全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 1期 2016年 1月

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影响胃蛋白酶和胰蛋白酶纤溶活性因素初探及其纤溶活性失活研究
王正俊 1, 2，李 博 1, 2, 3, 4*，郭立玮 1, 2*，吴勉华 3, 4，朱华旭 1, 2
1. 南京中医药大学 江苏省中药资源产业化过程协同创新中心，江苏 南京 210023
2. 南京中医药大学 中药复方分离工程重点实验室，江苏 南京 210029
3. 南京中医药大学第一临床医学院，江苏 南京 210046
4. 南京中医药大学 江苏省中医药防治肿瘤协同创新中心，江苏 南京 210023
摘 要：目的 通过探讨影响胃蛋白酶和胰蛋白酶纤溶活性的因素及其纤溶活性失活方法，排除胃蛋白酶和胰蛋白酶对中药
鼠妇 Armadillidium vulgare活性粗蛋白纤溶活性检测的干扰，以在鼠妇活性粗蛋白酶解过程，获取相对分子质量更小、效价
更高的蛋白质或多肽。方法 采用纤溶蛋白平板法分别研究 pH值、温度、金属离子、酶抑制剂和表面活性剂对胃蛋白酶和
胰蛋白酶纤溶活性的影响，以获取较佳的酶失活工艺，并研究较佳酶失活工艺对尿激酶、蚓激酶、鼠妇纤溶酶纤溶活性的影
响。结果 pH 值、温度、金属离子、酶抑制剂和表面活性剂均可对胃蛋白酶和胰蛋白酶纤溶活性产生影响，其中胃蛋白酶
的最优失活方案为 pH 6.0～8.0；胰蛋白酶的最优失活方案为质量浓度 25 mg/mL TLCK和浓度 1 mmol/L EDTA的混合制剂。
结论 研究所获取的较佳酶失活工艺，可用于以纤维蛋白平板法检测胃蛋白酶、胰蛋白酶降解产物的纤溶活性，操作简单，
重复性好，稳定性好。
关键词：胃蛋白酶；胰蛋白酶；纤溶活性；纤维蛋白平板法；酶失活；尿激酶；蚓激酶；鼠妇纤溶酶
中图分类号：R284.2 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2016)01 - 0046 - 11
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.01.008
Effect of factors on pepsin and trypsin fibrinolytic activity and deactivation of
fibrinolytic activity
WANG Zheng-jun1, 2, LI Bo1, 2, 3, 4, GUO Li-wei1, 2, WU Mian-hua3, 4, ZHU Hua-xu1, 2
1. Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization, Nanjing University of Chinese
Medicine, Nanjing 210023, China
2. Key Laboratory of Separation Engineering for Chinese Medicine Compound, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing
210029, China
3. The First Clinical Medical College, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210046, China
4. Jiangsu Collaborative Innovation Center of Traditional Chinese Medicine Prevention and Treatment of Tumor, Nanjing
University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China
Abstract: Objective To investigate the method for study on the effect of factors on pepsin and trypsin fibrinolytic activity and
deactivation of fibrinolytic activity and to eliminate the interference of pepsin and trypsin on the detection of crude protein fibrinolytic
activity of Armadillidium vulgare (porcellio plasmin) in order to obtain the proteins or peptides which have the smaller molecular
weight but higher titer during the pepsin and trypsin degradation. Methods To study the effect of pepsin and trypsin deactivation on
pH value, temperature, metal ions, enzyme inhibitor, surfactant, and responsing fibrinolytic by fiber fibrin plate assay. The better
enzyme deactivation process was obtained and used for studying the effect on the fibrinolytic activity of urokinase, lumbrokinase, and
porcellio plasmin. Results All the pH value, temperature, metal ions, enzyme inhibitor, and surfactant have had an impact on pepsin
and trypsin fibrinolytic activity. Among them the optimum deactivation of pepsin was pH 6.0—8.0, while the optimum deactivation

收稿日期：2015-08-25
基金项目：国家自然科学基金资助项目（81274096，81303230）；江苏省科技厅产学研联合创新资金-前瞻性研究项目（BY2012036）；江苏省
科技支撑计划-社会发展项目（BE-2012763）；中国博士后科学基金（2013M541704）；江苏省博士后科学基金（1301133C）
作者简介：王正俊（1989—），男，硕士研究生，从事中药新剂型新技术研究。E-mail: 18351895383@163.com
*通信作者 李 博，博士，副研究员，研究方向为中药新剂型及新技术研究。Tel: (025)86798188 E-mail: zodlee@163.com
郭立玮，研究员，研究方向为中药新剂型及新技术研究。Tel: (025)86798188 E-mail: guoliwei815@126.com
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of trypsin was mixed preparation with TLCK at the concentration of 25 mg/mL and EDTA at the concentration of 1 mmol/L.
Conclusion This study has obtained the better enzyme deactivation process which could be used for the detection of fibrinolytic
activity of pepsin and trypsin degradation product by fiber fibrin plate assay, the operation is simple, and the repeatability and stability
are good.
Key words: pepsin; trypsin; fibrinolytic activity; fiber fibrin plate assay; enzyme deactivation; urokinase; lumbrokinase; porcellio
plasmin

