全 文 ：鼠尾藓不同居群间形态及 RAPD 分析?
刘 丽 , 朱永青 , 王幼芳??
(华东师范大学 生命科学学院 , 上海 200062)
摘要 : 选取采自黑龙江、内蒙古、陕西以及浙江地区的 8 个居群的鼠尾藓为实验材料 , 对不同居群的鼠尾
藓叶片的形态、叶细胞的大小及植物体的形态进行了观察比较 , 同时运用随机扩增多态性 DNA ( RAPD)
探讨了鼠尾藓的遗传多样性。利用 13 条随机引物共获得 104 个条带 , 其中多态性条带占 84 .62 %。鼠尾藓
各居群间的 Dice遗传距离为 0.37～ 0.66。POPGENE32 软件分析得到种的 Nei 基因多样性指数 (H ) 为
0 .3326 , Shannon指数 (I ) 为 0 .4877 , 遗传分化系数 (GST ) 为 0 .3303。形态学观察的结果表明 , 鼠尾藓的
植物体及叶片的形态在居群间变异较小 , 很好地代表了这个种的特征 ; 而叶细胞的大小及叶尖长度的变异
程度较大 , 说明这些形态特征易受环境影响 , 代表了种下水平的差异。不同居群的鼠尾藓无论在遗传上还
是在形态上都表现出明显的多样性 , 说明鼠尾藓具有较强的适应环境的能力。
关键词 : 鼠尾藓 ; 遗传多样性 ; RAPD; 形态特征
中图分类号 : Q 943 文献标识码 : A 文章编号 : 0253 - 2700(2006)06 - 570 - 05
Morphological and RAPD Analyses of Different Myuroclada
maximowiczii (Brachytheciaceae) Populations
LIU Li , ZHU Yong-Qing, WANG You-Fang**
( School of Life Science, East China Normal University, Shanghai 200062 , China)
Abstract: The shapes of leaves, sizes of median laminal cells and forms of plantswere compared among eight Myuroclada
maximowiczii populations fromHeilongjiang, Shaanxi , Zhejiang province and Inner Mongolia . The genetic diversity of dif-
ferent M. maximowiczii populations were also studied, using random amplified polymorphic DNA ( RAPD) . 104 RAPD
bands from13 primerswereanalyzed, of which84 .62% werepolymorphic . TheDicegenetic distancesamongeight M. ma-
ximowiczii populations varied from0 .37 to 0.66 . POPGENE analysis showed that the Nei’sgene diversity was 0.3326 , and
Shannon’s Information index was 0.4877 , and GST was 0 .3303 . According to morphological observations, the shapes of
leaves and plants are very stable in populations, which indicatethe species characters; but the sizesof median laminal cells
and leaf tips are different, suggesting that they are deperdent on environment and could be the subspecies characters . The
results showthat there are obvious diversity among different M. maximowiczii populations, in light of both genetic andmor-
phological characters . The results indicates that M. maximowiczii can adapt to various environment .
Key words: Myuroclada maximowiczii; Genetic diversity; RAPD; Morphological characters
鼠尾藓 ( Myuroclada maximowiczii ( Borszcz .)
Steere et Schof .) 是青藓科鼠尾藓属 ( Myuroclada
Besch .) 植物 , 全世界仅一种 , 广泛分布于中
国、日本、朝鲜半岛、俄罗斯远东地区及北美西
部。植物体呈鲜绿色或淡绿色 , 茎匍匐 , 上生鳞
片状叶 , 枝直立或倾立 , 密生覆瓦状排列的叶 ,
枝端渐尖 , 呈鼠尾状 ( 胡人亮和王幼芳 , 2005 ) ,
故名鼠尾藓。在我国北方鼠尾藓分布较广 , 且外
云 南 植 物 研 究 2006 , 28 (6) : 570～574
Acta Botanica Yunnanica
?
