全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 6 期 2015 年 3 月

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高效液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱分析雪峰虫草化学成分
张水寒 1, 2，蔡 萍 1, 2，陈 林 1, 2，梁雪娟 1, 2，秦 优 1，朱如彩 1，黄惠勇 1, 2*
1. 湖南省中医药研究院中药研究所，湖南 长沙 410013
2. 湖南省 2011 数字中医药协同创新中心，湖南 长沙 410013
摘 要：目的 采用高效液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱法（HPLC-Q-TOF-MS/MS）对雪峰虫草醇提取物的主要化学成
分进行分析鉴定。方法 超声法制备雪峰虫草醇提取物，月旭 AQ-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）反相 HPLC 梯度洗脱法分
离各主要成分；电喷雾电离源正离子模式和负离子模式对色谱流出物进行检测，四级杆飞行时间串联质谱法对各主要色谱峰
进行归属。结果 通过二级高分辨质谱分析结合对照品数据及相关文献，共鉴定 28 个化合物的结构，其主要化学成分为甘
露醇、腺苷、麦角甾醇、谷甾醇、氨基酸、脂肪酸、糖类等成分。结论 HPLC-Q-TOF-MS/MS 可从保留时间、紫外吸收光
谱、精确相对分子质量、分子式和二级结构碎片等方面对雪峰虫草的主要成分进行定性分析，为寻找虫草中活性物质提供一
种快速准确的分析方法。
关键词：雪峰虫草；高效液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱；定性分析；腺苷；麦角甾醇；氨基酸
中图分类号：R284.1 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2015)06 - 0817 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2015.06.007
Identification of chemical constituents in Ophiocordyceps xuefengensis sp. nov.
by HPLC-Q-TOF-MS/MS
ZHANG Shui-han1, 2, CAI Ping1, 2, CHEN Lin1, 2, LIANG Xue-juan1, 2, QIN You1, ZHU Ru-cai1, HUANG
Hui-yong1, 2
1. Institute of Chinese Materia Medica, Hunan Academy of Traditional Chinese Medicine, Changsha 410013, China
2. 2011 Collaboration and Innovation Center for Digital Chinese Medicine in Hunan, Changsha 410013, China
Abstract: Objective Using the HPLC-Q-TOF-MS/MS to analyze and identify the main components in the ethanol extract of
Ophiocordyceps xuefengensis sp. nov. Methods The ethanol extract of O. xuefengensis sp. nov. was preparaed by using the ultrasonic
methods, the main components in the extracts were separated by using the gradient elution method with RP-HPLC, Yuexu AQ-C18
column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm); The positive and negative electro spray ionization (ESI) source was used for determine the
chromatographic effluent, the main chromatographic peaks are assigned by Q-TOF. Results Based on the standards of MS/MS and
compared with the reference results, 28 compounds, containing mannitol, adenosine, ergosterol, sitosterol, amino acid, fatty acid, and
sugar, were identified. Conclusion HPLC-ESI-TOF-MS/MS method can qualitatively analyze the main components in O.
xuefengensis sp. nov. from the retention time, UV spectrum, precious relative molecular weight, formula, secondary fragment ions, and
so on. It is an effective and fast analysis method for determining the active compounds in O. xuefengensis sp. nov.
Key words: Ophiocordyceps xuefengensis sp. nov.; HPLC-Q-TOF-MS/MS; qualitative analysis; adenosine; ergosterol; amino acid

虫草属真菌为子囊菌纲麦角菌目麦角菌科的一
类大型药用真菌，全世界已报道的虫草属品种多达
500 种以上，而我国已报道的虫草属品种约有 120
种[1]。雪峰虫草是一种生长在海拔 300～1 000 m 的
活体植物马鞭草科大青的近地面根髓或茎髓中的一
种真菌，为麦角菌科线虫草菌属的一个新种，是目
前全世界报道的最大的虫草[2]。经采用真菌分类学、
分子生物学鉴定发现，雪峰虫草与冬虫夏草的亲缘
关系很近[2]。雪峰虫草早期主要在湖南省洞口县瑶
族民间使用，后来被广泛流传并用来防病治病，具