《本草纲目》中记载虫类药大多具有活血化瘀、
通经疏络之功效。现代研究表明，发挥此类药理作
用的物质多为蛋白质或多肽，如地鳖溶纤蛋白[1]、
全蝎酶解抗凝多肽[2]、单环刺螠纤溶酶[3]等。在动
物药的组成中，蛋白质所占比例非常大，如蛇毒内
的蛋白质质量分数为 90%[4]，蜈蚣体内的蛋白质质
量分数为 60%～70%[5]，鹿血中的蛋白质质量分数
为 70%～80%，而蚂蚁中的蛋白质质量分数也有
42%～67%。从全蝎体内提取得到的全蝎酶解抗凝
多肽[2]具有抗惊厥、抗癫痫和镇痛镇静的作用，现
代研究表明尚可用于肿瘤等恶性疾病的治疗[6-7]；从
地龙中提取的蚓激酶具有溶解纤维蛋白作用[8-10]。
从天然药物中分离纯化出具有高纤维蛋白特异性的
纤溶酶成了目前研究热点之一。
本课题组已经成功从中药鼠妇 Armadillidium
vulgare Latreille中分离出鼠妇纤溶酶，其相对分子
质量为 3.849×104，前期对其酶学性质研究发现[11]，
鼠妇纤溶酶的最适反应温度为 40 ℃，最适反应 pH
值为 7.0；对甲苯磺酰-L-赖氨酰氯甲酮（TLCK）、
乙二胺四乙酸（EDTA）、乙二醇二乙醚二胺四乙酸
（EGTA）、苯甲基磺酞氟（PMSF）抑制作用相对较
弱，剩余纤溶酶活力均高于 75%，而 aprotinin、
pepstain A对鼠妇纤溶酶纤溶活性则完全抑制；而且
其口服有效。
为使其发挥更广泛的用途，本实验通过模拟胃
肠环境对鼠妇活性粗蛋白进行酶解后再分离而获得
相对分子质量更小、效价更高的蛋白或多肽。胃蛋
白酶和胰蛋白酶是酶解提取法中常用的 2 种蛋白
酶。胃蛋白酶（pepsin）属于天冬氨酸蛋白水解酶
类，是胃消化蛋白水解酶，相对分子质量为 3.1×
104～3.6×104[12]，其前体是胃蛋白酶原。胰蛋白酶
（trypsin）为蛋白酶的一种，相对分子质量小于 2.4×
104[13]，是从牛、羊、猪的胰脏中提取的一种丝氨酸
蛋白水解酶[13]。在蛋白质组学分析中，胰蛋白酶是
应用最多的蛋白酶，由于许多蛋白质富含赖氨酸和
精氨酸，因而经胰蛋白酶作用之后得到的片段很适
合用于质谱分析蛋白质的氨基酸排列[14]。
据文献报道[15-16]，胃蛋白酶和胰蛋白酶都具有
纤溶活性，而对于如何有效地使这 2种蛋白酶纤溶
活性完全失活缺乏系统研究和文献报道，本实验的
聚集点在于如何在保证酶解产物纤溶活性的基础上
有效地使上述 2种蛋白酶完全失活。本实验在前期
鼠妇纤溶酶的酶学性质研究的基础上分别探讨：①
pH值、温度、金属离子、酶抑制剂和表面活性剂[17-21]
对模拟胃肠环境中胃蛋白酶和胰蛋白酶纤溶活性的
影响，并获取较佳的酶失活工艺；②较佳酶失活工
艺对尿激酶、蚓激酶和鼠妇纤溶酶的纤溶活性的影
响，希望得出最优失活方案，即在保持尿激酶、蚓
激酶和鼠妇纤溶酶最大稳定性的前提下使胃蛋白酶
和胰蛋白酶的纤溶活性有效失活。
1 仪器与材料
BFM-T6BI 贝利超微粉碎机，济南倍力粉体技
术工程有限公司；Allegra 64R Centrifμge 高速冷冻
离心机，美国贝克曼库尔特有限公司；HH-1 恒温
水浴锅，常州国华电器有限公司；LRSH-150-III恒
温恒湿培养箱，上海跃进医疗器械有限公司；
Centrivap型抗酸型冷冻离心浓缩仪，美国 Labconco
公司。
牛血清纤维蛋白原（批号 BJ0624YA13）、凝血
酶（批号 XJ0719XA13），上海源叶生物科技有限公
司；琼脂糖（批号 20131121），国药集团化学试剂
有限公司；硫酸铵（批号 1302151），西陇化工股份
有限公司；胃蛋白酶（批号 313A0313）、胰蛋白酶
（批号 112B1220），Solarbio公司；尿激酶标准品（批
号 140607）、蚓激酶标准品（批号 140736），中国食
品药品检定研究院。
人工胃液：取稀盐酸 16.4 mL，加水约 800 mL
与胃蛋白酶 10 g，摇匀后，加水稀释至 1 L，即为
人工胃液[22]。记为W液（10.0 mg/mL）。
人工肠液：取磷酸二氢钾（KH2PO4）6.8 g，加
水 500 mL使溶解，用 0.1 mol/L的氢氧化钠调节 pH
值至 6.8，另取胰蛋白酶 10 g加水适量溶解，2种溶
液混合后，加水稀释至 1 L，即为人工肠液[22]。记
为 Y液（10.0 mg/mL）。
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2 方法与结果
2.1 W 液中胃蛋白酶和 Y 液中胰蛋白酶纤溶活性
的影响因素
2.1.1 剩余酶相对纤溶活性的测定 按照Astrup的
纤维蛋白平板法[23]（稍有改进），制备纤维蛋白平
板：牛血清纤维蛋白原、凝血酶用 PBS缓冲液（pH
7.8）溶解，先配制 1.0%的琼脂糖 20 mL煮沸，冷
却至 50～60 ℃，向其中加入 5 mg/mL牛血清纤维
蛋白原溶液 10 mL及 10 U/mL的凝血酶 1 mL迅速
摇匀，倒入培养皿中，室温静置使其充分凝固，并
在其上打出若干直径约为 2 mm的小孔。分别加入
10 μL 经各种因素处理的W液（Y液）或 10 μL W
液（Y液）。放入 37 ℃恒温培养箱中，18 h后测量
纤维平板溶圈半径（mm）大小。通过测量溶圈半
径，计算溶圈面积（mm2），通过溶圈面积大小来反
映纤溶活性强弱。
剩余酶相对纤溶活性＝经各种因素处理的W液（Y液）
的溶圈面积/W液（Y液）的溶圈面积
2.1.2 pH 值对胃蛋白酶和胰蛋白酶纤溶活性的影
响 分别配制如下缓冲液：0.1 mol/L NaAc-HCl（pH
1.0～2.0）、0.1 mol/L CH3COONH4-HCl（pH 3.0～
6.0）、0.1 mol/L Tris-HCl（pH 7.0～8.0）、0.1 mol/L
glycine-NaOH（pH 9.0～12.0）、0.1 mol/L Na2HPO4
（pH 13.0），分别向各缓冲液中加入 Y液或W液适
量（Y液或W液-pH缓冲液 1∶10），充分混合 37 ℃
孵化 60 min后各取 10 μL分别点样于纤维蛋白平板
的孔中，37 ℃保温，18 h后比较溶圈半径大小（图
1）。剩余胃蛋白酶或胰蛋白酶在不同 pH 值中相对
纤溶活性结果见表 1。
分别以W液（pH 1.5）作为胃蛋白酶的空白对

A-pH 1.0 B-pH 2.0 C-pH 3.0 D-pH 4.0 E-pH 5.0 F-pH 6.0
G-pH 7.0 H-pH 8.0 I-pH 9.0 J-pH 10.0 K-pH 11.0 L-pH 12.0
N-pH 13.0 M-pH 1.5 O-pH 6.8

图1 胃蛋白酶 (a) 和胰蛋白酶 (b) 在不同pH值中纤溶活性
Fig. 1 Fibrinolytic activity of pepsin (a) and trypsin (b) in
different pH values
表 1 胃蛋白酶和胰蛋白酶在不同 pH 值中相对纤溶活性
( x±s, n = 5)
Table 1 Relative fibrinolytic activity of pepsin and trypsin
in different pH values ( x±s, n = 5)
pH值
剩余酶相对纤溶活性/%
胃蛋白酶 胰蛋白酶
1.0 52.61±0.51 65.14±0.56
1.5 100.01±0.11 —
2.0 32.11±0.41 21.36±0.31
3.0 16.23±0.22 15.24±0.22
4.0 8.21±0.12 12.13±0.18
5.0 1.39±0.02 45.41±0.58
6.0 1.11±0.01 55.35±0.74
6.8 — 100.01±0.04
7.0 0.00±0.01 53.70±0.67
8.0 0.90±0.01 53.12±0.58
9.0 1.01±0.01 51.24±0.68
10.0 2.25±0.03 48.12±0.57
11.0 9.82±0.14 46.83±0.45
12.0 15.25±0.22 22.72±0.23
13.0 38.36±0.49 70.34±0.86
“—”未检测
“—” not detected

