全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46卷 第 8期 2015年 4月 ·1156·
R语言多目标优化养阴通脑颗粒组方中 3种黄酮类指标成分提取工艺
虞 立，张宇燕，杨洁红，周惠芬，金伟锋，万海同*
浙江中医药大学 心脑血管病研究所，浙江 杭州 310053
摘 要：目的 多目标优化养阴通脑颗粒组方中 3 种黄酮类指标成分的提取工艺。方法 以养阴通脑颗粒组方中葛根素、毛
蕊异黄酮和芒柄花素的提取率为检测指标，采用 4 因素 3 水平的正交试验设计方法进行提取工艺考察。通过 R 语言结合熵
权法赋予权值，建立 BP 神经网络模型，再利用遗传算法对网络进行目标寻优，从而得到养阴通脑颗粒组方中葛根素、毛蕊
异黄酮和芒柄花素的最佳提取工艺。结果 养阴通脑颗粒组方中葛根素、毛蕊异黄酮和芒柄花素的最优工艺条件为乙醇体积
分数 85%、提取时间 1.5 h、提取温度 80 ℃、乙醇用量 25 倍，模型综合评价预测值为 0.389，而实验所得的平均综合评价
值为 0.394，相对误差为 1.27%，表明具有良好的网络预测性。结论 结合所得 3 个指标成分的提取率和提取工艺的可操作
性、可重复性，建立的数学模型可用于对养阴通脑颗粒组方中葛根素、毛蕊异黄酮和芒柄花素的提取工艺进行分析和预测，
为实现中药有效成分多目标寻优提供了新的参考。
关键词：R 语言；养阴通脑颗粒组方；熵权法；神经网络；遗传算法；多目标优化
中图分类号：R284.2 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2015)08 - 1156 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2015.08.011
Study on three indicator flavonoids extraction of multi-objective optimization
formula of Yangyin Tongnao Granules by R language
YU Li, ZHANG Yu-yan, YANG Jie-hong, ZHOU Hui-fen, JIN Wei-feng, WAN Hai-tong
Cerebrovascular Disease Research Institute, Zhejiang Chinese Medicine University, Hangzhou 310053, China
Abstract: Objective Multi-objectively optimizing the extraction technology for three indicator flavonoids in the formula of Yangyin
Tongnao Granules. Methods Taking the extraction yield of puerarin, calycosin, and formononetin in the formula of Yangyin Tongnao
Granules as the detecting indicators, the extraction technology was investigated by 4 factors 3 levels orthogonal test design method.
Using R language, combining the entropy weight method to give weight, and establishing the BP neural network model, using the
genetic algorithm to target the optimization of network, so as to get the best extraction technology for puerarin, calycosin, and
formononetin. Results The optimization of extraction technology was as follows: ethanol concentration was 85%, extraction time was
1.5 h, extraction temperature was 80 ℃, and ethanol dosage was 25 times. Under the condition, the predictive value of model
comprehensive evaluation was 0.389, the predictive value of the average comprehensive evaluation obtained in the experiment was
0.394, the relative error was 1.27%. So it had a better network prediction. Conclusion Combining the feasibility and repeatability of
the extraction yield and extraction technology for the three index component to establish the mathematical model for analyzing and
predicting the extraction technology of puerarin, calycosin, and formononetin in the formula of Yangyin Tongnao Granules and
providing a new reference to realize the multi-objective optimization of the extraction technology for the active constituents in Chinese
materia medica.
