全 文 ：四个 DNA片段在山茶属分子系统学研究中的应用*
杨俊波1, 2 , 李洪涛1 , 杨世雄1 , 李德铢1** , 杨莹燕1
(1 中国科学院昆明植物研究所生物多样性与生物地理学重点实验室, 云南 昆明 650204;
2 中国科学院研究生院, 北京 100039)
摘要: 选取山茶属 14个组中的 10 组 21 种植物对目前常用于属内种间的 4个 DNA 片段 ( ITS、waxy、 trnL-
F、rpL16) 进行序列测定。结果表明: ( 1) 来自叶绿体基因组的 2 个片段 ( trnL-F、rpL 16) 其 PCR扩增和
测序都很容易, 但两者的进化速率都非常慢, 序列矩阵只有很少信息位点 ( trnL-F 含 9 个, rpL16 为 20
个) , 不能提供必要的系统发育信息。( 2) 来自核基因组的 ITS 片段其 PCR产物比较容易获得, 但其序列
的测定存在较多问题。( 3) waxy 是来自核基因组的另一个片段, 其 PCR扩增因受模板 DNA 的数量和质量
的影响很大而有一定难度, 但其进化速率较快, 序列矩阵具有较多信息位点 ( 92 个) , 并且在山茶属是单
拷贝, 这对于解决山茶属这类具有许多近缘物种的类群的系统关系有重要价值。基于 tsnL-F、 rpL16 和
waxy 三组数据所建分子系统树支持山茶属为一单系, 但属下系统由于取样等原因有待进一步研究。
关键词: 山茶属; DNA序列; 进化速率; 分子系统学
中图分类号: Q 946, Q 949 文献标识码: A 文章编号: 0253- 2700( 2006) 02- 108- 07
The Application of Four DNA Sequences to Studying Molecular
Phylogeny of Camellia ( Theaceae)
*
YANG Jun-Bo
1, 2
, LI Hong-Tao
1
, YANG Sh-i Xiong
1
, LI De-Zhu
1**
, YANG Yun-Yan
1
(1Laboratory of Biodiversity and Biogeography, Kunming Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Kunming 650204, China;
2 Graduate School of the Chinese Academy of Sciences , Beijing 100039, China)
Abstract: Four DNA sequences) ITS, waxy , trnL-F, and rpL 16 have been used to resolve the inter- species relation-
ships of twenty- one species representing 10 out of the 14 sections in Camellia. The results indicated that: ( 1) PCR am-
plification and sequencing were easy for trnL-F and rpL16 sequences, however, the divergence rates of the two chloro-
plast sequences are too slow with few phylogenetically informative sites in data matrix es ( 9 sites in trnL-F and 20 sites in
rpL 16) , so they could not provide enough phylogenetic information; ( 2) The PCR products of ITS were easily obtained,
but there were still many problems in sequencing; ( 3) The waxy gene, another sequence from the nuclear genome, has
significant values in resolving the infrageneric relationships in Camellia. The divergence rate is faster than aforementioned
sequences. There were more informative sites ( 92) in data matrix though PCR amplification was difficult because it is af-
fected by quantity and quality of template DNA and it is a single copy gene in Camellia. The present study indicated that
the waxy gene had great potential values in the systematic study of Camellia while other three sequences are unfitted to re-
solve the problem. The results of our DNA analysis of three segments support that the genus Camellia is a monophyletic
group, but the inter- species relationships is still needed more study.
