全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 11期 2016年 6月

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• 药理与临床 •
马兜铃酸 I致大鼠肾损伤后血清 miRNA差异表达的研究
张 良 1, 2，杨召聪 1, 2，顾亚琴 1, 2，钱知知 1, 2，许 立 1, 2
1. 南京中医药大学药学院，江苏 南京 210023
2. 江苏省中药药效与安全性评价重点实验室，江苏 南京 210023
摘 要：目的 筛选马兜铃酸 I（AAI）致大鼠肾损伤后血清中差异表达的微小 RNA（micro RNA，miRNAs），为阐明 miRNAs
调控马兜铃酸肾病的机制研究提供靶标并奠定研究基础。方法 SD 雄性大鼠随机分为对照组及 AAI（2.25 mg/kg）组，连
续 ip给药 14 d造成肾损伤模型后，对大鼠肾脏进行 HE染色观察肾损伤程度。利用 miRNAs芯片技术寻找 AAI组及对照组
大鼠血清中差异表达的 miRNAs，预测靶基因，采用实时定量 PCR（qRT-PCR）验证芯片结果的可靠性，并对部分结果进行
信号通路分析。结果 HE染色显示AAI组大鼠肾脏出现不同程度的病变；miRNAs芯片结果显示有5个miRNAs（miR-10a-3p、
miR-207、miR-3594-3p、miR-874-3p、miR-9a-3p）表达明显上调，无明显下调的 miRNAs，并预测 Rhebl1、Usp10等 16种
基因为差异表达的 miRNAs靶基因；qRT-PCR验证结果与芯片结果基本一致；信号通路分析结果显示MAPK信号通路等相
关性较大。结论 芯片分析得到的差异表达的 miRNAs可能与 AAI致肾毒性机制相关，为进一步深入研究特定 miRNAs的
调控机制提供新的靶点，并为后期生物信息学层次的研究提供有效依据。
关键词：马兜铃酸 I；肾损伤；微小 RNA；靶基因；表达差异；马兜铃酸肾病
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2016)11 - 1903 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.11.015
Study on differential expression of miRNA in serum of rats after renal injury
induced by aristolochic acid I
ZHANG Liang1, 2, YANG Zhao-cong1, 2, GU Ya-qin1, 2, QIAN Zhi-zhi1, 2, XU Li1, 2
1. School of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China
2. Jiangsu Key Laboratory for Pharmacology and Safety Evaluation of Chinese Materia Medica, Nanjing 210023, China
Abstract: Objective To screen the miRNA differential expression profile in serum of rats after renal injury induced by aristolochic
acid I, (AAI) to identify the target of miRNA in the mechanism of aristolochic acid nephropathy (AAN), and to make further study on
the mechanism of AAN. Methods Eighteen male SD rats were randomly divided into two groups, control group and AAI group (2.25
mg/kg). Rats were ip injected with AAI once daily for 14 d. On day 14, blood collected was used for the determination of miRNA in
serum by miRNA microarray; Renal pathological changes were examined by HE staining. The miRNA that expressed significantly
different would be verified by real time quantitative PCR (qPT-PCR). Target genes were predicted using bioinformatics as well as
Pathway analysis did. Results HE staining revealed that kidneys were damaged with different degrees. By significance analysis of
microarray based on microarray screening, significantly different expression of five miRNA (miR-10a-3p, miR-207, miR-3594-3p,
miR-874-3p, and miR-9a-3p) which were up-regulated were obtained, while there were no miRNAs which were down-regulated.
qPT-PCR approved the results as well. It was suggested that 16 genes, such as Rhebl1 and Usp10, might be the target genes. Pathway
analysis showed a greater correlation between MAPK signaling pathways. Conclusion The differential expressed miRNAs obtained
by gene analysis might be related with AAI and further studies on the mechanism of some miRNA would be a new target of gene
therapy and provide an effective basis for the further studies of bioinformatics.
Key words: aristolochic acid I; renal injury; miRNA; target gene; differential expression; aristolochic acid nephropathy