?? ?通讯作者 : Author for correspondence . E - mail : yfwang@ bio. ecnu. edu. cn
收稿日期 : 2006 - 02 - 10 , 2006 - 07 - 06 接受发表
作者简介 : 刘丽 ( 1980 - ) 女 , 博士生 , 主要研究领域 : 苔藓植物系统学。 ?
基金项目 : 国家自然科学基金 30570124、30370113
形似鼠尾 , 在野外易于分辨。苔藓植物大多生活
在阴湿的环境 , 对环境要求苛刻 , 由于人类活动
对自然环境的破坏 , 苔藓植物的生存环境也受到
了威胁。通过多年的研究发现 , 苔藓植物很难在
室内培养及移植 , 因此苔藓植物的保护工作尤为
艰巨。物种的遗传多样性与其生存力之间具有相
关性 , 遗传多样性越高 , 适应环境变化的能力越
强 , 越容易扩展其分布范围和开拓新的环境 , 即
使对无性繁殖占优势的种也不例外 ( Huenneke,
1991) 。生物多样性研究也是制定保护对策的有
用工具 ( Wu等 , 2004)。鼠尾藓虽然是我国广布
种 , 但其居群的分布范围比较狭小 , 因此有必要
对其进行遗传多样性研究 , 以其对苔藓植物的保
护提供理论依据。
随机扩增多态性 DNA ( randomamplified poly-
morphic DNA , RAPD) 技术具有简单、快速、无
需知道研究对象的遗传背景、所需的样本少且所
包含的信息量大等优点 , 是研究遗传多样性的一
种常用的标记。RAPD 技术标记的是显性遗传 ,
不能区分纯合 ( AA ) 与杂合 ( Aa) 的基因型
(邹喻苹等 , 2001) , 而苔藓植物生活史中单倍的
配子体占优势 , 这就避免了 RAPD 的这种显性标
记 所 带 来 的 问 题。 Dale 等 ( 1999 ) , Selkirk
( 1997 ) , Skotnicki 等 ( 1998 a, b , 2002 ) 利 用
RAPD 技术研究了南极洲、澳大利亚、新西兰等
地苔藓植物的遗传变异 , 说明该技术可以应用于
苔藓植物遗传多样性的研究。
本文拟通过对采自黑龙江、内蒙古、陕西以
及浙江等地的鼠尾藓进行 RAPD 分析 , 并结合形
态特征的比较 , 探讨鼠尾藓不同居群间遗传变异
程度 , 为经典分类补充可供参考的依据 , 并为中
国苔藓植物多样性的保护提供基础的资料。
1 材料与方法
1 .1 材料
实验材料分别采自黑龙江五营、五大连池老黑山 ,
陕西秦岭佛坪自然保护区 , 内蒙古阿尔山塔尔滨湖周围
沼泽 , 浙江西天目山 (表 1)。标本采集后自然晾干 , 冷
冻保存备用。凭证标本保存于华东师范大学生物系标本
馆 (HSNU)。
1 .2 形态观察
每个居群随机选取 7 个植物体 , 用 Olympus解剖镜
观察植物体的形态及分枝情况 ; 每个植株取枝条中部的
叶片 4～5 片 , 在 Olympus显微镜下用目微尺测量叶中部
细胞的长、宽以及叶尖的长短 , 并计算细胞的长宽比 ,
比较鼠尾藓在居群内及居群间的形态差异。测量数据用
SPSS10 .0 软件进行统计分析 , 并用 JMP5 .1 软件进行 Hi-
erarchical 聚类分析。
表 1 鼠尾藓各居群采集情况表
Table 1 The collecting information of different
Myuroclada maximowiczii populations
居群 采集地 生境 海拔 (m) 标本采集号
Popul- Collecting Habit Altitude Collecting
ation location No .