Key words: Camellia; DNA sequences; Divergence rate; Molecular phylogeny
云 南 植 物 研 究 2006, 28 ( 2) : 108~ 114
Acta Botanica Yunnanica

*
** 通信作者: Author for correspondence. E- mail addresses: dzl@mail1kib1 ac1 cn
收稿日期: 2005- 08- 09, 2005- 10- 17接受发表
作者简介: 杨俊波 ( 1970- ) 男, 高级工程师, 主要从事植物分子系统发育与分子进化研究。
基金项目: 科技部国家科技基础条件平台工作项目 ( 2004DKA30430) , 云南省科学技术突出贡献奖资助项目 ( KIB-WU-2001-3)
山茶属 ( Camellia) 是山茶科 (Theaceae) 中
种类较多、系统上较为原始的一个属, 全产亚
洲, 我国是该属植物的分布中心, 拥有绝大多数
的种类, 依据不同的分类标准做出的统计结果显
示, 我国拥有该属的 80% ~ 95%的种类 (闵天
禄, 2000)。山茶属包括了举世闻名的观赏花卉
(如茶花 C1japonica, 滇山茶 C1reticulata, 金花
茶 C1petelotii或 C1 nitidissima)、世界三大饮料之
一的茶叶 (茶 C1sinensis, 普洱茶 C1sinensis var1as-
samica) 和我国南方重要的木本油料植物 (油茶
C1oleif era) 等重要的经济植物, 一直为农学、
园艺学、分类学家所关注。1958年 Sealy 提出了
第一个完整的山茶属系统, 张宏达 ( 1981,
1996) 和闵天禄 ( 1996, 1999) 先后提出了另外
两个分类系统。三者对该属的种类、系统演化、
起源及扩散存在不同的、甚至是相反的观点。这
些观点主要是依据分类学、细胞学、孢粉学、植
物地理学等方面的资料, 虽然在一定程度上澄
清、解决了一些系统学上的问题, 但更多的只是
揭示和提出了不少系统学上的问题, 没有解决
的、遗留的问题仍然相当突出。现有的研究结果
显示, 在山茶属的分类系统和物种的甄别上, 目
前所采用的各种研究方法和手段都有一定的局限
性, 而研究材料特别是实验材料的代表性也有值
得改进之处, 很有必要引入新的研究手段, 加大
研究的取样, 开展更大范围、更加深入的多学科
的综合研究。上世纪 90年代, 随着分子系统学
的兴起和发展, 分子生物学的研究手段开始被引
入山茶属的系统学研究, Wachira 等 ( 1995) 关
于茶叶的遗传多样性研究 ( RAPD标记) 和施苏
华等 ( 1998) 关于金花茶组的 RAPD分析的研究
结果已相继发表, 唐绍清等 ( 2004) 通过 ITS序
列分析探讨了金花茶组的系统学问题, 为山茶属
的分子系统学的研究开了一个头。本研究选取山
茶属 14个组中的 10组 21种植物作为该属代表,
对目前常用于属内种间的 4 个 DNA 片段 ( ITS、
waxy、trnL-F、 rpL16) 进行 PCR 扩增后直接测
序, 以大体了解这 4 个 DNA 片段在该属分子系
统学研究中的应用可行性, 确定适合于该属分子
系统学研究的 DNA片段。
1 材料与方法
111 实验材料
本研究按闵天禄的 14组系统, 选取其中 10组 21 种
表 1 实验材料和凭证标本
Table 1 Material and Voucher specimen
Sect. Species Voucher Origin
Sect . 11Piquetia ) ) )
Sect . 21Archecamellia Camellia indochinensis S1X. Yang 1114 广西南宁
C1 longzhouensis S1X. Yang 1112 广西龙州
C1amplexicaulis S1X. Yang 1118 越南谅山
C1f lava 龚洵 s1n1 ( 1) 越南老街
Sect . 31Cylindrica ) ) )
Sect . 41Thea C1 sinensis S1X. Yang 1087 昆明植物园栽培
C1 sinensis var1assamica S1X. Yang 1013 云南瑞丽
C1grandibracteata S1X. Yang 1068 云南云县
C1membranisepala S1X. Yang 1093 昆明植物园栽培
Sect . 51Longipedicellata C1hekoensis S1X. Yang 1167 云南河口
Sect . 61Corallina ) ) )
Sect . 71Theopsis ) ) )
Sect . 81Eriandria C1 caudata S1X. Yang 1344 云南金平
Sect . 91Heterogenea C1 yunnanensis var1 came S1X. Yang 1091 昆明植物园栽培
C1wardii var1muricatula S1X. Yang 1046 云南盈江
Sect . 101Stereocarpus Camellia pubipetala S1X. Yang 1119 广西凭详
Sect . 111Tuberculata C1 ilicif olia S1X. Yang 1096 昆明植物园栽培
C1pyxidiacea S1X. Yang 1072 昆明植物园栽培
Sect . 121Camell ia C1 edithae S1X. Yang 1081 昆明植物园栽培
C1pitardii S1X. Yang 1089 昆明植物园栽培
C1mairei var1 lapidea S1X. Yang 98994 贵州赤水
Sect . 131Paracamellia C1 oleif era S1X. Yang 1017 云南陇川
C1 sasanqua S1X. Yang 1082 昆明植物园栽培
Sect . 141Calpandria C1 connata JBYang 200507 泰国清迈
outgroup Apterosperma oblate S1X. Yang 1106 广东阳春
Schima kwangtungensis S1X. Yang 1104 广东阳春
1092 期 杨俊波等: 四个 DNA片段在山茶属分子系统学研究中的应用
植物作为该属代表, 同族另外两属的 2 种作为外类群
(表 1)。用于实验的植物材料均是新鲜或经硅胶快速干
燥的叶片。所有凭证标本均存于中国科学院昆明植物研
究所标本馆 ( KUN)。
112 实验方法
采用改良的 CTAB 法 ( Doyle and Doyle, 1987) 提取
植物总 DNA, 部分总 DNA经华舜纯化柱纯化。聚合酶链
式反应 ( PCR) 在 PERKIN ELMER 9600型 PCR仪上进行,
各片段扩增的引物同时用作测序引物见表 2。PCR 反应
体系和 PCR 热循环反应根据不同片段进行适当调整。
PCR扩增产物经华舜纯化柱纯化后直接用于测序。
用 DNA Star软件进行序列校对和排序。用 PAUP410b8
( Swofford. 1999) 软件进行系统发育分析。采用最大简约
法获得最大简约树。
表 2 本文所选用的 PCR扩增引物
Table 2 Primers for PCR amplificat ion and sequencing
序列名称 序列 来源
ITS ITS4: 5. TCCTCCGCTTATTGATATGC 3. White et al . , 1990
ITS5: 5. GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 3.