收稿日期：2016-01-22
基金项目：国家自然科学青年基金资助项目（30701106）；江苏省科技厅自然科学基金面上项目（BK2012852）；江苏省高校优势学科建设工程
资助项目（2011XYZ4-003）
作者简介：张 良，男，博士，副教授，硕士生导师，研究方向为中药毒理学。E-mail: zhangl_1999@163.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 11期 2016年 6月

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马兜铃酸 I（aristolochic acid I，AAI）是马兜铃
酸（aristolochic acid，AA）的主要毒性成分，长期
服用含此类物质的中药可导致马兜铃酸肾病
（aristolochic acid nephropathy，AAN）的发生[1-2]，很
多国家现已采取相应政策来管理含此类成分的中
药，但仍有部分群体不恰当的服用含 AA的中药，
AAN 病例还时有发生，阐明 AAI 致肾毒性的发病
机制仍具有重要意义。
Micro RNAs（miRNAs）是一类在生物体内广
泛存在的长度约 22 nt的小分子非编码 RNA，它可
以通过与靶基因 mRNA的靶位点结合，抑制蛋白的
合成或诱导该基因 mRNA的降解，从而参与基因的
表达调控[3]。目前 miRNAs功能涉及到生物体的干
细胞分化、分子免疫机制、细胞内信号转导、肿瘤
发生及各种疾病和病毒感染等[4-6]。已有研究显示，
miRNAs 与 AA 的基因毒性[7]、肾近曲小管上皮细
胞的周期阻滞[8]等过程密切相关。本课题组前期研
究发现大鼠给予 AAI 2.25 mg/kg剂量条件下，肾脏
就已出现明显的病变[9]。本研究将采用 miRNAs芯
片法筛选出 AAI 致大鼠肾损伤后血清中表达明显
发生变化的 miRNAs，并预测相关靶基因，对部分
miRNAs进行信号通路分析，从分子水平探讨 AAN
的发病机制。
1 材料
1.1 动物
8周龄 SD大鼠 18只，清洁级，体质量 220～
250 g。合格证号 SCXK（浙）2008-0033，购自浙
江省实验动物中心。分笼饲养，周围环境通风，温
度 22～25 ℃、湿度 50%～60%，动物实验操作严
格按照《江苏省实验动物管理办法》规定执行。
1.2 药品与试剂
AAI（质量分数≥98%，批号 20130201），河南
省科技医药研究所；Trizol 试剂（美国 Life
Technologies公司）；氯仿（成都科龙化工试剂厂）；
异丙醇（南京化学试剂有限公司）；DEPC水（上海
碧云天生物技术研究所）；逆转录试剂盒（上海生
工生物工程有限公司）；PolyAcryl Carrier（美国
MRC公司）；Quanti Fast SYBR Green PCR kit（德
国 Qiagen公司）；所有引物由上海生工生物工程有
限公司提供。
1.3 主要仪器
荧光定量 PCR 仪（美国 Bio-rad 公司）；梯度
PCR仪（美国 Applied Biosysterms公司）；多功能
酶标仪（美国 BioTek 公司）；低温离心机（德国
Eppendorf）；石蜡包埋机（日本樱花 Tissue-TEK）；
切片机（美国 Thermo公司）。
2 方法
2.1 肾损伤模型的制备
18 只大鼠随机分为对照组（10%二甲基亚砜＋
20%聚乙二醇 600＋70%生理盐水）和AAI组（2.25
mg/kg）[10]。大鼠于笼中适应性喂养 3 d，自由进水，
连续 ip给药 14 d，末次给药后禁食不禁水 12 h，颈
总动脉取全血 6 mL，3 000 r/min离心后取血清，冻
存备用；处死大鼠，迅速摘除肾脏，用 PBS漂洗后，
一侧肾脏放入 10%甲醛中固定，用于病理检查分析，
另一侧肾脏于液氮中保存，用于其他检测。
2.2 病理组织固定、切片及 HE染色
取肾组织，切成小块浸泡在 4%中性甲醛溶液
中 3 d；用蒸馏水洗涤组织块后放入 70%乙醇中过
夜；经脱水、透明、石蜡包埋、切片后，用多聚赖
氨酸封片于玻璃载玻片上，进行苏木素伊红（HE）
染色，光镜下观察 AAI对大鼠肾组织损伤的情况。
2.3 总 RNA的提取和芯片检测
对照组及AAI组各随机取3例样本的大鼠血清，
采用 Trizol法提取总 RNA，其样本采用琼脂糖凝胶
电泳进行质控分析，分光光度法进行定量分析。分
离出的 miRNAs，基于 μParaflorTM微流体 miRNAs
检测探针进行实验。取 RNA样品 5～8 μg，进行靶
标制备，在总 RNA3’端用 Poly A聚合酶加上 poly A
尾，并用于荧光标记。杂交反应在 μParaflo 微流体
芯片上过夜进行。RNA与相应探针杂交后，与标记
特异性结合的 Hy3染料在微流体芯片上循环流动进
行染色。利用激光扫描仪（Axon GenePix 4000B，
Molecular Device）采集杂交图像，并使用 GenePix
Pro 6.0图像分析软件进行图像数字化转换，并使用
LOWESS 过滤进行信号归一化。计算两种检测信号
的比值和 t检验的 P值，以 P＜0.05为差异有统计学
意义，比值＞1.5为显著表达差异。整个杂交和分析
实验由上海康成生物公司完成，合同编号H1311169。
2.4 靶基因预测
根据 microRNA 生物信息学数据库 miRBase
（http://www.mirbase.org/）、miRDB（http://mirdb.org/
miRDB/ ）、 miRanda （ http://www.microrna.org-
microrna/home.do）对 miRNAs芯片中 5个表达有明
显差异的 miRNAs进行检索，将结果导出并比对，
将 3个数据库中共有的基因作为核心靶基因。
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2.5 miRNAs的 qRT-PCR验证
miRNAs 的反转录体系为 20 μL，其中
2×miRNA RT Solution mix 10 μL，miRNA RT
Enzyme mix 2 μL，Total RNA/micro RNA 2 μg/100
ng，RNase-free water。反转录程序：37 ℃、60 min，
85 ℃、5 min，4 ℃速冷。qRT-PCR反应体系 20 μL，
其中 1 μL模板（逆转录产物），2 μL引物混合物（10
μmol/L），10 μL 2×SYBR green，7 μL水。反应条
件：95 ℃、5 min，95 ℃、30 s，60 ℃、30 s，40
个循环。以 U6为内参基因，以 2−ΔΔCt（Ct值代表循
环阈值）表示基因的表达量，部分引物序列见表 1。
表 1 用于 miRNAs real-time PCR的部分引物
Table 1 Primers used to perform real-time PCR of miRNAs
引物 引物序列 (5’→3’)
miR-10a-3p-RT CAAATTCGTATCTAGGGGAATA
miR-10a-3p-F CGCAAATTCGTATCTAGGGGAA
miR-3594-3p-RT CACACCGCCTCTGCCCGCTAGT
miR-3594-3p-F CACACCGCCTCTGCCC
miR-9a-3p-RT ATAAAGCTAGATAACCGAAAGT
miR-9a-3p-F GCGCATAAAGCTAGATAACCGA
U6-R AACGCTTCACGAATTGCGT
U6-F CTCGCTTCGGCAGCACA