收稿日期：2014-12-15
基金项目：湖南省科技厅重大专项（2014FJ1007）
作者简介：张水寒，女，研究员，药学博士，博士生导师，研究方向为中药资源中药制剂及质量标准研究。
Tel: (0731)88881651 E-mail: zhangshuihan0220@126.com
*通信作者 黄惠勇，男，教授，博士生导师，研究方向为中医药基础研究。E-mail: hntcmakj@163.com
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有补肺益肾、止咳化痰的功效，主治肾虚精亏、阳
痿遗精、腰膝酸痛、久咳虚喘等症效果显著。然而
雪峰虫草的化学成分及药效作用的物质基础尚不明
确，因此对于雪峰虫草化学成分的研究工作十分重
要。本研究首次采用高效液相色谱-四级杆-飞行时
间串联质谱法（HPLC-Q-TOF-MS）分析雪峰虫草
主要化学成分，采用电喷雾电离源正离子模式和负
离子模式对色谱流出物进行检测，通过高分辨质谱
分析结合对照品数据及相关文献共鉴定 28 个化合
物，其主要成分为甘露醇、腺苷、麦角甾醇、谷甾
醇、氨基酸、脂肪酸、糖类等。为雪峰虫草的药效
物质基础和质量评价提供了快捷、有效的检测方法。
1 仪器与材料
KQ5200DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声
仪器有限公司），1200 Series 型高效液相色谱系统
（安捷伦科技公司），配四元泵及在线脱气，紫外检
测器。6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS/MS（安捷
伦科技公司）。
乙腈、甲醇色谱纯（德国 Merck 公司）；甲酸
色谱纯，美国 Tedia 公司）；水为纯净水（潍坊娃哈
哈饮料有限公司），其余试剂为分析纯。麦角甾醇（批
号 869-200202）和 β-谷甾醇（批号 110851- 201407）
均购自中国食品药品检定研究院。
本实验所采用的雪峰虫草均采自湖南省洞口
县，批号 20120426，经贵州大学西南药用生物资源
教育部工程研究中心文庭池教授和湖南省中医药研
究 院 朱 如 彩 研 究 员 共 同 鉴 定 为 雪 峰 虫 草
Ophiocordyceps xuefengensis sp. nov.。
2 实验方法
2.1 色谱条件
月旭 AQ-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），
流动相甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B）。使用前超
声脱气，用 0.22 μm 微孔滤膜滤过；梯度洗脱程序：
0～15 min，2% A；15～30 min，2%～5% A；30～
48 min，5%～65% A；48～68 min，65%～100% A；
68～83 min，100% A；柱温为 30 ℃，体积流量 1.0
mL/min，进样量 10 μL。检测波长 260 nm。
2.2 质谱检测条件
离子化方式：电喷雾离子化（ESI）；干燥气温
度 325 ℃；干燥气体积流量为 6.8 L/min；鞘气温度
350 ℃；毛细管电压 4.0 kV；碎片电压 130 V。
2.3 对照品溶液的制备
分别精密称取 β-谷甾醇和麦角甾醇对照品 0.1
和 0.5 mg 于 5 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，4
℃冷藏备用，进样前 0.45 μm 微孔滤膜滤过。
2.4 样品前处理
取雪峰虫草适量，低温（40 ℃）烘干至恒定质
量，粉碎，过 60 目筛。精确称取 0.5 g 样品于具塞
锥形瓶中，加入 80%甲醇 10 mL，超声 40 min，再
用 80%甲醇补足减失的质量。进样前用 0.45 μm 微
孔滤膜滤过。
3 结果与分析
在拟定分析条件下，雪峰虫草醇提取物在正、
负离子模式下，全扫描总离子流图见图 1。同时对
正、负离子模式下，一、二级质谱图进行分析，根
据其反相色谱保留行为、紫外检测和质谱特征，结
合文献数据进行结构鉴定，共确定 28 个化学成分
（表 1），结构类型可分为 5 类。

图 1 雪峰虫草 HPLC-Q-TOF/MS 正离子 (A) 和负离子
(B) 模式总离子流图
Fig. 1 HPLC-Q-TOF/MS total ion chromatogram of positive
ion (A) and negative ion (B) of O. xuefengensis sp. nov.
3.1 甾醇类化合物
在“2.1”和“2.2”项条件下检测 β-谷甾醇和
麦角甾醇 2 种对照品发现，它们在 ESI 离子源中很
难电离。实验通过对照品在反相色谱柱上的保留特
征对这 2 种物质进行定性。其保留时间分别为
64.821 min 和 76.605 min，见图 2。
3.2 糖类化合物
普通虫草中通常存在大量的 D-甘露醇，从雪峰
虫草中鉴定出 D-甘露醇和蔗糖 2 种糖类化合物。保
留时间为 3.504 min 获得 m/z 181.072 3 [M－H]− 质
谱信号，根据数据库搜索得到分子式为 C6H14O6，
根据文献报道[3]，D-甘露醇相对分子质量为 182，推
测为其分子离子峰。对 m/z 181.072 3 进行 MS2分析
得到它的二级碎片离子为 m/z 163.059 9、101.024 3、
89.024 7，可能的断裂方式见图 3。
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 76 80 84
t/min
ESI+
ESI
−