trnL-F trnL: 5. CGAAATCGGTAGACGCTACG 3. Taberlet et al . , 1991
trnF: 5. ATTTGAACTGGTGACACGAG 3.
rpL16 F435: 5. CTCAAAAAGGTAAAGAGCCCTGAGT 3. Jorden et al . , 1996
R1516: 5. CCCTTCATTCTTCCTCTATGTTG 3.
waxy GBSS1F1: 5. TGCCACCACTGTAAGATTC 3. 本实验室设计
GBSS1R2: 5. CCTTCTTTCACAGTGTCAAC 3.
图 1 基于 2棵最简约树的 rpL16严格一致树
Fig. 1 The strict consensus of two most parsimonious trees based on rpL16 sequences
110 云 南 植 物 研 究 28卷
2 结果
211 PCR扩增结果
用文献报道的一般 PCR 方法能比较容易地
扩增到山茶属的 ITS、trnL-F 和 rpL16 3个 DNA片
段, 但 waxy 基因的扩增比较困难, 经过调整 PCR
反应体系 (主要是模板DNA的含量) , 增加反应循
环数大多数物种能得到用于直接测序的PCR产物。
212 序列测定
在4个用PCR产物直接测序的 DNA片段中,
除了 ITS序列外, 其余 3个片段都得到了所需序
列。经过多次的测序表明, 用 PCR产物直接测
序在山茶属内有很大困难, 原因见讨论。
213 核苷酸序列的排序和系统树的构建
表 3给出了 trnL-F、 rpL16和 waxy 3个基因
片段的信息参数。 trnL-F 序列长度为 881~ 895
bp, 排序后长 913 bp, 其中变异位点有 39 个,
但只有 9 个信息位点; rpL16 序列长度为 907~
940 bp排序后长 951 bp, 其中变异位点有 77个,
表 3 trnL- F、 rpL16和 waxy 基因片段的信息参数
Table 3 Informative parameters for trnL-F, rpL16 and waxy
数据 排列长度 变异位点 信息位点 信息位点 ( % ) 树长 CI RI
Data Aligned length Variable site Informat ive site Informat ive site ( % ) Tree length
trnL-F 913 39 9 1 41 019756 01244
rpL16 951 77 20 2 111 019009 01491
waxy 780 111 92 12 312 017821 01645
图 2 基于 2棵最简约树的 trnL-F 严格一致树
Fig. 2 The strict consensus of two most parsimonious trees based on trnL-F sequences
1112 期 杨俊波等: 四个 DNA片段在山茶属分子系统学研究中的应用
有20个信息位点; waxy 序列长度为 689~ 706 bp
排序后长 780 bp, 其中变异位点有 111个, 有 92
个信息位点。3个基因片段的最简约树 ( MP) 的
数目分别是, trnL-F 序列 ( 2) , rpL 16序列 ( 2) ,
waxy 序列 ( 3) , 相应的一致树的树长, 一致性
指数 ( CI) 和保持性指数 ( RI) 见表 3。各基因
片段的最简约树的拓扑结构相差很大, trnL-F 和
rpL16序列的分支形成多歧平行结构 ( Polytomy)
(图 1, 图 2)。waxy 序列提供了分辨率较高的
MP 树, 绝大多数序列都形成二歧分支 (图3)。
图 3 基于 3棵最简约树的 waxy 严格一致树
Fig. 3 The strict consensus of three most parsimonious trees based on waxy sequences
3 讨论
分子系统学经过近年的快速发展, 许多
DNA片段已被应用于各分类阶元的系统学研究
(Tian and Li, 2002) , 虽然不同的 DNA片段本身
在植物系统学的研究中常有一相对稳定的适用范
围, 如: rbcL、18SrDNA一般适用于较高分类阶
元, 甚至整个种子植物谱系间的系统发育探讨;
trnL-F、rpL 16、ITS 等则被广泛应用于较低分类
阶元的系统发育研究, 但同一 DNA序列在不同
分类群间的进化速率往往有所差异 (有时甚至相
差很大) , 因此, 选取适合于特定类群的特定