qa 陕西秦岭佛坪自然保 石上薄土生 1860 ?44 ^
护区偏崖子保护站
qb 陕西秦岭佛坪自然保 树基生 2100 ?609 D- 2
护区凉风垭
qc 陕西秦岭佛坪自然保 石生 2000 ?349 p
护区偏崖子保护站
qd 陕西秦岭佛坪自然保 石生 1500 ?1484
护区三官庙保护站到
光头山途中
nmg 内蒙古阿尔山塔尔滨 石生 1250 ?491 p
湖周围沼泽
hei 黑龙江伊春市五营 马路边石生 200 276 p
lao 黑龙江五大连池老黑山 砂土生 400 309 p
tian 浙江西天目山 水沟边石生 350 15 ^
1 .3 DNA 的提取和 RAPD 扩增
1 .3 .1 DNA 的提取 选择色泽鲜绿的植株洗净后 , 取茎
先端 1 cm左右用于 DNA 的提取。称取洗净的茎尖 0 .05 g
置于 1 .5 ml 的离心管中加 600μl 裂解液 (Tris-HCl pH8.0)
0 .2 mol?L ; 尿素 7 mol?L ; 十二烷基肌氨酸钠 2% ; EDTA
0 .05 mol?L) 充分研磨 , 加 600μl 酚 - 氯仿 (1∶1) 剧烈振
荡 , 12 000 r?min离心 5 min, 取上清 , 用异丙醇和无水乙
醇分别沉淀 DNA 一次。DNA 沉淀经 70% 乙醇洗涤后溶
于 50μl TE 中 , - 20℃保存备用。
1 .3 .2 RAPD扩增 RAPD-PCR 反应使用 20μl 体系 , 其中
包括 : 1 . 5 U Taq 酶 , 0 .15 mmol?L dNTP , 3 mmol?L Mg2+ ,
0 .2μmol?L 引物 , 1×buffer (以上药品均购自上海生工生物
工程有限公司) , 加入 DNA 模板的量为 2～3 ng。
PCR 反应在 MJ Research Minicycle PCR 仪上进行 , 扩
增条件为 : 94℃ 预热 3 min; 94℃ 1 min, 33℃ 1 min,
72℃ 1 .5 min ( 45 个循环 ) ; 72℃延伸 7 min ( Williams,
1993)。每个反应重复两次以确定所得条带的可重复性。
扩增产物用 1 .5 %的琼脂糖凝胶电泳 , EB 染色 , 凝胶成
像系统记录结果。
1 .3 .3 数据的处理 RAPD 的条带根据有无用“1”、“0”
标记后形成原始数据矩阵 , 用 RAPDistance 1 .04 软件
(Armstrong等 , 1995) 进行分析得到各居群间的遗传距
离 , 用 NJ 法进行聚类分析。用 POPGENE32 软件 ( Yeh
等 , 1999 ) 计算 Nei 基因多样性指数 (H ) , Shannon多样
1756 期 刘 丽等 : 鼠尾藓不同居群间形态及 RAPD分析
性指数 (I ) 和遗传分化系数 (GST )。
2 结果与分析
2 .1 形态特征的比较
实验中测量了 4 个形态学特征 : 叶中部细胞
的长、宽、长宽比及叶尖的长短结果见表 2。对
居群内和居群间形态数据的差异程度进行单因素
方差分析 , 多重比较结果显示 : 居群内 7 个个体
的细胞宽及长宽比在绝大部分的居群内个体间都
无显著差异 , 细胞长和叶尖的长短仅在部分居群
内的个体中存在显著差异 ; 而 4 个形态性状在居
群间的差异较显著。
表 2 不同居群间鼠尾藓形态特征的比较 ( 数据表示为平均值±标准差 )
Table 2 The comparation of morphological characters of different Myuroclada maximowiczii populations ( data are showed as Mean±S . D .)
