全 文 ：生菜遗传转化体系的建立及转基因研究?
邓小莉1 , 周 岩2 , 常景玲2
( 1 平原大学应用生物系分子生物学实验室 , 河南 新乡 453003; 2 河南科技学院生物工程系
分子生物学重点实验室 , 河南 新乡 453003)
摘要 : 以散叶生菜大速生 ( Lactuca sativa var. capatata L .) 为试材 , 以 MS为基本培养基 , 采用不同激素配
比 , 确定生菜高效诱芽培养基为 MS+ 1 .5 mg?L 6 - BA + 0 .2 mg?L IAA ; 抗生素敏感性试验表明 , 筛选培养基
中适宜的潮霉素选择压为 20 mg?L , 抑菌剂羧苄青霉素的适宜质量浓度为 300 mg?L ; 通过根癌农杆菌介导的
叶盘法将携带 O 型和 A 型口蹄疫抗原决定簇融合基因 O21 - O14 - A21 - HBcAg转入大速生散叶生菜 , 对部分抗
性植株进行 PCR 和 PCR-Southern杂交检测 , 证实目的基因已经成功整合到生菜基因组中。RT-PCR 检测初
步表明 , O21 - O14 - A21 - HBcAg基因可以在生菜中正常转录表达。
关键词 : 口蹄疫抗原决定簇 ; 根癌农杆菌 ; 生菜 ; 遗传转化 ; 基因表达
中图分类号 : Q 943 文献标识码 : A 文章编号 : 0253 - 2700 (2007) 01 - 098 - 05
Establishment of Genetic Transformation System
and Transgenic Studies in Lettuce
( Lactuca sativa var . capatata)
DENG Xiao-Li
1
, ZHOU Yan
2
, CHANG Jing-Ling
2
( 1 Laboratory of the Mini for Biology, Pingyuan University, Xinxiang 453003 , China; 2 Department of Biology
Engineering, Henan Science- Technical College, Xinxiang 453003 , China)
Abstract: In this experiment, the effects of different hormone concentration on shoot regeneration fromcotyledon explants
are investigated . The results show that MS mediumsupplied with 1 .5 mg?L 6-BA and0 .2 mg?L IAA is the suitable shoot
regeneration . The experiment on sensitivityof cotyledon to hygromycin B andcarbenicillin shows that the suitablehygromy-
cinconcentration for selecting transgenic tissue is 20 mg?L and the carbenicillin concentration is 300 mg?L . Fused gene
O21 - O14 - A21 containing both type O and A FMDV is transferred into lettuce mediated by Ti plasmid of Agrobacteriumtu-
mafaciens . The results of PCR and PCR-Southern blotting indicated that the O21 - O14 - A21 genewere successfully integrated
into the genomes of some transformed lettuce plants . Expression of O21 - O14 - A21 gene in transformed lettuce plants was
proved by RT-PCR analyses .
Key words: FMD epitopes; Agrobacterium tumefaciens; Lactuta sativa; Genetic transformation; Gene expression
利用转基因植物生产基因工程疫苗是目前植
物基因工程研究中的一大热点。植物反应器与微
生物和动物反应器相比 , 最大的优点是可以大规
模、廉价、安全地生产动物蛋白或疫苗 ( Hiatt
等 , 1989; Mason等 , 1996) , 基因工程领域的研