A
B
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表 1 雪峰虫草 HPLC-Q-TOF-MS 分析结果
Table 1 Analysis results for O. xuefengensis sp. nov. by HPLC-Q-TOF-MS
质荷比（m/z）
tR/min 离子峰归属
实测值 理论值
二级碎片离子 偏差 分子式 化合物
2.478 [M＋H]＋ 147.112 0 147.112 8 130.086 4,101.070 9, 84.080 9 5.44 C6H14N2O2 赖氨酸
2.620 [M＋H]＋ 175.118 8 175.119 0 158.091 8, 130.093 2, 116.069 9,
84.081 1
1.14 C6H14N4O2 精氨酸
2.754 [M－H]－ 154.061 4 154.062 2 137.036 2, 93.046 1 5.19 C6H9N3O2 组氨酸
3.117 [M－H]－ 118.050 6 118.051 0 100.039 0, 74.025 8 3.39 C4H9NO3 苏氨酸
3.175 [M－H]－ 132.029 9 132.030 2 115.003 4, 88.040 8, 70.014 5 3.03 C4H7NO4 天门冬氨酸
3.346 [M＋H]＋ 118.085 8 118.086 3 102.053 4, 74.060 8, 59.073 6 4.23 C5H11NO2 缬氨酸
3.487 [M＋H]＋ 148.059 8 148.060 4 130.049 3, 102.054 8, 84.044 8 4.05 C5H9NO4 谷氨酸
3.504 [M－H]－ 181.072 3 181.071 8 163.059 9, 101.024 3, 89.024 7 2.76 C6H14O6 甘露醇
3.584 [M－H]－ 114.055 9 114.056 1 85.027 7, 68.996 0 1.56 C5H9NO2 脯氨酸
3.768 [M＋COOH]－ 387.114 7 387.114 4 285.116 4, 119.028 6 0.77 C12H22O11 蔗糖
4.805 [M＋H]＋ 136.061 1 136.061 8 119.035 0 5.14 C5H5N5 腺嘌呤
5.541 [M＋H]＋ 152.056 2 152.056 7 135.029 4, 110.034 6 3.29 C5H5N5O 鸟嘌呤
5.906 [M－H]－ 111.019 7 111.020 0 41.999 3 2.70 C4H4N2O2 尿嘧啶
6.689 [M＋H]＋ 132.101 3 132.101 9 86.096 6, 55.055 1 4.54 C6H13NO2 亮氨酸
9.366 [M－H]－ 180.066 4 180.066 6 163.038 0,119.048 6 1.11 C9H11NO3 酪氨酸
9.399 [M－H]－ 135.030 9 135.031 2 92.025 0, 65.014 6 2.20 C5H4N4O 次黄嘌呤
11.276 [M＋H]＋ 153.040 2 153.040 7 136.013 5, 110.034 8 3.27 C5H4N4O2 黄嘌呤
12.243 [M－H]－ 243.062 2 243.062 3 110.021 5, 41.998 6 0.42 C9H12N2O6 尿苷
18.647 [M＋H]＋ 166.085 3 166.086 3 149.059 6, 131.049 1, 120.080 1 6.02 C9H11NO2 苯丙氨酸
18.805 [M＋H]＋ 268.102 9 268.104 0 136.061 1 4.10 C10H13N5O4 腺苷
22.983 [M＋H]＋ 252.107 6 252.109 1 136.061 3 5.95 C10H13N5O3 虫草素
64.593 [M－H]－ 315.253 7 315.254 1 / 1.27 C18H36O4 9,10-二羟基硬脂酸
69.626 [M－H]－ 277.216 8 277.217 3 163.112 6, 96.956 7, 79.957 6 1.80 C18H30O2 亚麻酸
70.480 [M－H]－ 279.232 3 279.233 0 228.203 3, 44.999 3 2.51 C18H32O2 亚油酸
71.272 [M－H]－ 255.232 5 255.233 0 / 1.96 C16H32O2 棕榈酸
73.562 [M－H]－ 283.263 3 283.264 3 / 3.50 C18H36O2 硬脂酸