照和 Y液（pH 6.8）作为胰蛋白酶的空白对照，由
图 1-a和表 1可以看出，胃蛋白酶在不同的 pH值环
境中，溶圈面积大小差异明显，表明 pH 值对于胃
蛋白酶的纤溶活性有较显著影响，在 pH 1.5时，溶
圈是最大的；pH 6.0～8.0，溶圈无变化，以及剩余
酶相对活性接近 0，结果表明 pH值在这个范围内，
胃蛋白酶已有效失活。由图 1-b和表 1可以看出，
胰蛋白酶在 pH 6.8时，溶圈是最大的，在 pH 1.0～
13.0，溶圈是有变化的，在 pH 2.0～4.0的剩余酶相
对活性已降到 22%以下，提示 pH 值的改变并不能
使胰蛋白酶完全失活。推测可能是由于各自不同的
酶学性质决定胃蛋白酶和胰蛋白酶在不同 pH 值环
境中的纤溶活性存在差异。
重复性试验：取同样以上缓冲液（Y 液或 W
液-pH缓冲液 1∶10）5份，按“2.1.1”项方法计算
出剩余酶相对活性。结果显示剩余酶相对活性
RSD＜1.5%，表明该方法重复性好。
2.1.3 温度对胃蛋白酶和胰蛋白酶纤溶活性的影响
取 Y液或W液适量分别置于 10、20、30、40、50、
60、70、80、90、100 ℃的恒温水浴中保温 0.8 h
b a
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后各取 10 μL，分别点样于纤维蛋白平板的孔中，
37 ℃保温，18 h后比较溶圈半径大小（图 2）。剩
余胃蛋白酶或胰蛋白酶在不同温度中相对活性结果
见表 2。

A-10 ℃ B-20 ℃ C-30 ℃ D-40 ℃ E-50 ℃ F-60 ℃
G-70 ℃ H-80 ℃ I-90 ℃ J-100 ℃
图 2 胃蛋白酶 (a) 和胰蛋白酶 (b) 在不同温度中纤溶活性
Fig. 2 Fibrinolytic activity of pepsin (a) and trypsin (b) in
different temperatures

表 2 胃蛋白酶和胰蛋白酶在不同温度中相对纤溶活性
( x±s, n = 5)
Table 2 Relative fibrinolytic activity of pepsin and trypsin
in different temperatures ( x±s, n = 5)
温度/℃
剩余酶相对纤溶活性/%
胃蛋白酶 胰蛋白酶
10 96.52±1.42 98.83±0.95
20 100.01±0.19 100.01±0.23
30 98.01±0.98 100.05±0.52
40 97.12±1.34 100.07±0.99
50 101.03±0.78 98.15±1.01
60 98.17±0.34 30.12±0.36
70 99.16±0.46 1.38±0.02
80 101.07±0.24 0.92±0.01
90 98.17±0.58 0.70±0.01
100 100.02±0.69 0.00±0.01

以 20 ℃（常温）作为胃蛋白酶和胰蛋白酶空
白对照，由图 2-a和表 2可以看出，在 10～100 ℃，
胃蛋白酶溶圈面积大小差异不显著，其剩余酶相对
活性在（96.52±1.42）%～（101.07±0.24）%，提
示温度对于胃蛋白酶纤溶活性基本无影响，且在
10～100 ℃无法完全失活，推测可能原因为人工胃
液中的胃蛋白酶在较高温度下发生水解产生具有纤
溶活性的小分子肽。由图 2-b和表 2可以看出，胰
蛋白酶溶圈面积大小差异明显，在 10～40 ℃溶圈
面积随着温度升高而逐渐增大，其剩余酶相对活性
从（98.83±0.95）%逐渐上升至（100.07±0.99）%，
提示胰蛋白酶的纤溶活性越来越强，推测其原因是
正常人体体温范围是 36.0～37.5 ℃，正好处在胰蛋
白酶纤溶活性较强的温度范围内[18]，说明肠液中胰
蛋白酶在正常人体中纤溶活性较强；在 50 ℃以上
时，溶圈面积越来越小，其剩余酶相对活性急剧下
降；在 70 ℃以上时，无溶圈出现，其剩余酶相对
活性接近 0，表明温度对于胰蛋白酶的纤溶活性有
较为显著的影响。
重复性试验：取同样以上缓冲液（不同温度）5
份，按“2.1.1”项方法计算出剩余酶相对活性。结
果显示剩余酶相对活性 RSD＜1.2%，表明该方法重
复性好。
2.1.4 金属离子对胃蛋白酶和胰蛋白酶纤溶活性的
影响 用 20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.2）缓冲液分别
配制 0.1 mol/L CuSO4·5H2O、MnSO4·H2O、MgSO4·
7H2O、FeSO4·7H2O、CaCl2、ZnCl2、NaCl、KCl、
AlCl3、FeCl3·6H2O、BaCl2·2H2O金属离子溶液。分
别向各金属离子溶液中加入 Y 液或 W 液适量（Y
液或W液-金属离子缓冲液 1∶10），充分混合 37 ℃
孵化 60 min后各取 10 μL分别点样于纤维蛋白平板
的孔中，37 ℃保温，18 h后比较溶圈半径大小（图
3）。剩余胃蛋白酶或胰蛋白酶相对活性结果见表 3。

A-CuSO4·5H2O B-MnSO4·H2O C-MgSO4·7H2O D-FeSO4·7H2O
E-CaCl2 F-ZnCl2 G-NaCl H-KCl I-AlCl3 J-FeCl3·6H2O
K-BaCl2·2H2O L-W solution O-Y solution

图 3 胃蛋白酶 (a) 和胰蛋白酶 (b) 在不同金属离子中纤
溶活性
Fig. 3 Fibrinolytic activity of pepsin (a) and trypsin (b) in
different metal ions

以 W 液作为胃蛋白酶的空白对照，以 Y 液作
为胰蛋白酶的空白对照，由图 3-a和表 3可以看出，
不同的金属离子环境下，溶圈面积大小差异明显，
在 0.1 mol/L Mg2+、K+、Na+环境中，无溶圈出现，
其剩余酶相对活性接近 0，提示胃蛋白酶的活性已
b a
b a
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有效失活，由此可推测在较大量服用 Mg2+、K+、
Na+时，胃液中胃蛋白酶的纤溶活性可以有效失活。
由图 3-b和表 3可以看出，溶圈面积大小差异不明
显，其剩余酶相对活性都在 36%以上，表明金属离
子对于胰蛋白酶的纤溶活性无显著影响，提示胰蛋
白酶无法完全失活，这可能由于肠液中复杂的环境
和胰蛋白酶的酶学性质决定。
重复性试验：取同样以上缓冲液（Y 液或 W
液-金属离子缓冲液 1∶10）5 份，按“2.1.1”项方
表 3 胃蛋白酶和胰蛋白酶在不同金属离子中相对纤溶活性
( x±s, n = 5)
Table 3 Relative fibrinolytic activity of pepsin and trypsin
in different metal ions ( x±s, n = 5)
金属离子 (0.1 mol·L−1)
剩余酶相对纤溶活性/%
胃蛋白酶 胰蛋白酶
对照 100.01±0.97 100.01±0.89
Cu2+ 85.12±1.02 38.31±0.34
Mn2+ 88.15±1.09 63.52±0.78
Mg2+ 0.00±0.01 78.91±0.67
Fe2+ 100.12±0.23 70.33±0.89
Ca2+ 87.81±1.07 72.51±0.34
Zn2+ 100.15±0.87 80.11±0.78
Na+ 0.00±0.01 82.52±0.76
K+ 0.00±0.01 83.12±0.95
Al3+ 101.01±1.09 78.51±0.42
Fe3+ 103.15±0.54 83.81±0.48
Ba2+ 81.31±0.41 36.84±0.34
法计算出剩余酶相对活性。结果显示剩余酶相对活
性 RSD＜1.3%，表明该方法重复性好。
2.1.5 酶抑制剂和表面活性剂对胃蛋白酶和胰蛋白
酶纤溶活性的影响 本实验采用 10 种不同的蛋白
酶抑制剂和 2种表面活性剂[16-20]，分别如下：苯甲
基磺酞氟（PMSF）、对甲苯磺酰-L-赖氨酰氯甲酮
（TLCK）、对甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲酮（TPCK）、
乙二胺四乙酸（EDTA）、乙二醇二乙醚二胺四乙酸
（EGTA）、β-巯基乙醇（β-mercaptoethanol）、胃酶抑
素 A（pepstain A）、大豆胰蛋白酶抑制剂（KTI，主
要对胰蛋白酶直接且专一性起作用）、大豆蛋白酶抑
制剂（SBTI，主要是抑制胰蛋白酶的活性）、抑肽
酶（aprotinin）和失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚
（Tween 80，是一种表面活性剂）、十二烷基硫酸钠
（SDS）。用 20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.2）缓冲液分
别配制相应溶液（浓度配制依据：根据预试验、各
试剂的溶解度和相关报道[16-20]，表 4）。
分别向各酶抑制剂和表面活性剂的溶液中加入
Y液或W液适量（Y液或W液-酶抑制剂和表面活
性剂缓冲液 1∶10），充分混合 37 ℃孵化 60 min后
各取 10 μL 分别点样于纤维蛋白平板的孔中，37 ℃
保温，18 h后比较溶圈半径大小（图 4、5）。剩余
胃蛋白酶或胰蛋白酶相对活性结果见表 5、6。
以W液作为胃蛋白酶的空白对照，从图 4和表
5 可以看出，在不同浓度酶抑制剂和表面活性剂的
环境下，溶圈面积大小差异明显，随着浓度的增大，
大部分的溶圈面积有减小的趋势，其剩余酶相对活