究进展 , 使得植物体正在成为具有重要经济价值
云 南 植 物 研 究 2007 , 29 ( 1) : 98～102
Acta Botanica Yunnanica

? ?基金项目 : 福建省科技计划项目 ( J Y-03-B-30-20)
收稿日期 : 2006 - 03 - 14 , 2006 - 07 - 06 接受发表
作者简介 : 邓小莉 (1962 - ) 女 , 广东龙川人 , 硕士 , 副教授 , 从事植物基因工程方面研究。E-mail : xldeng207@126 . com
的异源蛋白 ( 包括药用蛋白 ) 的生产体系。据不
完全统计 , 现已有几十种药用蛋白质或多肽在植
物中得到成功表达 , 其中包括了人的细胞因子、
表皮生长因子、促红细胞生成素、干扰素、生长
激素、单克隆抗体和可作为疫苗用的抗原蛋白等
(Mason 等 , 1992; Higo 等 , 1993; Matsumoto 等 ,
1993; 张更林等 , 2003; 王冬梅等 , 2005 ) 。生
菜 ( Lactuca sativa var. capatata L .) 为菊科莴苣属
植物 , 是一种由国外引进的生食蔬菜 , 具有较高
的营养价值 , 生长周期短 , 整株可以生食 , 再生
和转化率较高 , 关于生菜的遗传转化已有成功的报
道 (Michelmore 等 , 1987; Curtis 等 , 1999; McCabe
等 , 1999; 左晓峰等 , 2001; 刘敬梅等 , 2001)。
口蹄疫 (Foot-and-mouth disease, FMD) 是一
种由口蹄疫病毒 ( FMDV ) 引起的主要感染偶蹄
目动物的急性传染性极强的人畜共患的家畜传染
病。被 国际 兽疫 局 ( OIE ) 列 为 A 类传 染 病
(Domingo 等 , 1992 )。其特点是传播途径广 , 感
染率和死亡率高 , 在我国的周边地区和国内的一
些地区口蹄疫疫情时有发生。因此探讨用植物基
因工程手段将口蹄疫抗原决定簇融合基因导入植
物从而以植物作为生物反应器来大规模生产疫苗
具有重要的理论和实践意义。
1 材料与方法
1 .1 材料
供试材料生菜 : 美国大速生菜品种 , 新乡市科达种
子公司生产 , 新文牌种子 ; 口蹄疫抗原决定簇融合基因
植物表达载体由厦门大学生命科学学院陈亮馈赠。
1 .2 方法
1 .2 .1 无菌实生苗的培养 将生菜种子用 75%的酒精表
面消毒 30 s, 无菌水冲洗 1 次 ; 再用 15%的次氯酸钠消
毒 15 min; 无菌水冲洗 4～6 次 , 每次 1～2 min; 将消毒
过的种子摆放在铺有 2～3 层滤纸的灭菌培养瓶中 , 25～
28℃ , 2 000 lx, 10 h?d光照条件培养。1～ 2 d 后种子萌
发 , 取 3～5 d龄的两片子叶作为实验材料。
1 .2 .2 生菜高效诱芽培养基的确定 以 MS 培养基为基
本培养基 , 附加 30 %的蔗糖 , 1 %的琼脂粉 , 6 - BA (质
量浓度为 0 .5 , 1 .0 , 1 .5 , 2 .0 mg?L ) ; 和 IAA (质量浓度
为 0 .1 , 0.2 , 0 .3 , 0 .4 mg?L) 共 16 个处理组合 ; 每个处
理设 3 次重复 , 每处理接种 60 块子叶外植体 , 25℃ , 光
照强度 2 000 lx, 光照长度 14 h?d培养 , 3 周后 , 统计不
同处理愈伤组织的再生率及芽的质量 (表 1)。
1 .2 .3 潮霉素 (Hyg) 选择压的确定 在确定了适宜的
激素浓度和配比以后 , 再以该最佳诱芽培养基附加 Hyg,
Hyg质量浓度设 0 , 5 , 10 , 15 , 20 , 30 , 40 mg?L 共 7 个
处理 , 每处理设 3 次重复 , 每处理接种外植体 60 个 , 培
养条件同上 , 观察其生长状况 40 d, 进而确定最佳潮霉
素抗性筛选浓度。
1 .2 .4 根癌农杆菌介导的叶盘法转化生菜 将 - 20℃冻
存的含有重组质粒 pCAMBIA1301- O21 - O14 - A21 的农杆菌
EHA105 在 LB?Km的平板上划线 , 28℃过夜培养 , 挑取
单菌落 , 在 LB液体培养基 , 28℃ , 220 r?min振荡培养至
菌液浓度为 OD600 约 1 .0 ; 4 000 r?m离心 5 min收集菌体 ,
用 1?2MS液体培养基洗涤两次 , 重悬于 1?2MS 液体培养
基使该菌体稀释至 OD600 0 .5～0 .8 , 即为浸染液。将生菜
无菌苗子叶切去边缘 , 然后切成 3～6 mm2 的叶圆片 , 菌
液中浸染 20 min; 灭菌滤纸吸干菌液 , 接种于共培养培
养基中 , 28℃ , 培养 3 d 后 , 接种至诱芽筛选培养基 ,
25℃ , 光照强度 2 000 lx, 光照长度 14 h?d进行诱芽培养。
