，待细胞贴壁生长后更
换培养液，实验组加入质量浓度为0.05、0.2、0.8mg/mL
的山桃稠李果实花色苷的培养液，对照组加入正常的
细胞培养液。在37℃，5% CO2培养箱中继续培养48h
后，弃培养液，PBS清洗两遍，胰酶消化，1000r/min
离心5min后收集细胞，细胞裂解液裂解细胞，离心
后得细胞上清液，取适量进行蛋白质含量测定。按试
剂盒说明进行操作，测定GSH含量与GSH-ST、PI3K
活性。
1.2.5 山桃稠李花色苷对Nrf2/Keap1的基因表达的
影响 实时荧光定量RT-PCR实验方法检测山桃稠
李果实苷对HepG2细胞的Nrf2、Keap1、GSTP1的基因
表达的影响。Gene Bank中找到Nrf2、Keap1、GSTP1基
因序列，并利用加拿大Premier公司的Primer primer
5.0引物设计软件进行引物的设计，委托博仕生物公
司进行合成。采用Trizol法提取细胞总RNA，紫外分
光光度计测定总RNA的含量与纯度，反应条件设置
为预变性温度95℃时间10min，变性温度95℃时间
15s，退火温度60℃时间30s，延伸温度72℃时间30s，
循环40次，缓慢升温的温度60~95℃，产生溶解曲线。
所有样本重复检测3次，每次均设空白对照，以
GAPDH作内参基因。反应结束后，使用ABI PRISM
7500型荧光定量PCR扩增仪检测样品中目标基因的
含量，以2-ΔΔCT作为目的基因的表达量，2-ΔΔCT表示处
理组的目的基因相对于对照组原始模板浓度的倍数
差异。
1.3 数据分析
作图采用Origin 8.0软件，统计学处理实验数据
采用SPSS 13.0统计软件，One-Way ANOVA进行处理
和显著性分析检验，在p＞0.05水平上差异不显著；在
p＜0.05水平上差异显著。
2 结果与分析
2.1 山桃稠李果实花色苷对HepG2细胞增殖抑制
结果
山桃稠李果实花色苷作用HepG2细胞24、48、
72h后，结果如表1所示。随着花色苷浓度的升高以及
作用时间的延长，对HepG2细胞增殖的抑制作用都
逐渐增强，并呈浓度依赖与时间依赖。与对照组（未
经处理的细胞）相比差异显著（p＜0.05），并且在同一
时间点各浓度之间，同一浓度各时间点之间，山桃稠
李果实花色苷对HepG2细胞的抑制率均有显著差异
（p＜0.05）。当质量浓度为0.8mg/mL山桃稠李果实花
色苷处理HepG2细胞24、48、72h后，抑制率分别为
30.79%±2.38%、47.77%±3.61%、54.11%±3.47%。
2.2 细胞内GSH含量与GSH-ST、PI3K活性的测定
结果
山桃稠李果实花色苷作用于HepG2细胞48h后，
由表2可知，随山桃稠李花色苷质量浓度的增大，GSH
的含量与对照组相比逐渐减少，且呈一定的量效关
质量浓度（mg/mL）
抑制率（％）
24h 48h 72h
0 0 0 0
0.05 3.61±1.31* 6.41±2.53* 10.22±3.19*
0.2 14.22±1.18* 21.68±1.49* 26.79±2.76*
0.8 30.79±2.38* 47.77±3.61* 54.11±3.47*
表1 MTT法检测山桃稠李果实花色苷对HepG2细胞抑制率
Table 1 Inhibition of the anthocyanin extracted from
Prunus maackii on the proliferation of HepG2 cell tested by MIT
注：0mg/mL为对照组，0.05~0.8mg/mL为处理组，在花色苷作
用HepG2细胞相同时间下，处理组与对照组比较，*表示p<0.05
差异显著；**表示p<0.01差异极显著；表2、图1同。
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Science and Technology of Food Industry 研究与探讨
2014年第6期
系，质量浓度为0.05mg/mL山桃稠李花色苷与对照组
相比差异显著（p＜0.05），且当质量浓度大于0.2mg/mL
时，HepG2细胞内GSH的含量与对照组相比差异极显
著（p＜0.01）。细胞内GSH-ST的活性出现下降趋势，
即随着花色苷质量浓度的增大，GSH-ST的活性逐渐
降低：当质量浓度为0.05mg/mL时，山桃稠李与对照
组的差异显著（p＜0.05）；当质量浓度大于0.2mg/mL
时，与对照组的差异极显著（p＜0.01）。而在检测PI3K
活性时发现处理组的OD值虽均大于对照组，但却随
着三种果实花色苷质量浓度的升高PI3K激酶的活性
在逐渐降低，且各浓度与对照组比差异极显著（p＜
0.01），呈量效关系。
2.3 山桃稠李花色苷对Nrf2、Keap1、GSTP1的基
因表达的影响
2.3.1 山桃稠李花色苷对GSTP1的基因表达的影响
采用实时荧光定量RT-PCR法，深入探讨稠李属果实
花色苷对GSTP1 mRNA在HepG2细胞中的表达的影
响。结果如图1所示，山桃稠李果实花色苷作用于