居群
Population
形态特征 Characters
叶中部细胞长 叶中部细胞宽 叶中部细胞长宽比 叶尖长
Median laminal cell length (μm) Median laminal cell width (μm) Median laminal cell length to width ratio Leaf tip (μm)
nmg 27 3. 88±3 ?. 43 7 K. 65±1 1. 12 3 .70±0 .65 28 .14±14 %. 28
hei 28 3. 20±3 ?. 45 7 K. 86±1 1. 07 3 .64±0 .54 48 .43±19 %. 54
lao 29 3. 29±3 ?. 67 7 K. 59±1 1. 11 3 .94±0 .68 30 .82±17 %. 97
tian 36 3. 53±5 ?. 11 8 K. 49±1 1. 21 4 .36±0 .69 23 ,. 78±8 .85
qa 30 3. 18±4 ?. 90 7 K. 35±1 1. 21 4 .19±0 .84 61 .11±18 %. 38
qb 28 3. 26±3 ?. 62 7 K. 96±1 1. 16 3 .61±0 .63 49 .42±17 %. 05
qc 30 3. 27±3 ?. 21 8 K. 28±1 1. 26 3 .71±0 .58 32 .97±12 %. 76
qd 37 3. 27±4 ?. 36 8 K. 57±1 1. 23 4 .41±0 .69 38 .38±19 %. 23
根据表 2 可以看出 , 来自不同居群的鼠尾藓在
细胞长、宽、长宽比及叶尖长短等特征上具有一定
的差异。其中秦岭 d的叶中部细胞最长、最宽 , 且
长宽比最大。从叶中部细胞的长度来看 , 秦岭 d和
天目山的居群间无差异 ( p= 1) , 与其他居群均具
有极显著差异 ( p< 0.01)。从叶中部细胞的宽度来
看 , 秦岭 b、c、d与天目山的居群无显著差异 ( p
> 0.05) , 而与其他居群差异较大。叶中部细胞的长
宽比一直被认为是比较稳定的性状 , 从 8 个居群的
分析结果来看 , 天目山和秦岭 a、d的值较大 , 且
三者间无显著差异 , 但是与其它各居群有显著差
异。叶尖的变化范围比较大 (23 .78～61 .11μm) ,
其中秦岭 a的叶尖最长 , 天目山的叶尖最短。
图 1 利用 JMP5.1 软件对 4 个形态数据分析所得的各居群的分支图
Fig . 1 The dendrogram of populations according to 4 morphological
data, using JMP5 .1 software
利用 JMP5 .1 软件 , 根据所研究的 4 个形态数
据对鼠尾藓的 8 个居群进行聚类分析 , 结果如图 1
所示 , 秦岭 d 居群和天目山的居群相似性很高 ,
聚到了一起 ; 内蒙古和黑龙江老黑山的居群聚成
一支 , 虽然秦岭的 4 个居群地理位置较近 , 但是
聚类分析显示这 4 个居群并没有很高的相似性。
2 .2 基于 RAPD 的遗传多样性
本实验对采自我国 4 个省份的 8 个居群的鼠
尾藓植物进行了 RAPD 分析 , 对 61 条随机引物进
行筛选 , 最后筛选出 13 条扩增条带较多 , 重复性
好的引物用于进一步扩增 , 总共得到 104 个条带 ,
图 2 利用 NJ 法得到的鼠尾藓 8 个居群的系统分支图
( 线上数字表示树长 )
Fig . 2 The dendrogram of 8 Myuroclada maximowiczii populations,
using NJ method (numbers on the lines are tree lengths)
275 云 南 植 物 研 究 28 卷
其中多态性条带 88 条 , 占总条带数的 84 .62%
(表 3 )。对所得的条带进行标记后用 RAPDis-