1 .2 .5 转基因植株的生根培养 把分化出的芽切下 , 插
入 1?2MS附加蔗糖 30 mg?L 的培养基中 , 诱导生根 ; 培养
基中附加 20 mg?L Hyg和 300 mg?L Carb; 培养条件同 1 .2 .4。
1 .2 .6 PCR 法检测转基因生菜 根据融合基因内部序列
设计引物 , 以生菜总 DNA 为模板 , 加入 10× PCR 缓冲
液 2.5μL , 10× dNTPs 2.5μL , 上游和下游引物各 20～50
pmol, TaqDNA 聚合酶 2unit, 加 ddH2O 至总体积 25 μL。
扩增长度约 800 bp的目的片段。
P1 (5′端引物 ) : 5′-GGCGATTTGCAGGTGTTGGC-3′;
P2 (3′端引物) : 5′-CGGGAATCTCAATGTTAGAAGC -3′。
PCR 反应程序为 : 94℃变性 5 min; 94℃ 45 s; 52℃
45 s; 72℃ 1 min; 35 个循环 ; 72℃ 5 min。
1 .2 .7 PCR 产物的 Southern杂交 将 PCR 产物进行转膜
(王关林和方宏筠 , 2002)。杂交方法依照 Bio-Rad公司的
Dig High Prime DNA Labeling and Dection Starter Kit1 试剂盒
操作。
1 .2 .8 转化生菜总 RNA 的提取和 RT-PCR 检测 转化生
菜植株总 RNA 的提取参照 TaKaRa公司试剂盒进行。用
Dnase I 处理获得的 RNA 样品 , 进行逆转录合成 cDNA 并
进行 PCR 扩增。逆转录合成 cDNA 样品的扩增引物、反
应体系、反应条件与 1.2 .6 中的 PCR 扩增检测相同。
2 结果与讨论
2 .1 结果
2.1.1 不同激素浓度对大速生散叶生菜子叶再生
率的影响 以 MS 培养基为基本培养基 , 附加不
同浓度的 6 - BA (质量浓度为 0 .5 , 1.0 , 1.5, 2 .0
mg?L ) 和 IAA (质量浓度为 0 .1 , 0.2, 0.3, 0 .4
511 期 邓小莉等 : 生菜遗传转化体系的建立及转基因研究
mg?L) 共 16 个处理组合 , 每处理每瓶接种子叶外
植体 20 片 ( 设 3 次重复 , 共 3 瓶 60 块子叶外植
体 ) , 培养 3 周后统计芽的再生情况 (表 1)。
表 1 不同激素浓度对子叶再生率的影响
Table 1 Effects of different hormone concentration on
regeneration rate of cotyledon
ρ6 (- BA ρNAA 愈伤组 出愈率 出芽 出芽率
( mg?L) ( mg?L) 织块数 ( % ) 块数 ( % )
0 =. 5 0 ?. 1 45 k75 0 ;0
0 =. 5 0 ?. 2 40 k67 1 ;1 t. 67
0 =. 5 0 ?. 3 36 k60 8 ;13 .3
0 =. 5 0 ?. 4 44 k73 1 ;1 t. 67
1 =. 0 0 ?. 1 48 k80 30 M50 .0
1 =. 0 0 ?. 2 44 k73 23 M38 .3
1 =. 0 0 ?. 3 41 k68 16 M26 .7
1 =. 0 0 ?. 4 44 k73 8 ;13 .3
1 =. 5 0 ?. 1 60 k100 36 M60 .0
1 =. 5 0 ?. 2 60 k100 39 M65 .0
1 =. 5 0 ?. 3 52 k86 29 M48 .3
1 =. 5 0 ?. 4 41 k68 20 M33 .3
2 =. 0 0 ?. 1 56 k93 23 M38 .3
2 =. 0 0 ?. 2 54 k90 28 M46 .7
2 =. 0 0 ?. 3 36 k60 11 M18 .3
2 =. 0 0 ?. 4 44 k73 2 ;3 . 3
注 : 每处理每瓶接种外植体 20 块 , 共 60 块
由表 1 可知 , 不同的激素浓度配比对子叶的
再生率影响不同 , 以 MS + 1 .5 mg?L 6 - BA + 0 .2
mg?L IAA 出芽率最高 , 为 65% ; MS + 1 .5 mg?L 6
- BA + 0 .1 mg?L IAA 的出芽率次之 , 为 60% ; 二
者的诱芽率并无显著差别 , 但相比较而言 , 在
MS+ 1 .5 mg?L 6 - BA + 0 .2 mg?L IAA 的培养基上
生长的芽较健壮 , 芽的质量明显优于 MS + 1 .5
mg?L 6 - BA + 0 .1 mg?L IAA 的培养基上生长的芽
的质量。从表 1 还可以看出 , ρ6 - BA?ρIAA 的比
例对愈伤组织和芽的诱导影响较大 , ρ6 - BA?