表 4 各酶抑制剂和表面活性剂配制的溶液浓度
Table 4 Each enzyme inhibitor and surfactant in different formulating concentration
试剂 浓度 1 浓度 2 浓度 3 浓度 4 浓度 5 浓度 6
PMSF 0.1 mmol·L−1 1 mmol·L−1 5 mmol·L−1 10 mmol·L−1 50 mmol·L−1 100 mmol·L−1
TLCK 0.1 mg·mL−1 1 mg·mL−1 5 mg·mL−1 10 mg·mL−1 25 mg·mL−1 50 mg·mL−1
TPCK 0.1 mg·mL−1 1 mg·mL−1 5 mg·mL−1 10 mg·mL−1 25 mg·mL−1 50 mg·mL−1
EDTA 0.5 mmol·L−1 1 mmol·L−1 5 mmol·L−1 10 mmol·L−1 20 mmol·L−1 50 mmol·L−1
EGTA 0.5 mmol·L−1 1 mmol·L−1 5 mmol·L−1 10 mmol·L−1 20 mmol·L−1 50 mmol·L−1
β-mercaptoethanol 0.1 mmol·L−1 1 mmol·L−1 5 mmol·L−1 10 mmol·L−1 50 mmol·L−1 100 mmol·L−1
pepstain A 1 mg·mL−1 5 mg·mL−1 10 mg·mL−1 25 mg·mL−1 50 mg·mL−1 100 mg·mL−1
KTI 1 mg·mL−1 5 mg·mL−1 10 mg·mL−1 25 mg·mL−1 50 mg·mL−1 100 mg·mL−1
SBTI 1 mg·mL−1 5 mg·mL−1 10 mg·mL−1 25 mg·mL−1 50 mg·mL−1 100 mg·mL−1
aprotinin 0.1 mmol·L−1 0.5 mmol·L−1 1.0 mmol·L−1 5.0 mmol·L−1 10.0 mmol·L−1 50.0 mmol·L−1
Tween 80 0.1% (v/v) 0.5% (v/v) 1.0% (v/v) 5.0% (v/v) 10% (v/v) 50% (v/v)
SDS 0.1% (w/v) 0.5% (w/v) 1.0% (w/v) 5.0% (w/v) 10% (w/v) 50% (w/v)
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 1期 2016年 1月

·51·

A-pepstain A B-KTI C-SBTI D-aprotinin E-Tween 80 F-SDS
G-PMSF H-TLCK I-TPCK J-EGTA L-EDTA M-β-mercaptoethanol
1→6溶液浓度递增（外圈→内圈溶液浓度递增） 7-W液
1→6 solution concentration increase progressively (outer→inside) 7-W
solution

图 4 胃蛋白酶在不同酶抑制剂和表面活性剂中纤溶活性
Fig. 4 Fibrinolytic activity of pepsin in different enzyme
inhibitors and surfactants

A-pepstain A B-KTI C-SBTI D-aprotinin E-Tween 80 F-SDS
G-PMSF H-TLCK I-TPCK J-EGTA L-EDTA M-β-mercaptoethanol
1→6溶液浓度递增（外圈→内圈溶液浓度递增） 7-Y液
1→6 solution concentration increase progressively (outer→inside) 7-Y
solution

图 5 胰蛋白酶在不同酶抑制剂和表面活性剂中纤溶活性
Fig. 5 Fibrinolytic activity of trypsin in different enzyme
inhibitors and surfactants
表 5 胃蛋白酶在不同酶抑制剂和表面活性剂中相对纤溶活性 ( x±s, n = 5)
Table 5 Relative fibrinolytic activity of pepsin in different enzyme inhibitors and surfactants ( x±s, n = 5)
试剂
剩余酶相对纤溶活性/%
浓度 1 浓度 2 浓度 3 浓度 4 浓度 5 浓度 6
对照 100.09±0.89 100.01±0.98 100.03±0.56 100.10±0.67 100.03±0.64 100.03±0.89
PMSF 83.81±0.64 80.72±0.45 76.72±0.67 50.11±0.48 20.51±0.20 8.74±0.08
TLCK 65.62±0.35 60.73±0.57 30.51±0.28 28.52±0.26 15.11±0.13 17.86±0.12
TPCK 30.51±0.25 30.71±0.19 31.81±0.23 25.42±0.24 10.43±0.09 3.88±0.03
EDTA 37.21±0.24 19.74±0.13 10.13±0.09 9.61±0.08 7.13±0.05 3.45±0.03
EGTA 40.14±0.12 20.55±0.13 18.51±0.15 16.81±0.15 15.42±0.14 0.00±0.01
β-mercaptoethanol 29.82±0.13 36.86±0.23 37.13±0.34 21.82±0.03 17.64±0.04 10.91±0.07
pepstain A 41.81±0.34 47.67±0.23 35.81±0.34 30.11±0.16 32.15±0.29 34.54±0.23
KTI 66.14±0.45 65.82±0.27 55.75±0.45 50.81±0.34 30.81±0.19 26.70±0.23
SBTI 77.53±0.66 82.55±0.56 76.71±0.45 50.14±0.34 20.71±0.18 10.62±0.01
aprotinin 80.52±0.78 79.82±0.34 78.61±0.12 50.84±0.23 25.16±0.21 20.14±0.19
Tween 80 30.31±0.29 38.51±0.34 29.85±0.15 30.34±0.13 28.77±0.04 20.42±0.05
SDS 87.11±0.34 85.41±0.45 84.63±0.49 83.82±0.60 84.18±0.03 86.14±0.34
浓度 1→浓度 6：酶抑制剂和表面活性剂浓度递增，下表同
Concentration 1→concentration 6: solution concentration of enzyme inhibitor and surfactant increase progressively, same as below