HepG2细胞48h后，GSTP1 mRNA的表达与对照组相
比较均下调，且随花色苷质量浓度的增大而逐渐降
低。与对照组相比较GSTP1 mRNA的表达水平极显
著降低（p＜0.01），说明山桃稠李果实花色苷影响了
HepG2细胞中GSTP1的转录因子的表达，从而下调了
HepG2细胞的抗氧化酶的表达。
2.3.2 山桃稠李花色苷对Nrf2的基因表达的影响
本实验同时探讨了稠李属果实花色苷对PI3K-Keap1/
Nrf2通路的影响，检测了山桃稠李果实花色苷作用
HepG2细胞48h后，Nrf2 mRNA在细胞中的表达情况。
结果见图1，山桃稠李果实花色苷作用于HepG2细胞
48h后，Nrf2 mRNA的表达均随花色苷质量浓度的增
大而逐渐降低。与对照组相比较Nrf2 mRNA的表达
水平极显著降低（p＜0.01），说明由于花色苷的作用，
PI3K激酶活力的下降，抗氧化系统受到破坏，影响了
Nrf2与Keap1解离。
2.3.3 山桃稠李花色苷对Keap1的基因表达的影响
为进一步探究稠李属果实花色苷对PI3K-Keap1/Nrf2
通路的影响，检测了山桃稠李果实花色苷作用HepG2
细胞48h后，Keap1 mRNA在细胞中的表达情况。结果
如图1所示，在花色苷的质量浓度为0.05mg/mL时，山
桃稠李与对照组比较差异不显著（p＞0.05）。在花色
苷的质量浓度增加到0.2mg/mL时，山桃稠李与对照组
相比Nrf2 mRNA的表达水平均极显著降低（p＜0.01）。
并且，山桃稠李果实花色苷作用于HepG2细胞48h后，
Keap1的基因表达均随花色苷质量浓度的增大而下
调。说明由于花色苷的作用，使得Nrf2与Keap1的基
因表达量均有所减少。
3 结论与讨论
GSTP1属于谷胱甘肽转移酶系（GSTs），存在于
胎盘和肺脏中，是重要的解毒酶。能够保护正常细胞
免有毒化合物的攻击，分解代谢有毒物质，若抑制
GSTP1的活性则可增强DNA损伤的敏感性。GSTP1在
HepG2等肿瘤细胞组织中易表达调控，具有紧密的
关系且大量存在[8]。
在细胞内调节抗氧化反应的一个重要的核转录
因子为Nrf2，正常状态下，与Keap1结合，同时被一些
活性酶类降解，使细胞内部处于动态平衡状态。但当
Nrf2受外界因子及自身蛋白激酶（PKC）的影响而激
活后，Nrf2与Keap1解离后进入细胞核内，影响抗氧
化酶的表达[9]。
由山桃果实花色苷对HepG2细胞抗氧化系统的
影响实验结果[10]可知，细胞内抗氧化酶GSH-ST的活
性随着花色苷质量浓度的增大而逐渐降低，细胞内
GSH的含量也随着花色苷质量浓度的增大而逐渐减
少，即GSH-ST活性以及GSH的含量均出现下降的趋
势。花色苷可引起HepG2细胞内PI3K激酶活性的降
低，而PI3K途径参与了Nrf2/Keap1激活及其基因表达
的调控。所以当PI3K激酶活性的降低时，Nrf2、Keap1
的mRNA的表达受到抑制，使得Nrf2、Keap1的含量
降低，Nrf2与抗氧化反应原件结合减小，导致抗氧化
酶GSTP1mRNA的表达下调。而山桃稠李果实花色
苷可通过降低胞内抗氧化酶活性而增加HepG2细胞
内的ROS含量，ROS又会直接攻击抗氧化酶，迫使细
胞内氧化应激压力增加导致细胞过氧化损伤，甚至
凋亡。
近些年，Keap1/Nrf2信号通路成为抗氧化机制研
究的热点[11-14]。但机体的抗氧化机制依然存在许多无
法解释说明的问题，仍需要更深入的研究。
质量浓度
（mg/mL）
GSH含量
（nmol/mL）
GSH-ST
（U/mg prot）
PI3K
（OD）
0 34.29±2.17 36.32±2.90 0.064±0.006
0.05 31.76±0.95* 33.12±1.75* 0.229±0.011**
0.2 24.92±1.30** 25.21±2.56** 0.208±0.010**
0.8 16.42±2.54** 17.98±0.68** 0.193±0.014**
表2 山桃稠李花色苷对HepG2细胞内GSH含量及GSH-ST、
PI3K激酶活性的影响
Table 2 Effect of anthocyanins extracted from Prunus maackii
on the content of GSH and activity of GSH-ST、PI3K in the
HepG2 cells 图1 山桃稠李花色苷对Nrf2、Keap1、GSTP1的基因表达的影响
Fig1 Effect of anthocyanins extracted from Prunus maackii on
Nrf2、Keap1、GSTP1 in genetic expression
质量浓度（mg/mL）
0 0.05 0.2 0.8
1.5
1.2
0.9
0.6
0.3
0
基
因
相
对
表
达
量
GSTP1
Nrf2
Kleap1
**
**
**
*
**
**
**
**
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