ρIAA 的比例高时 , 更有利于芽的诱导 , 比例低
时则更有利于愈伤组织的诱导 , 但当 6 - BA 的质
量浓度高于 1 .5 mg?L 时 , 芽的诱导则受到抑制 ,
愈伤组织生长较好 , 芽的发生率低。
2 .1 .2 转基因生菜 Hyg选择压的确定 Hyg 是
作为基因转化的选择压力添加在筛选培养基中
的 , 适宜的抗生素浓度要求既能有效的抑制非
转化细胞生长 , 又要求不影响转化细胞的正常生
长。因此 , 在建立基因转化受体系统时测定植物
材料对抗生素的敏感性很有必要。不同质量浓度
的 Hyg对生菜子叶 (愈伤 ) 再生的影响见表 2。
由表 2 可以看出 , 潮霉素浓度 5～10 mg?L 对其生
长有比较明显的抑制作用。在 潮 霉 素 浓 度 20
mg?L 的培养基中培养 25 d时 , 愈伤组织深褐色 ,
停止生长 ; 培养 40 d 时 , 愈伤组织深褐色 , 基
本死亡。因此 , 20 mg?L 的潮霉素浓度是筛选培
养中生菜愈伤组织的最小抑制浓度 , 也是其基础
抗性浓度 , 可以作为生菜遗传转化中转化细胞和
非转化细胞的筛选浓度。
表 2 生菜愈伤组织对潮霉素的基础抗性测定
Table 2 Basic resistanceof lettuce callus to hygromycin
潮霉素浓度
( mg?L )
培养 25 (d 培养 40 d
0 T浅黄色 , 生长旺盛 浅黄色 , 生长旺盛
5 T浅黄色 , 生长稍缓 深黄色 , 生长较慢
10 f深黄色 , 生长缓慢 浅褐色 , 生长极缓
15 f浅褐色 , 停止生长 深褐色 , 停止生长
20 f深褐色 , 停止生长 深褐色 , 基本死亡
30 f深褐色 , 基本死亡 黑色 , 死亡
40 f黑色 , 死亡 黑色 , 死亡
2.1.3 转基因生菜抗性植株的获得 通过农杆菌
介导的叶盘法将 O21 - O14 - A21 - HBcAg基因转化至生
菜。侵染的生菜子叶叶盘在诱芽筛选培养基 : MS
+ 1 .5 mg?L 6 - BA + 0 .2 mg?L IAA + 20 mg?L Hyg+
300 mg?L Carb上培养 , 3 周左右即可诱导出芽 , 将
长至 1～1.5 cm的芽切下 , 插入 1?2MS + 20 mg?L
Hyg的生根培养基中诱导生根 , 生根者为 Hyg抗
性植株。本实验共得到生菜抗性植株 66 株。
2 .1 .4 转基因生菜植株的分子检测 用 CTAB
少量提取法提取生菜 Hyg抗性株的 DNA , 并以之
为模板 , 以设计的特异引物 P1、P2 , 按前述的
PCR 程序 , 对 Hyg抗性植株的 DNA 进行 PCR 扩
增 , 抗性植株扩增出长度约为 540 bp清晰的预期
条带 (图 1 )。本实验共检测到转基因阳性植株
29 株 , 转化率为 43 .94%。
图 1 转基因生菜 PCR 分析
1～8: 转化植株 ; 9 : 未转化植株 ; 10 质粒 : pCAMBIA1301-
O21 - O14 - A21 - HBcAg; M: Marker
Fig . 1 PCR analysis of transgenic lettuce plants
1 - 8 : Transgenic plants; 9 : Non-transgenic plants; 10 Plasmid:
pCAMBIA1301- O21 - O14 - A21 - HBcAg; M: Marker
61 云 南 植 物 研 究 29 卷
2 .1 .5 目的基因在生菜基因组中的整合 将 PCR
产物转膜 , 进行 Southern 杂交 , 转化植株与质粒
为模板的 PCR 产物与探针特异性结合 , 显示一致
的条带 , 说明目的基因已整合到转化植株的基因
组中 , 同时也证实了 PCR 检测阳性结果的正确
性。图 2 为 PCR 产物的 southern杂交结果。
图 2 PCR 产物的 Southern 杂交
1～8: 转化植株叶片的 PCR 产物 ; 9 : 阴性对照 ;
10 : 质粒 pCAMBIA1301- O21 - O14 - A21 ;
Fig . 2 Result of PCR-Southern blotting
1 - 8 : transgenic lettuce; 9 : Negative control 10: Plasmid