1-β-谷甾醇 2-麦角甾醇
1-β-sitosterol 2-ergosterol
图 2 对照品 (A) 和雪峰虫草 (B) 的 RP-HPLC 色谱图
Fig. 2 RP-HPLC of reference substances (A) and O.
xuefengensis sp. nov. (B)

OH
OH
OH
OH
OH
OH
HO
OH
O
OH
OH
OHO
OH
OH
m/z163
H2O
H- H
-
O
H-
m/z 89
甘露醇
HO
OH
OH
OH
OH
OH
H2O HO
OH
OH
OHO
HO
OH
OH
m/z 101
H- H-
O
O
H- H- m/z 163
m/z 59
图 3 甘露醇的 MS2裂解途径
Fig. 3 MS2 fragmentation pathway of mannitol
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 76 80
t/min
A
B
1
2
1 2
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保留时间 3.768 min 获得 m/z 387.114 7 [M＋
COOH]−质谱信号，根据数据库搜索得到分子式为
C12H22O11，根据文献报道[4]推测该化合物为蔗糖。
3.3 核苷类化合物
虫草中常见的物质有腺苷等核苷类物质，实验
从雪峰虫草中鉴定 8 种核苷类化合物，分别为腺苷、
虫草素、腺嘌呤、黄嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、尿
苷和尿嘧啶。在正离子模式下，保留时间为 18.805
和 22.983 min 分别获得m/z 268.102 9 和m/z 252.107 6
[M＋H]+ 的质谱信号，二级质谱两者均出现 m/z
136，根据数据库搜索得到分子式为 C10H13N5O4 和
C10H13N5O3，推测该化合物为腺苷和虫草素，二级
碎片离子为两者丢失糖苷元。保留时间为 4.805、
5.541 和 11.276 min，分别获得 m/z 136.061 1、m/z
152.056 2 和 m/z 153.040 2 的 [M＋H]+质谱信号，
根据数据库搜索得到分子式为 C5H5N5、C5H5N5O 和
C5H4N4O2，二级质谱均出现了[M＋H－NH3]+，根据
文献报道[5]，推测其分别为腺嘌呤、鸟嘌呤和黄嘌呤。
对 m/z 152.056 2 的信号进行 MS2分析，得到的二级
碎片离子为 m/z 135.029 4, 110.034 6，可能的断裂方式
见图 4。
在负离子模式下，保留时间为 5.906 和 12.243
min 分别获得 m/z111.0197 和 m/z243.0622 的 [M－
H]−质谱信号，根据数据库搜索得到分子式为
C4H4N2O2 和 C9H12N2O6。推测其为尿嘧啶和尿苷的
分子离子峰，二级质谱均出现 m/z 42 碎片离子，根
据文献报道[6]该碎片离子的断裂可能途径见图 4。
保留时间为 9.399 min 得到 m/z135.030 9 [M－H]−，
根据数据库搜索得到分子式为 C5H4N4O，推测为次
开环
H+
C
CN
HC
N
H
C
O
N
C
NH2
NH2
+
-NH3
C
CN
HC
N
C
O
N
C
NH2+
C
CN
HC
N
H
C
O
NH2+
-NHCNH
m/z 135 m/z 110
鸟嘌呤
N
NHN
N
H
O
NH2