Key words: R language; formula of Yangyin Tongnao Granules; entropy weight method; neural network; genetic algorithm; multi-
objective optimization

养阴通脑颗粒组方是现代中药复（处）方制剂，
其组方由生地黄、黄芪、葛根、川芎按比例 1∶1∶
1.2∶0.67 组成，提取制备得到养阴通脑颗粒，药品
临床研究批文为 2003L00206，已完成 II 期、III 期

收稿日期：2014-11-12
基金项目：国家自然科学基金资助项目（81374053，81202636，81274176）；浙江省自然科学基金资助项目（LR12H27001）；浙江省中医药（中
西医结合）重点学科项目（2012-XK-A06）
作者简介：虞 立（1991—），男，浙江海宁人，主要从事生物化工、中药有效成分分离及药动学研究。Tel: (0571)86613716 E-mail: yuli9119@126.com
*通信作者 万海同 Tel: (0571)86613711 E-mail: whtong@126.com
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临床研究。其具有生津、益气、活血等功效，特别
在治疗心脑血管疾病方面有明显的疗效[1]。
药理研究表明，总黄酮类成分是抗缺血作用主
要的有效部位[2]。其中，葛根素、毛蕊异黄酮和芒
柄花素为君药葛根和黄芪中的主要活性成分[3-4]。3
个成分都具有保护心脑血管，提高免疫力，抗氧化、
清除自由基等药理活性[5-7]。
R 语言是一种有着强大统计分析及作图功能的
开源软件系统语言和操作环境，具有操作简单、浮
点运算功能强大、作图功能强大、统计分析能力突
出等特点[8]。目前，许多研究者在研究中药提取等
方面通常借助 Matlab 等对数据进行分析优化[9-10]，
程序繁琐且过程相对复杂。然而，在 R 语言环境下
运用 BP 神经网络和遗传算法对中药有效成分提取
进行优化和验证尚未见报道。
本实验在建立定量测定方法学的基础上对养阴
通脑颗粒中 3 个指标成分进行定量测定，得出的数
据结果运用 R 语言并结合 BP 神经网络和遗传算法
进行处理和分析，最后优化得到最佳提取工艺。
1 仪器与材料
赛多利斯（Sartorius）BS110S 电子天平，北京
赛多利斯天平有限公司；Millipore Simpicity 纯水
仪，美国 Millipore 公司；HH 系列数显恒温水浴锅，
上海江星仪器有限公司；SHB-IIIA 循环水式多用真
空泵，河南省太康科教器材厂；Agilent 1200 型高效
液相色谱系统，包括 G1311A 四元梯度泵、G1316A
柱温箱、G1315D 二极管阵列检测器、G1315D DAD
检测器、G1322A 在线脱气机和化学工作站。
葛根素对照品，批号 110752-201313，中国食
品药品检定研究院，质量分数 98%；毛蕊异黄酮对
照品（批号 20130408，质量分数 98%）、芒柄花素
对照品（批号 20130408，质量分数 98%），天津士
兰科技有限公司；水为超纯水；乙腈为色谱纯；其
他化学试剂均为分析纯。
生地黄（河南，批号 140601）、葛根（安徽，
批号 140601）、黄芪（甘肃，批号 140701）、川芎（四
川，批号 140401）均购于浙江中医药大学中药饮片
有限公司，经浙江中医药大学药学院药剂教研室主
任黄绳武教授鉴定，生地黄为玄参科植物地黄
Rehmannia glutinosa Libosch. 的干燥块根，葛根为
豆科植物野葛 Pueraria lobata (Willd.) Ohwi 的干燥
根 ， 黄 芪 为 豆 科 植 物 膜 荚 黄 芪 Astragalus
membranaceus (Fisch.) Bge. 的干燥根，川芎为伞形
科植物川芎 Ligusticum chuanxiong Hort. 的干燥根
茎，均符合《中国药典》2010 年版相关规范要求。
使用的软件为 The R Foundation for Statistical
Computing 开发的 R version 3.1.1 软件，熵权法、神
经网络模型代码和遗传算法 rgenoud 工具包。
2 方法与结果
2.1 葛根素、毛蕊异黄酮和芒柄花素的 HPLC 同
时测定
2.1.1 色谱条件 色谱柱为 Zorbax SB-C18 柱（150
mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.1%磷酸酸
水溶液，采用线性梯度洗脱程序：0～5 min，8%乙
腈；5～10 min，8%～15%乙腈；10～15 min，15%～
30%乙腈；15～20 min，30%～50%乙腈；体积流量
1.00 mL/min；检测波长 251 nm；柱温为 30 ℃；进
样量 20 μL。