2.6 部分 miRNAs的信号通路分析
根据 KEGG（Kyoto Encyclopedia of Gene and
Genomes）数据库（http://www.genome.jp/kegg/），
对芯片检测出的miRNAs靶基因进行信号通路显著
性分析。分析结果采用 Fisher精确检验和卡方检验
进行统计，P＜0.05，FDR＜0.05则认为差异具有统
计学意义。
2.7 统计分析
采用GraphPad Prism 6软件进行相关统计分析，
组间数据采用单因素方差分析，数据以 ±x s表示。
3 结果
3.1 AAI致大鼠肾损伤的病理变化
连续给药 14 d后，取大鼠肾脏进行HE染色，光
学显微镜下观察其病理改变。对照组大鼠肾脏肾小管
未见水肿，间质血管未见充血和炎细胞浸润，肾皮质
内肾小球未见充血，肾小球无硬化现象；AAI组肾脏
肾小管上皮细胞轻度水样变性，间质血管轻度充血，
偶见炎细胞浸润现象，已出现明显病变。结果见图 1。
本课题组前期研究[9]显示，2.25 mg/kg AAI连续 ip给
药 14 d后，大鼠血清中肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）
水平明显升高（P＜0.05）；结合本实验结果说明 2.25
mg/kg AAI可造成大鼠肾损伤。