尿嘧啶
开环
N
H
NH
O
O
N
H
NH-
O
O m/z 42
-N C O

图 4 鸟嘌呤和尿嘧啶的 MS2裂解途径
Fig. 4 MS2 fragmentation pathway of guanine and uracil
黄嘌呤分子离子峰。对 m/z135.030 9 信号进行 MS2
分析得到它的二级碎片离子为 m/z 92.025 0、65.014 6，
其可能的断裂途径是次黄嘌呤开环失去中性分子
HNCHNH 和 CO。
3.4 氨基酸类化合物
虫草中富含人体必需氨基酸[7]，氨基酸是一类含
有若干个氨基和若干个羧基组成的小分子化合物。
通过一、二级质谱数据及文献报道[8]，实验在正、负
离子模式下共鉴定出 11 种氨基酸，分别为组氨酸、
天门冬氨酸、赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、谷氨酸、
亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、苏氨酸和精氨酸。
在正离子模式下，保留时间分别为 2.478、
2.620、3.346、3.487、6.689 和 18.647 min 得到的质
谱信号分别为 m/z 147.112 0 [M＋H]+、175.119 0
[M＋H]+、118.085 8 [M＋H]+、148.059 8 [M＋H]+、
132.101 3 [M＋H]+ 和 166.085 3 [M＋H]+；二级质谱
均出现了 [M＋H－NH3]+ 和 [M＋H-HCOOH]+ 的
碎片峰，根据文献报道[9]，在正离子模式下大多数
氨基酸失去 NH3 和 HCOOH。经数据库搜索得到分
子式分别为 C6H14N2O2、C6H14N4O2、C5H11NO2、
C5H9NO4、C6H13NO2、C9H11NO2，推测这些化合物
分别为赖氨酸、精氨酸、缬氨酸、谷氨酸、亮氨酸
和苯丙氨酸。
在负离子模式下，保留时间分别为 2.754、
3.117、3.175、3.584 和 9.366 min 得到的质谱信号
分别为 m/z 154.061 4 [M－H]−、118.050 6 [M－H]−、
132.029 9 [M－H]−、114.055 9 [M－H]−和 180.066 4
[M－H]−，二级质谱均出现了 [M－H－NH3]− 和
[M－H－CO2]− 的碎片峰，可能是由氨基酸失去
NH3 和 CO2，根据数据库搜索得到分子式分别为
C6H9N3O2 、 C4H9NO3 、 C4H7NO4 、 C5H9NO2 和
C9H11NO3，推测这些化合物分别为组氨酸、苏氨酸、
天门冬氨酸、脯氨酸和酪氨酸。
3.5 其他化合物
根据 MUSSHUNTER 软件以及中草药数据库，
参考文献的研究结果，本实验还从雪峰虫草的醇提
取物中鉴定出了一些其他化合物，其结构可能是棕
榈酸[4]、硬脂酸[10]、亚麻酸[11]、亚油酸[11]和 9,10-
二羟基硬脂酸[12]。
4 讨论
4.1 液相分离条件优化
选择了迪马 C18 柱、氨基柱、月旭 AQ-C18 柱 3
种色谱柱，经实验发现，迪马 C18 柱适合分离极性
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化合物，但弱极性化合物很难被洗脱下来；氨基柱
可以很好地分离氨基酸类化合物，而其他物质很难
分离检测到；在月旭 AQ-C18 柱中雪峰虫草醇提取
物能最大限度地分离，这有利于质谱定性分析。雪
蜂虫草样品前处理选择 50%、80%、100%甲醇及水，
以 80%甲醇作为提取液得到峰数及峰型最好。流动
相考察了甲醇-水、甲醇-水（0.1%甲酸），在纯水作
为流动相的情况下，样品中极性化合物分离效果较
好，但是部分峰有拖尾现象；甲醇-水（0.1%甲酸）
作为流动相时，峰形得到一定改善，在进行质谱检
测时，加入甲酸可提高样品中各化合物离子化效率。
4.2 质谱条件优化
采用正、负离子模式同时扫描样品，发现正离
子模式条件下，总离子流色谱峰较多，峰信息量大。
但有些物质在负离子模式响应较好，实验选用 2 种
模式同时测定样品，最大程度地获取质谱信息。
雪峰虫草属于虫草类的新物种，研究其化学成
分具有重要意义。本实验采用HPLC-Q-TOF-MS/MS
联用技术，首次对雪峰虫草中化学成分进行快速鉴
定，通过获得色谱峰分子离子，对雪峰虫草醇提取
物的主要化学成分进行分析鉴定，再通过二级碎片
离子对其加以确认。共推测鉴定出 28 个化合物，为
这一新物种药效作用的物质基础提供参考依据。从
样品总离子流图可以看出，有一些响应较好的色谱
峰其质量数未能在已有数据库中找到，证明雪峰虫
草中还有一些未知成分，有待进一步研究开发。
参考文献
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[2] Wen T C, Zhu R C, Kang J C, et al. Ophiocordyceps
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(Hepialidae) in Hunan Province, southern China [J].
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[3] 张 虹, 吴雪美, 高效液相色谱-质谱联用法分析冬虫
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