性总体也呈现下降趋势，表明酶抑制剂和表面活性
剂的浓度对于胃蛋白酶的纤溶活性有较为显著影响。
尤其在 PMSF、TLCK、TPCK、EDTA、EGTA各浓
度下，溶圈面积大小差异显著，在 EGTA 达到 50
mmol/L时，溶圈无变化，其剩余酶相对活性为 0，
表明胃蛋白酶的纤溶活性已经有效失活，这可能与
胃蛋白酶长期处在胃液中有紧密的关系。
重复性试验：取同样以上缓冲液（W 液-酶抑
制剂和表面活性剂缓冲液 1∶10）5份，按“2.1.1”
项方法计算出剩余酶相对活性。结果显示剩余酶相
对活性 RSD＜1.0%，表明该方法重复性好。
以 Y液作为胰蛋白酶的空白对照，从图 5和表
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 1期 2016年 1月

·52·
6 可以看出，在不同浓度酶抑制剂和表面活性剂的
环境下，溶圈面积大小差异明显，随着浓度的增大，
大部分的溶圈面积有减小的趋势，其剩余酶相对活
性总体也呈现下降趋势，提示酶抑制剂和表面活性
剂的浓度对于胰蛋白酶的纤溶活性有较为显著影
响。尤其在 PMSF、TLCK、TPCK、EDTA、EGTA
各浓度下溶圈面积大小差异更显著，在 PMSF浓度
达到 100 mmol/L；TLCK质量浓度达到 25 mg/mL
以上；TPCK质量浓度达 50 mg/mL；EGTA浓度达
到 20 mmol/L以上；EDTA浓度达到 1 mmol/L以上；
以上酶抑制剂的浓度时无溶圈，其剩余酶相对活性
均为 0，提示胰蛋白酶活性已经失活，推测可能与
上述酶抑制剂的特殊分子结构以及胰蛋白酶的酶学
性质有关。

表 6 胰蛋白酶在不同酶抑制剂和表面活性剂中相对纤溶活性 ( x±s, n = 5)
Table 6 Relative fibrinolytic activity of trypsin in different enzyme inhibitors and surfactants ( x±s, n = 5)
试剂
剩余酶相对纤溶活性/%
浓度 1 浓度 2 浓度 3 浓度 4 浓度 5 浓度 6
对照 100.02±1.03 100.04±0.13 100.10±0.24 100.08±0.98 100.08±0.72 100.03±0.67
PMSF 87.51±0.79 80.54±0.67 60.58±0.13 50.62±0.34 18.16±0.12 0.00±0.01
TLCK 30.81±0.29 21.50±0.12 10.85±0.08 8.77±0.10 0.00±0.01 0.00±0.01
TPCK 32.83±0.31 33.14±0.31 32.64±0.23 20.76±0.19 9.89±0.11 0.00±0.01
EDTA 25.72±0.12 0.00±0.01 0.00±0.01 0.00±0.01 0.00±0.01 0.00±0.01
EGTA 38.55±0.34 35.61±0.21 27.84±0.12 15.65±0.09 0.00±0.01 0.00±0.01
β-mercaptoethanol 20.14±0.13 39.83±0.25 45.73±0.34 38.93±0.24 25.75±0.12 17.78±0.14
Pepstain A 27.63±0.04 35.71±0.34 27.42±0.23 26.56±0.20 28.72±0.11 27.81±0.18
KTI 30.21±0.23 29.54±0.12 15.73±0.08 14.8±0.13 7.73±0.06 5.54±0.03
SBTI 32.74±0.27 33.45±0.14 25.64±0.12 23.2±0.08 15.86±0.12 9.51±0.11
Aprotinin 80.24±0.35 75.14±0.56 68.14±0.35 50.4±0.39 20.83±0.18 13.75±0.14
Tween80 50.82±0.31 55.72±0.18 48.74±0.36 52.5±0.14 47.53±0.23 38.73±0.18
SDS 86.35±0.49 84.33±0.17 82.76±0.27 82.9±0.18 85.75±0.36 85.11±0.24

重复性试验：取同样以上缓冲液（Y液-酶抑制
剂和表面活性剂缓冲液 1∶10）5份，按“2.1.1”项
方法计算出剩余酶相对活性。结果显示剩余酶相对
活性 RSD＜1.4%，表明该方法重复性好。
综上所述，成功获取了较佳的酶失活工艺，对
于胃蛋白酶：可以在 pH 6～8，Mg2+、Na+、K+环境
中有效失活；对于胰蛋白酶：可以在 PMSF浓度达
到 100 mmol/L；TLCK质量浓度达到 25 mg/mL以
上；TPCK质量浓度达 50 mg/mL；EGTA浓度达到
20 mmol/L以上；EDTA浓度达到 1 mmol/L以上时
有效失活。
2.2 较佳酶失活工艺对尿激酶、蚓激酶和鼠妇纤溶
酶纤溶活性的影响
为使上述较佳的酶失活工艺能应用推广于目前
常用的其他纤溶酶，如尿激酶、蚓激酶等，以及本
课题组发现的鼠妇纤溶酶；并寻找最优失活方案，
即在保持尿激酶、蚓激酶和鼠妇纤溶酶最大稳定性
的前提下，让胃蛋白酶和胰蛋白酶有效失活，进一
步研究了较佳酶失活工艺对尿激酶、蚓激酶和鼠妇
纤溶酶的纤溶活性的影响。
根据图 1-a、3-a、4、5所示结果，分别配制 0.1
mol/L Tris-HCl（pH 6～8），0.1 mol/L MgSO4·7H2O、
NaCl、KCl；50、25 mg/mL TPCK，50、25 mg/mL
TLCK，50、20、10、5、1 mmol/L EDTA，50、20、
10、5、1 mmol/L EGTA，100 mmol/L PMSF溶液，
分别向以上溶液中加入尿激酶液（10.0 mg/mL）、蚓
激酶液（10.0 mg/mL）、鼠妇纤溶酶液（10.0 mg/mL）
适量（尿激酶液或蚓激酶液或鼠妇纤溶酶液-以上缓
冲液 1∶10），充分混合 37 ℃孵化 60 min 后各取
10 μL 分别点样于纤维蛋白平板的孔中，37 ℃保
温，18 h后比较溶圈半径大小（图 6～8）。剩余尿
激酶或蚓激酶或鼠妇纤溶酶相对活性结果见表 7。
2.2.1 对尿激酶纤溶活性的影响 以尿激酶作为空
白对照，由图 6和表 7可以看出，尿激酶在较佳酶
失活工艺中，所呈现的溶圈面积存在差异，其剩余
酶的相对活性同样有差异，说明在以上不同的缓冲
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 1期 2016年 1月