tance1 .04 软件进行分析得到各居群间的遗传距
离 ( 表 4 ) , 利用 NJ 法构建邻接树。本文利用 6
种不同的遗传距离计算方法 (Sokal and Sneath 2 ,
Ochiai , Rogers and Tanimoto, Dice, Yule and Ken-
dall , Jaccard法 ) 对不同居群间鼠尾藓的遗传距离
进行了计算 , 各种不同算法所得的遗传距离有一
定差异 , 但是 , 利用 NJ 法得到了分支完全一致的
拓朴结构 , 图 2 为用 Dice (Nei and Li ) 方法计算
遗传距离所得的邻接树 , PTP‘检验值为 6 .76 ,
说明该系统树的各分支具有较高的支持率。
由图 2 可以看出 , 鼠尾藓 8 个居群共形成 2 大
分支: 黑龙江五营和内蒙古的居群构成一个分支 ,
其他的 6 个居群聚成一支 , 其中秦岭的 4 个居群
表 3 实验所用随机引物的序列及产生条带的数目
Table 3 The sequences and the bands produced by the random primers
引物 引物 条带 多态性 多态性条带所
名称 序列 总数 条带数 占百分比 ( % )
Primer Primer Total Polymorp- Percent of poly-
sequence bands hyic bands morphyic bands
s5 ?TGCGCCCTTC 8 J8 100
s10 ?CTGCTGGGAC 10 ]10 100
s11 ?GTAGACCCGT 14 ]10 71 .4
s21 ?CAGGCCCTTC 7 J6 85 .7
s23 ?AGTCAGCCAC 7 J7 100
s65 ?GATGACCGCC 6 J4 66 .7
s478 ?GGCTTGGCCT 8 J7 87 .5
s253 ?GGCTGGTTCC 7 J6 85 .7
s293 ?GGGTCTCGGT 6 J5 83 .3
s277 ?GTCCTGGGTT 7 J5 71 .4
s1012 ?TCCAACGGCT 11 ]10 90 .9
s1016 ?CAAGGTGGGT 8 J7 87 .5
s1021 ?GGCATCGGCT 5 J3 60
Total 104 o88 ?84 .6
表 4 利用 Dice 法计算的不同居群间鼠尾藓的遗传距离
Table 4 Dice genetic distances among different Myuroclada maximowiczii populations
居群 Population qa qb tian hei nmg lao qc qd
qa 0 F. 0000
qb 0 F. 6159 0 2. 0000
tian 0 F. 5180 0 2. 5725 0 ?. 0000
hei 0 F. 6325 0 2. 5040 0 ?. 5920 0 .0000
nmg 0 F. 6062 0 2. 6049 0 ?. 5080 0 .5982 0 . 0000
lao 0 F. 6311 0 2. 5916 0 ?. 5378 0 .6433 0 . 6169 0 .0000
qc 0 F. 5821 0 2. 6159 0 ?. 5822 0 .6585 0 . 6055 0 .6017 0 .0000
qd 0 F. 3718 0 2. 5236 0 ?. 5774 0 .5878 0 . 6338 0 .5485 0 .4763 0 . 0000
构成一个次级分支 ; 浙江天目山和老黑山的居群
聚成另一个次级分支。
应用 POPGENE32 软件分析得到鼠尾藓 8 个居
群的 Nei 基因多样性指数 (H) 为 0.3326, 平均遗
传多样性指数 (HS ) 为 0.2228, Shannon 多样性指
数 (I ) 为 0.4877 , 遗传分化系数 (GST ) 为 0.3303。
3 讨论
本实验涉及的鼠尾藓 8 个居群分别采自中国
的 4 个省份 : 陕西 , 黑龙江 , 内蒙古 , 浙江 , 分