对照 AAI
图 1 AAI给药 14 d后大鼠肾脏组织病理变化
Fig. 1 Pathological changes in kidney tissue of rats after 14 d
of AAI administration
3.2 miRNAs芯片检测结果
AAI 致大鼠肾损伤后，利用 miRNAs 芯片对对
照组和 AAI组大鼠血清进行检测，与对照组血清相
比，miRNAs 芯片筛选出 5 个差异表达明显上调的
miRNAs ， 分 别 是 miR-10a-3p 、 miR-207 、
miR-3594-3p、miR-874-3p、miR-9a-3p，表达变化见
图 2；此次芯片检测中无显著下调的miRNAs。
3.3 qRT-PCR验证
以 U6 为内参对芯片筛选出的差异表达的




与对照组比较：*P＜0.05 **P＜0.01，下同
*P < 0.05 **P < 0.01 vs control group, same as below
图 2 大鼠血清中差异表达显著上调的 miRNAs
Fig. 2 miRNAs with significant up-regulation of differential expression in serum of rats
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对照 AAI 对照 AAI 对照 AAI 对照 AAI 对照 AAI

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表
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表
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表
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8
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4
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0
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00


1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0



0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0



miR-10a-3p miR-207 miR-3594-3p miR-874-3p miR-9a-3p
**
*
* * *
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miRNAs 进行 qRT-PCR 验证，记录 Ct值，使用
2−ΔΔCt 法计算结果并统计，结果显示与对照组相
比，miR-10a-3p、miR-207、miR-3594-3p 表达均
明显上调，miR-874-3p、miR-9a-3p表达呈升高趋
势，如图 3所示，说明 qRT-PCR结果与 miRNAs
芯片结果基本一致，本研究的芯片结果基本真实
可靠。
3.4 靶基因预测结果
对芯片筛选出的差异表达的 5个 miRNAs，通
过 miRBase、miRDB、miRanda 3种靶基因预测数
据库预测该 5种 miRNAs的靶基因，选出在 3种数
据库中出现的基因作为潜在靶基因，结果见表 2。



图 3 各 miRNA的 qRT-PCR检测结果
Fig. 3 Determination of qRT-PCR in each miRNA
表 2 miRNAs的靶基因预测
Table 2 Target gene prediction of miRNAs
miRNA 靶基因 靶基因描述
miR-10a-3p Rhebl1 Ras homolog enriched in brain like 1
miR-10a-3p Usp10 ubiquitin specific peptidase 10
miR-207 Trim39 tripartite motif-containing 39
miR-207 Slco2b1 solute carrier organic anion transporter family, member 2b1
miR-207 Cdk9 cyclin-dependent kinase 9
miR-207 Tm2d2 TM2 domain containing 2
miR-9a-3p Mtfmt mitochondrial methionyl-tRNA formyltransferase
miR-9a-3p Itgb1 integrin, beta 1
miR-9a-3p Tcea1 transcription elongation factor A (SII) 1
miR-9a-3p Onecut1 one cut homeobox 1
miR-9a-3p Myh10 myosin, heavy chain 10, non-muscle
miR-9a-3p Stc1 stanniocalcin 1
miR-9a-3p Pfkm phosphofructokinase, muscle 1
miR-9a-3p Id4 inhibitor of DNA binding 4
miR-874-3p Slc6a18 solute carrier family 6, member 18
miR-874-3p Nr2c2 nuclear receptor subfamily 2, group C, member 2
3.5 miRNAs的信号通路分析
根据预测出的靶基因，对其进行信号通路分
析，AAI组大鼠与对照组相比较，差异 miRNAs参
与了多个信号通路的调节，富集度较高的为过氧化
物酶体（rno04146）、MAPK信号通路（rno04010）、
多巴胺能突触（rno04728）、黏蛋白型-O-多糖生物
合成（rno00512）、酮体的合成与降解（rno00072）
等途径，见图 4。
4 讨论
AA具有广泛的药理作用，具有抗感染、镇痛、
利尿、抗生育活性、抗肿瘤及调节血压等功效[11-12]，
尽管 AA可诱发 AAN，引起了世人的警觉，但由于
不合理的用药使得 AAN 事件时有发生，增强人们
对AAN的认识和提高AAN的可治愈性仍是解决此
类事件的关键。
近年来，miRNAs 的功能研究越来越受到人们
的重视，动物源 miRNAs 主要是通过与靶基因
mRNA的 3’端非编码区域（3’UTR）不完全或完全
互配对结合，在翻译水平上特异性抑制基因的表
达。miRNAs 功能研究的关键在于其调控靶基因的
确定，但由于miRNAs和靶基因的作用位点并不完全
匹配，一个mRNA能被很多miRNAs调控，形成一
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表
达
量
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对照 AAI 对照 AAI 对照 AAI 对照 AAI 对照 AAI