·53·

A-pH 6 Tris-HCl B-pH 7 Tris-HCl C-pH 8 Tris-HCl D-MgSO4·7H2O
E-NaCl F-KCl G-50 mg/mL TPCK H-25 mg/mL TPCK I-50 mg/mL
TLCK J-25 mg/mL TLCK K-50 mmol/L EDTA L-20 mmol/L EDTA
M-10 mmol/L EDTA N-50 mmol/L EGTA O-20 mmol/L EGTA P-10
mmol/L EGTA Q-100 mmol/L PMSF R-urokinase W-1 mmol/L EGTA
S-5 mmol/L EGTA T-10 mmol/L EGTA X-10 mmol/L EDTA Y-1
mmol/L EDTA Z-5 mmol/L EDTA
图 6 尿激酶在不同溶液中纤溶活性
Fig. 6 Fibrinolytic activity of urokinase in different solutions

A-pH 6 Tris-HCl B-pH 7 Tris-HCl C-pH 8 Tris-HCl D-MgSO4·7H2O
E-NaCl F-KCl G-50 mg/mL TPCK H-25 mg/mL TPCK I-50 mg/mL
TLCK J-25 mg/mL TLCK K-50 mmol/L EDTA L-20 mmol/L EDTA
M-10 mmol/L EDTA N-50 mmol/L EGTA O-20 mmol/L EGTA P-10
mmol/L EGTA Q-100 mmol/L PMSF U-lumbrokinase W-1 mmol/L
EGTA S-5 mmol/L EGTA T-10 mmol/L EGTA X-10 mmol/L EDTA
Y-1 mmol/L EDTA Z-5 mmol/L EDTA
图 7 蚓激酶在不同溶液中纤溶活性
Fig. 7 Fibrinolytic activity of lumbrokinase in different
solutions

液中其纤溶活性强弱不一致。pH 6～8，Mg2+、Na+、
K+、EDTA 和 EGTA 对其活性影响不是很显著；
TPCK 和 TLCK 对其活性影响明显，当 TPCK 和
TLCK 质量浓度达到 50 mg/mL时，其剩余酶的相
对活性基本维持在 1.5%以下，在其他缓冲液中其剩
余酶的相对活性均维持在 85%以上（除了在 PMSF
中剩余酶的相对活性维持在 67%）。这可能与 TPCK
和 TLCK特殊的分子结构有关。可以推测：如果尿
激酶口服，针对胃蛋白酶的失活建议在中性环境下
或者在Mg2+、Na+、K+中，尽量不要在TPCK和TLCK
环境中；针对胰蛋白酶的失活建议在 EDTA、EGTA、

A-pH 6 Tris-HCl B-pH 7 Tris-HCl C-pH 8 Tris-HCl D-MgSO4·7H2O
E-NaCl F-KCl G-50 mg/mL TPCK H-25 mg/mL TPCK I-50 mg/mL
TLCK J-25 mg/mL TLCK K-50 mmol/L EDTA L-20 mmol/L EDTA
M-10 mmol/L EDTA N-50 mmol/L EGTA O-20 mmol/L EGTA P-10
mmol/L EGTA Q-100 mmol/L PMSF V-porcellio plasmin W-1
mmol/L EGTA S-5 mmol/L EGTA T-10 mmol/L EGTA X-10 mmol/L
EDTA Y-1 mmol/L EDTA Z-5 mmol/L EDTA

图 8 鼠妇纤溶酶在不同溶液中纤溶活性
Fig. 8 Fibrinolytic activity of porcellio plasmin in different
solutions

PMSF中，尽量不要在 TPCK和 TLCK环境中。
稳定性试验：取同样以上缓冲液（尿激酶液-
缓冲液 1∶10），精密吸取 10 μL，分别于 0、2、6、
9、14、18、24 h 点样于纤维蛋白平板的孔中，按
“2.1.1”项方法计算出剩余酶相对活性。结果显示剩
余酶相对活性 RSD＜1.0%，表明以上缓冲液 24 h
内稳定。
重复性试验：取同样以上缓冲液（尿激酶液-
缓冲液 1∶10）5份，按“2.1.1”项方法计算出剩余
酶相对活性。结果显示剩余酶相对活性 RSD＜
1.0%，表明该方法重复性好。
2.2.2 对蚓激酶纤溶活性的影响 以蚓激酶作为空
白对照，由图 7和表 7可以看出，蚓激酶在较佳酶
失活工艺中，所呈现的溶圈面积存在显著差异。尤
其是 TPCK和 TLCK达到 50 mg/mL时，EDTA、
EGTA浓度达到 1 mmol/L以上时和PMSF浓度达到
100 mmol/L时对其活性影响很大，基本上无溶圈出
现，其剩余酶的相对活性为 0，说明其活性完全失
活；在 pH 6、8，Mg2+、Na+、K+溶液中以及在 TPCK
和 TLCK质量浓度达到 25 mg/mL时，溶圈面积较
大（相对尿激酶的溶圈面积），其剩余酶的相对活性
基本维持在 80%以上，说明对其活性影响较小。可
以推测，如果蚓激酶口服，针对胃蛋白酶的失活建
议在中性环境下或者在Mg2+、Na+、K+中；针对胰
蛋白酶的失活建议在 TLCK 质量浓度为 25 mg/mL
环境中。
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 1期 2016年 1月

·54·
表 7 尿激酶、蚓激酶、鼠妇纤溶酶在不同溶液中相对纤溶
活性 ( x±s, n = 5)
Table 7 Relative fibrinolytic activity of urokinase,
lumbrokinase, and porcellio plasmin in different solutions
( x±s, n = 5)
试剂
剩余酶相对纤溶活性/%
尿激酶 蚓激酶 鼠妇纤溶酶
对照 100.09±0.23 100.01±0.28 100.03±0.27
pH 6 92.35±0.29 92.55±0.39 92.76±0.65
pH 7 94.25±0.26 92.15±0.49 94.21±0.29
pH 8 95.11±0.34 90.78±0.34 92.97±0.26
Mg2+ 93.96±0.45 78.51±0.48 95.51±0.54
Na+ 95.17±0.20 90.71±0.18 96.64±0.51
K+ 94.75±0.34 91.81±0.16 99.72±0.12
TPCK 50 mg·mL−1 1.32±0.01 1.51±0.01 29.12±0.21
TPCK 25 mg·mL−1 31.25±0.24 98.17±0.41 78.98±0.29
TLCK 50 mg·mL−1 1.15±0.01 1.12±0.01 28.71±0.19
TLCK 25 mg·mL−1 20.51±0.20 95.16±0.39 79.18±0.28
EDTA 50 mmol·L−1 85.61±0.76 0.00±0.01 0.00±0.01
EDTA 20 mmol·L−1 88.15±0.38 0.00±0.01 0.00±0.01
EDTA 10 mmol·L−1 93.25±0.67 1.02±0.01 10.14±0.08
EDTA 5 mmol·L−1 97.45±0.89 1.05±0.01 10.21±0.10
EDTA 1 mmol·L−1 99.71±0.23 1.08±0.01 80.03±0.31
EGTA 50 mmol·L−1 87.27±0.39 0.00±0.01 0.00±0.01
EGTA 20 mmol·L−1 88.34±0.45 0.00±0.01 0.00±0.01
EGTA 10 mmol·L−1 97.23±0.29 0.00±0.01 0.00±0.01
EGTA 5 mmol·L−1 99.14±0.31 1.05±0.01 0.00±0.01
EGTA 1 mmol·L−1 99.86±0.32 1.08±0.01 75.31±0.45
PMSF 100 mmol·L−1 67.51±0.49 0.00±0.01 0.00±0.29