DNA片段无疑是分子系统学研究成败的关键。
从目前的研究情况来看, 能在属内种间广泛
应用的 DNA 片段还十分有限, 大多数有很强的
类群差异性。在植物叶绿体基因组 ( cpDNA) 中
trnL-F、matK、 rpL 16 等属于进化较快的序列,
在科内属间有很高的应用价值 ( Bayer 等, 2000;
Mes 等, 1997; Plunkett 等, 1997; Kron 等,
112 云 南 植 物 研 究 28卷
1997) , 在某些特定类群中这些片段也为种间甚
至种下的系统学研究提供了一定价值 ( Jordan
等, 1996; Baum, 1998; Xiang 等, 1998; Stan-
ford等, 2000)。但本研究表明: 来自叶绿体基因
组的 2个 DNA 片段 ( trnL-F、rpL 16) 由于进化
速率太慢 (不同物种间的变异小于 1%) , 不能
提供必要的系统发育信息, 都不适合山茶属分子
系统学的研究。由于 rpL 16在 cpDNA中被认为是
进化最快的 DNA 片段之一 ( Small 等, 1998;
Downie等, 2000) , 因此, 在山茶属分子系统学
的研究中来自叶绿体基因组的序列应用价值可能
相对较小。被广泛应用于较低分类阶元系统发育
研究的核基因组 ITS序列, 在山茶属内通过 PCR
产物直接测序未能成功。可能主要有以下原因:
( 1) 相对较高的 GC含量引起测序的困难, 从已
有的对金花茶组的研究表明, 该属 ITS序列可能
均具有较高的 GC含量 (唐绍清等, 2004) ; ( 2)
近来许多研究表明在许多类群中 ITS 序列由于一
致性进化 ( concerted evolution) 不完全, 存在多个
不同拷贝 ( Baldwin等, 1995; Koch等, 2003) , 这
个原因可直接导致 PCR产物直接测序失败。山
茶属 ITS序列的一致性进化是否完全, 是否存在
多个不同拷贝以至 ITS序列本身在该属的进化机
制都有待进一步研究。( 3) 属内广泛存在的多倍
化和杂交现象 ( Parks, 1990; Kondo, 1977 a, b ,
1978) , 构成了测序困难的另一个原因。由于这
些问题的存在 ITS序列在山茶属内的应用存在很
大的局限。
鉴于上述原因, 一些核基因组内进化快的单
拷贝或低拷贝基因, 开始被应用于较低分类阶元
系统发育研究 ( Peralta 等, 1997; Xiao and Clif-
ford, 2002; Denton等, 1998)。由于这类基因是
单拷贝, 避免了多拷贝基因如 ITS 片段存在的直
系同源 ( Orthology) 和并系同源 ( Paralogy) 的问
题, 同时单拷贝基因由于积累和固定遗传变异较
多拷贝基因相对容易一些, 从而能提高变异水平
上的分子进化速率, 有利于解决近缘物种的系统
关系 (MÊ ller 等, 1999)。waxy 基因编码一种淀
粉合成酶, 全长 3 kb, 包括 13个外显子和 13个
内含子, 在大部分植物科内, waxy 基因是单拷
贝 ( Mason-Gamer等, 1998) , 如禾本科 ( Guo and
Li, 2004)、茄科、杜鹃花科, 仅少数科为多拷
贝, 如在蔷薇科中, 该基因有 2 ~ 3 个拷贝
( Evans等, 2000)。我们的研究表明在山茶属内
waxy 基因是单拷贝的, 并且具有较高的序列变异
率 (不同物种间的变异在 5%左右) , 这对于解
决山茶属这类具有许多近缘物种的类群的系统关
系有重要价值。
山茶属种类较多, 形态变异较大, 它是不是
一个单系类群是该属研究首先要回答的一个问
题。早期的研究, 山茶属曾被分为 9 个小属,
Sealy ( 1958) 的研究认为该类群的种子无翅, 胎
座斜生与山茶科其它种类明显分开, 并据此认为
该属为一不可分割的整体, 后来两个对该属有较
大影响的系统 (张宏达, 1981; 闵天禄, 2000)
同意 Sealy 的单系概念。我们分别基于 3 个 DNA
片段的分析结果也支持山茶属作为一个单系类
群。作为山茶属的属下分类系统, 目前 3个影响
较大的系统的看法相差很大, 三者对该属的种
类、系统演化、起源及扩散存在不同的、甚至是
相反的观点。我们的研究工作由于取样较少, 虽
得到了几个有较高支持率的分支, 但这些结果还
不足于对目前的分类系统作出评价, 高密度多基
因的进一步研究正在进行中。
1参 考 文 献2
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