miR-10a-3p miR-207 miR-9a-3p miR-874-3p miR-3594-3p
* * *
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图 4 miRNA的 Pathway分析 (部分)
Fig. 4 Pathway analysis of miRNA (part)
个十分复杂的转录后调控网络，导致应用传统方法鉴
定靶基因十分困难。miRNAs芯片技术能在特定的时
间点筛选出不同样本间的差异miRNAs表达情况，是
一种新型的高通量筛选技术，已在很多复杂性疾病的
研 究 中 进行 探 索并得 到 广 泛的 应 用， 如
microRNA-206与乳腺癌的发病、转移密切相关[13-14]，
在 AAN 研究方面，已有研究显示，miRNAs 与 AA
的基因毒性[7]、肾近曲小管上皮细胞的周期阻滞[8]等
过程密切相关，但 miRNAs在 AA或 AAI诱导的肾
毒性疾病中其他发病过程的相关研究还未见报道。
本研究利用基因微阵列分析技术探索 AAI 对
大鼠肾脏造成损伤后血清中 miRNAs 表达谱的影
响，发现 miR-10a-3p、miR-207、miR-3594-3p、
miR-874-3p、miR-9a-3p 等 5 个 miRNAs 表达明显
上调，无明显下调的 miRNAs；利用 qRT-PCR技术
对芯片结果进行检验，该结果与 miRNAs芯片结果
基本一致，增加了本研究的可靠性，发生明显改变
的miRNAs在AAI致大鼠肾损伤过程中的具体功能
还有待研究。本课题组对差异表达 miRNAs的靶基
因进行预测及信号通路分析，寻找到 Rhebl1、Usp10
等多个潜在靶基因，并发现 AAI致肾损伤与过氧化
物酶体途径、MAPK信号通路途径等有很大关系，
信号通路分析结果为 AAN 机制的深入研究提供了
新方向的借鉴和理论基础，针对该结果，本课题组
将对此次miRNAs芯片结果的生物信息学进行深入
研究和验证，并做出充分的阐述。
通过以上研究，本课题组已初步找到一些可能与
AAI致肾损伤相关的miRNAs和潜在靶基因，及相应
的生物途径，这将为进一步阐明 AAN的发病机制提
供新的线索，为其预防、诊断和治疗提供新的依据。
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Proc Natl Acad Sci USA, 2006, 103(23): 8721-8726.
Gap junction-Rattus norvegicus (rat)
Peroxisome-Rattus norvegicus (rat)
MAPK signaling pathway-Rattus norvegicus (rat)
Dopaminergic synapse-Rattus norvegicus (rat)
Prolactin signaling pathway-Rattus norvegicus (rat)
Mucin type O-Glycan biosynthesis-Rattus norvegicus (rat)
Synthesis and degradation of ketone bodies-Rattus norvegicus (rat)
Adrenergic signaling in cardiomyocytes-Rattus norvegicus (rat)
Adipocytokine signaling pathway-Rattus norvegicus (rat)
Terpenoid backbone biosynthesis-Rattus norvegicus (rat)
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
Enrichment Score (−logP)