稳定性试验：取同样以上缓冲液（蚓激酶液-
缓冲液 1∶10），精密吸取 10 μL，分别于 0、2、6、
9、14、18、24 h 点样于纤维蛋白平板的孔中，按
“2.1.1”项方法计算出剩余酶相对活性。结果显示剩
余酶相对活性 RSD＜1.0%，表明以上缓冲液 24 h
内稳定。
重复性试验：取同样以上缓冲液（蚓激酶液-
缓冲液 1∶10）5份，按“2.1.1”项方法计算出剩余
酶相对活性。结果显示剩余酶相对活性 RSD＜
1.0%，表明该方法重复性好。
2.2.3 对鼠妇纤溶酶纤溶活性的影响 以鼠妇纤溶
酶作为空白对照，由图 8和表 7可以看出，较佳酶
失活工艺对于鼠妇纤溶酶纤溶活性的影响有差异
性，在 TPCK和 TLCK达到 25 mg/mL时，EDTA
和 EGTA达到 1 mmol/L时以及在 pH 6～8，Mg2+、
Na+、K+中溶圈面积较大（相对于鼠妇纤溶酶的溶
圈面积），其剩余酶的相对活性均维持在 75%以上；
在其他浓度的缓冲液中，溶圈变化不显著，其剩余
酶的相对活性基本维持在 30%以下。可以推测，在
保持鼠妇纤溶酶最大稳定性的前提下让胃蛋白酶和
胰蛋白酶有效失活的最优失活方案，即胃蛋白酶活
性完全失活可以在 pH 6～8，Mg2+、Na+、K+环境中；
胰蛋白酶活性完全失活可以在TLCK质量浓度为25
mg/mL和 EDTA浓度为 1 mmol/L。
稳定性试验：取同样以上缓冲液（鼠妇纤溶酶
液-缓冲液 1∶10），精密吸取 10 μL，分别于 0、2、
6、9、14、18、24 h点样于纤维蛋白平板的孔中，
按“2.1.1”项方法计算出剩余酶相对活性。结果显
示剩余酶相对活性 RSD＜1.0%，表明以上缓冲液
24 h内稳定。
重复性试验：取同样以上缓冲液（鼠妇纤溶酶
液-缓冲液 1∶10）5 份，按“2.1.1”项方法计算出
剩余酶相对活性。结果显示剩余酶相对活性 RSD＜
1.0%，表明该方法重复性好。
综上所述，得出了胃蛋白酶最优失活方案即在
保持尿激酶、蚓激酶和鼠妇纤溶酶最大稳定性的前
提下让胃蛋白酶有效失活，即 pH 6.0～8.0；质量浓
度为 25 mg/mL TLCK和浓度为 1 mmol/L EDTA是
比较适合胰蛋白酶失活的较好条件，如果单一制剂，
1 mmol/L EDTA对尿激酶和鼠妇纤溶酶的活性影响
较小，但对蚓激酶活性影响较大；25 mg/mL TLCK
对蚓激酶和鼠妇纤溶酶的活性影响较小，但对尿激
酶活性影响较大；所以需要进一步验证质量浓度为
25 mg/mL TLCK和浓度为 1 mmol/L EDTA的混合
制剂对蚓激酶、尿激酶、鼠妇纤溶酶和胰蛋白酶活
性的影响。
2.3 混合制剂对尿激酶、胰蛋白酶、蚓激酶和鼠妇
纤溶酶的纤溶活性的影响
配制质量浓度为 25 mg/mL TLCK 和浓度为 1
mmol/L EDTA的混合制剂溶液，分别向混合制剂溶
液中加入尿激酶液（10.0 mg/mL）、蚓激酶液（10.0
mg/mL）、鼠妇纤溶酶液（10.0 mg/mL）、Y液（10.0
mg/mL）适量（尿激酶液或蚓激酶液或鼠妇纤溶酶
液或 Y 液-混合制剂液 1∶10），充分混合 37 ℃孵
化 60 min后各取 10 μL分别点样于纤维蛋白平板的
孔中，37 ℃保温，18 h后比较溶圈半径大小（图 9）。
剩余尿激酶、蚓激酶、鼠妇纤溶酶、胰蛋白酶相对
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 1期 2016年 1月

·55·
活性结果见表 8。
由图 9和表 8可以看出，在加了质量浓度为 25
mg/mL TLCK和浓度为 1 mmol/L EDTA的混合制剂
的尿激酶、蚓激酶、鼠妇纤溶酶的溶液中剩余酶的
相对活性基本维持在 95%以上，故可推测混合制剂
对尿激酶、蚓激酶、鼠妇纤溶酶活性影响较单一制
剂更小，说明混合制剂优于单一制剂；而且混合制
剂对胰蛋白酶活性的影响根据溶圈无变化和剩余酶
的相对纤溶活性为 0，可以推测其已有效失活。所
以胰蛋白酶的最佳失活条件：质量浓度为 25 mg/mL
TLCK和浓度为 1 mmol/L EDTA的混合制剂，同时
也是保持尿激酶、蚓激酶和鼠妇纤溶酶最大稳定性
的前提下让胃蛋白酶和胰蛋白酶有效失活的最优失
活方案。
稳定性试验：取同样以上缓冲液（蚓激酶或尿

A-胰蛋白酶 a-加 1 mmol/L EDTA和 25 mg/mL TLCK失活的胰蛋白酶
B-尿激酶 b-加 1 mmol/L EDTA和 25 mg/mL TLCK失活的尿激酶 C-
蚓激酶 c-加 1 mmol/L EDTA和 25 mg/mL TLCK失活的蚓激酶 D-鼠
妇纤溶酶 d-加 1 mmol/L EDTA和 25 mg/mL TLCK失活的鼠妇纤溶酶
A-trypsin a-trypsin deactivation by 1 mmol/L EDTA and 25 mg/mL TLCK
B-Urokinase b-urokinase deactivation by 1 mmol/L EDTA and 25 mg/mL
TLCK C-lumbrokinase c-lumbrokinase deactivation by 1 mmol/L EDTA
and 25 mg/mL TLCK D-porcellio plasmin d-porcellio plasmin
deactivation by 1 mmol/L EDTA and 25 mg/mL TLCK

图 9 尿激酶、蚓激酶、鼠妇纤溶酶和胰蛋白酶在混合制剂
溶液中纤溶活性
Fig. 9 Fibrinolytic activity of urokinase, lumbrokinase,
porcellio plasmin and trypsin in mixture