pCAMBIA1301- O21 - O14 - A21
2.1.6 RT-PCR 检测 为了进一步证明 O21 - O14 -
A21 - HBcAg基因在转基因植株中的转录表达情况 ,
取 3 株阳性植株提取基因组总 RNA , 用 Dnase I 消
化 DNA , 再通过逆转录反应合成 cDNA , 做 RT-
PCR 检测 (图 3)。结果 3 株都能够扩增出 540 bp
左右的条带 , 与 Southern杂交结果一致 , 初步表
明目的基因在转录水平上进行了表达。
图 3 转基因生菜的 RT- PCR 检测
1 . 未转化植株 ; 2～4 . 转化植株 ; M . PCR Marker
Fig . 3 RT-PCR analysis of transgenic lettuce plants
1 . Non-transgenic lettuce; 2 - 4 . transgenic lettuce; M . PCR Marker
2 .2 讨论
稳定的植物组织和细胞培养再生系统是利用
农杆菌介导转化法进行植物转基因研究的重要前
提。Xinrun and Conner (1992) 研究表明 , 生菜的
基因型对其再生率的影响较大 , 不同基因型的生
菜芽的再生所需激素种类和浓度不同。刘凡等
(1996) 研究表明 , 生菜大湖 366 以采用MS + 0 .5
mg?L 6 - BA + 0 .1 mg?L NAA 的诱芽培养基为宜 ;
那杰等 ( 1995 ) 对生菜马莱克的研究认为 , MS
+ 0 .1 mg?L 6 - BA + 0 .1 mg?L NAA 的诱芽培养基
对芽的诱导率最高。本实验对美国大速生菜以不
同激素浓度的配比进行实验 , 结果表明 , 大速生
散叶生菜的诱芽培养基以 MS+ 1 .5 mg?L 6 - BA +
0 .2 mg?L IAA 为宜。对抗生素的敏感性实验表
明 , 20 mg?L 的 Hyg即可完全抑制生菜大速生芽
的再生 , 本实验采用 20 mg?L 的 Hyg已是较严格
的筛选浓度。
转化时用的浸染液浓度过高 (OD600 大于 1 ) ,
在后期筛选抑菌比较困难 , 这可能为农杆菌提供
更多的附着浸染的机会。就后期筛选及抗性芽分
化来看 , 为了有效抑制农杆菌生长 , 转化时菌液
浓度以 OD 0 .5 , 浸染时间 20 min为宜。共培养
时 , 在共培养基上铺上一层无菌滤纸 , 将材料放
在上面共培养 , 与不用滤纸相比 , 筛选中农杆菌
不易长出 , 材料抑菌容易的多。
成功转化的关键是将外源基因导入那些再生
能力强的细胞 , 王关林和方宏筠 ( 1998) 指出生
菜的遗传转化率以 2 .5～3 d苗龄的子叶外植体转
化率最高 , 考虑到不同生菜品种苗龄对转化率的
影响不大 , 本研究采用 3～5 d 苗龄的生菜子叶
为转化外植体 , 没有做不同苗龄对转化率的影响
实验。农杆菌介导的转化方法主要作用于外植体
表层细胞 , 如果再生植株细胞起源于深层细胞 ,
则很难得到转化体 , 即使得到转化体 , 其转化频
率也很低 , 且转化株表现为嵌合体。
在本实验过程中观察到 , 有相当部分的芽在
1?2MS + 20 mg?L Hyg的培养基上诱导生根时 , 其
生长点死亡 , 可能是由于这部分转化植株为嵌合
体而致 ; 另外一种可能是 , 以子叶为外植体 , 在
诱芽初期 , 芽生长所需的营养可能大多来自外植
体本身 , 所以培养基中的 Hyg对初期芽的生长影
响不足以使非转化芽致死 , 从而造成一定的假阳
性 , 当这些芽在附加 Hyg的培养基诱导生根时 ,
其生长所需营养来自于培养基 , 由于不含有 Hyg
抗性基因 HPT, 故生长受到强烈抑制而死亡。
生菜可以生食 , 为廉价生产可食疫苗提供了
一条新途径。通过将口蹄疫抗原决定簇融合基因
转化生菜 , 经 PCR 检测、Southern 杂交和 RT-
711 期 邓小莉等 : 生菜遗传转化体系的建立及转基因研究
PCR 检测可知 , 口蹄疫抗原决定簇融合基因已经
在生菜基因组中得到整合并初步验证在转录水平
上得以表达。
〔参 考 文 献〕
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