别分布于我国的中部 , 东北及东部 , 地理位置差
距很大 , 这样就避免了居群间由于杂交而引起的
遗传变异 , 秦岭的 4 个居群虽然分布较近 , 但是
分别位于不同的保护站或不同的山体 , 居群间杂
交的可能性较小。
从形态特征的结果来看 , 所研究的形态特征
在不同居群间均有不同程度的差异 , 叶尖的变异
最大 , 而一直被认为是较稳定的性状的叶中部细
胞的长宽比 , 在所研究的 8 个居群中也存在一定
差异。但是从观察结果来看 , 植物体及叶片的形
态在居群间是很稳定的 , 这也是代表这个种的最
重要的性状。
秦岭 a、b、c、d 4 个居群生活环境相似 ,
都是采集于陕西秦岭地区 , 根据 RAPD 分析 , 这
4 个居群聚到了一起 , 说明这 4 个居群在遗传上
比较相近。浙江天目山的居群 , 根据 RAPD 的分
析结果 , 和黑龙江老黑山的居群聚到了一起并与
秦岭的 4 个居群构成一个分支。黑龙江五营和内
蒙古的一个居群在地理位置上比较靠近 , 都位于
我国的东北地区 , 根据 RAPD 的结果二者聚到一
起。由此可见不同居群间的遗传距离和它们的空
间距离在一定范围内存在一定的相关性。天目山
和老黑山的空间位置相距较远 , 但是 RAPD 结果
显示二者聚成一支 , 究其原因可能是这两个居群
海拔都在 400 m左右 , 森林郁闭度较大 , 林下较
潮湿 , 鼠尾藓生存的小环境相似 , 所以在分子水
3756 期 刘 丽等 : 鼠尾藓不同居群间形态及 RAPD分析
平上两者表现出较高的相似性。
形态学数据和 RAPD 的结果构建的系统树结
构并不完全相同 , 存在一定的差异 , 例如 : 形态
学数据显示天目山和秦岭 d居群相似性较高 , 聚
到一起 (图 1) , 而 RAPD 的结果中二者相距较远
(图 2)。这表明形态学数据和分子数据并不是一
一对应的。由于表型 ( 形态 ) 和基因型 ( 分子 )
之间存在着基因表达、调控、个体发育等一系列
复杂的中间环节 , 二者很难达到完全一致。另
外 , 植物的表型是在以基因型为内因的基础上外
加环境因子作用的结果 , 因此 , 形态和分子之间
存在不一致性或者说不同步性也是可以理解的。
物种的遗传多样性可以体现在从形态到 DNA 的
各个不同水平上 , 故对其检测的方法可建立在不
同层次的研究上 , 只有结合多种检测方法才能全
面而正确的反映居群间的变异程度。
综上所述 , 鼠尾藓在所研究的 8 个居群间变
异程度较高 , 主要表现在鼠尾藓在各居群间具有较
高的 遗传 多样性 ( H = 0.3326, HS = 0.228, I =
0.4866)。有研究表明泥炭藓属植物 (HS = 0.122) 具
有和其他藓类植物相当的遗传多样性水平 (Things-
gaard, 2002) , 护蒴苔 Calypogeia fissa (H = 0.294) 的
遗传多样性水平较高 (Buczkowska, 2004) , 与之相
比鼠尾藓具有更高的遗传多样性水平。
各居群的鼠尾藓在叶细胞的大小及叶尖长短上
具有一定程度的变异 , 因此推测这些形态特征是与
环境相关的 , 代表了种下水平的差异; 而植物体及
叶片的形态在居群间变异较小 , 很好地代表了这个
种的特征。在今后的研究中可扩大居群的范围和所
统计性状的数量以得到更加可信的结论。根据
Stengien and Flatberg (2000) 的研究 , 如果居群内及
居群间的遗传变异小 , 说明其遗传多样性匮乏 , 该
植物则很可能会濒临灭绝。我国的鼠尾藓具有较
高的多样性是鼠尾藓适应不同环境生存的结果 ,
这也说明鼠尾藓具有较强的适应环境的能力。
致谢 华东师范大学生命科学学院孙越副教授对本实验
提出了宝贵意见 ; 李粉霞、翟德逞、詹琪芳同学为本实
验提供了部分标本 ; 李相尧同学在数据处理方面提供了
很多帮助。
〔参 考 文 献〕
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