表 8 尿激酶、蚓激酶、鼠妇纤溶酶和胰蛋白酶在混合制剂
溶液中相对纤溶活性 ( x±s, n = 5)
Table 8 Relative fibrinolytic activity of urokinase,
lumbrokinase, porcellio plasmin and trypsin in mixed
preparation ( x±s, n = 5)
试剂
剩余酶相对纤溶活性/%
尿激酶 蚓激酶 鼠妇纤溶酶 胰蛋白酶
对照 100.01±0.23 100.03±0.08 100.04±0.21 100.01±0.17
混合制剂 96.35±0.29 95.23±0.18 95.68±0.12 0.00±0.01
激酶或鼠妇纤溶酶或胰蛋白酶液-混合制剂液 1∶
10），精密吸取 10 μL，分别于 0、2、6、9、14、18、
24 h点样于纤维蛋白平板的孔中，按“2.1.1”项方
法计算出剩余酶相对活性。结果显示剩余酶相对活
性 RSD＜1.2%，表明以上缓冲液 24 h内稳定。
重复性试验：取同样以上缓冲液（蚓激酶或尿
激酶或鼠妇纤溶酶或胰蛋白酶液-混合制剂液 1∶
10）5 份，按“2.1.1”项方法计算出剩余酶相对活
性。结果显示剩余酶相对活性 RSD＜1.2%，表明该
方法重复性好。
3 讨论
本实验主要研究 pH 值、温度、金属离子、酶
抑制剂和表面活性剂对模拟胃肠环境中胃蛋白酶和
胰蛋白酶纤溶活性的影响，并且得到了使胃蛋白酶
和胰蛋白酶纤溶活性可以有效失活的较佳酶失活工
艺。酶是一类蛋白质的大分子物质，容易受到各种
物理的、化学的因素变性而失活。酶较其他化学催
化剂更为脆弱，更容易失去活性。文献报道[16-20]，
影响酶纤溶活性的因素主要是 pH 值、温度、金属
离子、酶抑制剂和表面活性剂等，本实验在相关文
献研究的基础上，探讨了单因素对酶纤溶活性的影
响。大多数酶在温度达到 60 ℃以上就发生变性[20]，
但本实验结果提示胃蛋白酶在高于 70 ℃的环境中
活性依旧存在，推测有可能是W液中的胃蛋白酶在
较高温度下发生水解产生了具有纤溶活性的小分子
肽，这有待实验进行验证。
目前市场上常用的溶栓药物如尿激酶、蚓激酶
等，临床上应用主要是注射给药或静脉滴注，但效
果并不理想，为给尿激酶和蚓激酶口服给药提供一
种可能，本实验分别研究了较佳的酶失活工艺对尿
激酶、蚓激酶和鼠妇纤溶酶的纤溶活性的影响。试
图得出最优失活方案，即在保持鼠妇纤溶酶最大稳
定性的前提下让胃蛋白酶和胰蛋白酶有效失活。以
通过模拟胃肠环境对鼠妇活性粗蛋白进行酶解，以
获取相对分子质量更小、效价更高的蛋白质或多肽。
最终实验中失活的比例选择的是体积比 1∶
10，即 W液或 Y 液-失活剂的缓冲液 1∶10。由于
在前期的预试验中考察了 1∶1、1∶2、1∶5、1∶
10，在达到 1∶10时才可以完全失活。并且在纤维
蛋白平板上点样时，为了保持失活前后W液（Y液）
中的胃蛋白酶（胰蛋白酶）的浓度一致，用于失活
前对照的胃蛋白酶（胰蛋白酶）的浓度同样也稀释
了 11倍。
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 1期 2016年 1月

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综上所述，本实验初步探究了影响胃蛋白酶和
胰蛋白酶纤溶活性因素，并较系统地研究了胃蛋白
酶和胰蛋白酶纤溶活性的有效失活方法。
参考文献
[1] 韩雅莉, 李张伟. 地鳖虫纤溶成分的分离纯化和活性
测定 [J]. 中药材, 2006, 29(8): 765-767.
[2] 许文博, 王玉蓉, 黄能听. 全蝎胃蛋白酶酶解混合多肽
体外抗凝活性研究及其组成分析 [J]. 北京中医药大学
学报, 2010, 33(2): 127-129.
[3] Qing Q B, Jin X C, Yi L F, et al. Purification and
characterization of a new serine protease with fibrinolytic
activity from the Marine Invertebrate, Urechis unicinctus
[J]. Appl Biochem Biotechnol, 2013, 170(3): 525-540.
[4] 张豁中, 温玉麟. 动物活性成分化学 [M]. 天津: 天津
科学技术出版社, 1995.
[5] 王贤纯. 蜈蚣的药用研究进展 [J]. 动物学杂志, 2002,
37(3): 88-91.
[6] 王继红. 全蝎抗癌的研究进展 [J]. 现代中西医结合杂
志, 2003, 12(15): 1662-1663.
[7] 刘玉清, 洪 澜, 吴宏美, 等. 全蝎治疗恶性肿瘤的临
床研究 [J]. 热带医学杂志, 2003, 3(4): 484-488.
[8] Wang B J, Won S J, Yu Z R, et al. Free radical scavenging
and apoptotic effects of Cordyceps sinensis fractioned by
supercritical carbon dioxide [J]. Food Chem Toxicol,
2005, 43(4): 543-552.
[9] Wang F, Wang C, Li M, et al. Purification
characterization and crystallization of a group of
earthworm fibrinolytic enzymes from Eisenia foetida [J].
Biotechnol Lett, 2003, 25: 1105-1109.
[10] Zhao R, Ji J G, Tong Y P, et al. Isolation and Identification
of proteins with anti-tumor and fibrinolysogen kinase
activities from Eisenia foetida [J]. Acta Bioch Bioph Sin,
2002, 34(5): 576-582.
[11] Tian Z, Li B, Guo L W, et al. Purification and
biochemical characterization of a novel fibrinolytic
enzyme, PSLTro01, from a medicinal animal Porcellio
scaber Latreille [J]. Int J Biol Macromol, 2015, 80:
536-546.
[12] 童耕雷. 实用生物化学与分子生物学词典 [M]. 北京:
科学出版社, 2003.
[13] Rawlings N D, Barrett A J. Families of serine peptidases
[J]. Methods Enzymol, 1994, 244: 19-61.
[14] Mann M, Hendrickson R C, Pandey A. Analysis of
proteins and proteomes by mass spectrometry [J]. Annu
Rev Biochem, 2001, 70: 437-473.
[15] Uesugi Y, Usuki H, Iwabuchi M, et al. Highly potent
fibrinolytic serine protease from Streptomyces [J].
Enzyme Microb Technol, 2011, 48(1): 7-12.
[16] Hellebrekers B W J, Trimbos-Kemper T C M, Trimbos J
B M Z, et al. Use of fibrinolytic agents in the prevention
of postoperative adhesion formation [J]. Fertil Steril,
2000, 74(2): 203-212.
[17] Ktari N, Ben-Khaled H, Nasri R, et al. Trypsin from zebra
blenny (Salaria basilisca) viscera: Purification,
characterisation and potential application as a detergent
additive [J]. Food Chem, 2012, 130(3): 467-474.
[18] Ana G V, Juan C R, Elisa M V, et al. Trypsin from viscera
of vermiculated sailfin catfish, Pterygoplichthys
disjunctivus, Weber, 1991: Its purification and
characterization [J]. Food Chem, 2013, 141(2): 940-945.
[19] Khangembam B K, Chakrabarti R. Trypsin from the
digestive system of carp Cirrhinus mrigala: Purification,
characterization and its potential application [J]. Food
Chem, 2015, 175: 386-394.
[20] Klomklao S, Kishimura H, Yabe M, et al. Purification and
characterization of two pepsins from the stomach of
pectoral rattail (Coryphaenoides pectoralis) [J]. Compd
Biochem Physiol Part B: Biochem Mol Biol, 2007,
147(4): 682-689.
[21] Meridor D, Gedanken A. Enhanced activity of
immobilized pepsin nanoparticles coated on solid
substrates compared to free pepsin [J]. Enzyme Microb
Technol, 2014, 67: 67-76.
[22] 中国药典 [S]. 一部. 2010.
[23] Astrup T, Müllertz S. The fibrin plate method for
estimating fibrinolytic activity [J]. Arch Biochem
Biophys, 1952, 40(2): 346-351.