2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取葛根素、毛蕊
异黄酮和芒柄花素对照品适量，葛根素对照品置于
10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度线，充分摇匀，制成
含葛根素 1.44 mg/mL 的单一成分储备液。毛蕊异黄
酮和芒柄花素对照品置于 10 mL 量瓶中，加甲醇至
刻度线，充分摇匀，制成含毛蕊异黄酮 0.67 mg/mL
和芒柄花素 0.64 mg/mL 的混合对照品储备液。分别
精密吸取上述 2 个储备液 5.0 mL 和 2.0 mL，置于
同一 10 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即
得混合对照品溶液（葛根素 720.0 μg/mL、毛蕊异黄
酮 134.0 μg/mL、芒柄花素 128.0 μg/mL）。
2.1.3 养阴通脑颗粒组方溶液的提取与供试品溶液
的制备 按养阴通脑颗粒组方中药材的比例称取药
材 4 g，精密称定，置于圆底烧瓶中，精密加入 70%
乙醇 300 mL，称定质量，在 80 ℃下加热回流提取
3 h，放冷至室温，补足减失的质量，摇匀，抽滤，
即得提取溶液。提取溶液旋转蒸发至近干，用适量
甲醇溶解，转入 10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇
匀，用 0.22 μm 的微孔滤膜滤过，滤液作为供试品
溶液。
2.1.4 系统适应性试验 分别吸取混合对照品溶
液、供试品溶液各 20 μL，注入液相色谱仪，测定。
3 种成分可达基线分离，分离度达到《中国药典》
2010 年版要求大于 1.5，色谱图见图 1。
2.1.5 线性关系的考察 混合对照品溶液作为 1 号
溶液，采用倍比稀释法制成系列质量浓度溶液，得
2～8 号混合对照品溶液在“2.1.1”项下色谱条件测
定峰面积，以对照品质量浓度为横坐标（X），相
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1-葛根素 2-毛蕊异黄酮 3-芒柄花素
1-puerarin 2-calycosin 3-formononetin
图 1 HPLC图
Fig. 1 HPLC chromatograms

应的峰面积积分值为纵坐标（Y），绘制标准曲线，
计算回归方程。葛根素 Y＝78.365 X＋22.355，r＝
0.999 8；毛蕊异黄酮 Y＝117.12 X＋39.539，r＝
0.999 9；芒柄花素 Y＝141.18 X＋1.778，r＝0.999 9。
葛根素在 5.63～720.00 μg/mL 呈良好线性关系；毛
蕊异黄酮在 1.05～134.00 μg/mL 呈良好线性关系；
芒柄花素在 1.00～128.00 μg/mL 呈良好线性关系。
2.1.6 精密度试验 精密吸取 2 号混合对照品溶
液，按“2.1.1”项色谱条件重复进样 6 次，记录混
合对照品溶液中葛根素、毛蕊异黄酮和芒柄花素的
色谱峰面积并计算 RSD 值分别为 0.53%、0.74%、
0.57%，表明精密度良好。
2.1.7 稳定性试验 按照“2.1.3”项下方法制备的
供试品溶液 1 份，按“2.1.1”项下色谱条件分别在
0、2、4、6、8、12 h 进样，记录葛根素、毛蕊异黄
酮和芒柄花素的色谱峰面积，供试品溶液色谱峰面
积的 RSD 值分别为 1.10%、1.29%、1.16%，表明供
试品溶液均在 12 h 内稳定。
2.1.8 重复性试验 同一批药材，按养阴通脑颗粒
组方中药材的比例称取药材 4 g，精密称定，取样 6
份，按“2.1.3”项方法制备供试品溶液，记录葛根
素、毛蕊异黄酮和芒柄花素的色谱峰面积，计算得
其质量分数的 RSD 值分别为 1.74%、2.47%、2.32%，
表明该方法重复性良好。
2.1.9 加样回收率试验 取已测定的同一批药材，
按养阴通脑颗粒组方中药材的比例称取药材 4 g，精
密称定，共 6 份，按照“2.1.3”项方法制备提取样
品溶液，每份各精密加入葛根素对照品储备液 3.0
mL、毛蕊异黄酮和芒柄花素对照品储备液 60 μL，
制备供试品溶液，按照色谱条件进行测定，葛根素
的平均回收率为 99.2%，RSD 值为 2.59%；毛蕊异
黄酮的平均回收率为 97.52%，RSD 值为 3.31%；芒
柄花素的平均回收率为 96.65%，RSD 值为 3.72%。
2.2 正交试验设计
2.2.1 因素水平设计 在单因素试验的基础上确定
影响养阴通脑颗粒组方中 3 种指标黄酮提取率的 4
个因素：乙醇体积分数（A）、提取时间（B）、提取
温度（C）、乙醇用量（D），进行 4 因素 3 水平 L9(34)
正交试验设计，筛选最佳提取工艺。见表 1。
2.2.2 试验方法 按养阴通脑颗粒组方中药材的比
例称取药材 200 g，共 9 份，按照正交试验设计条件
进行提取，残渣重复提取 1 次，回流提取后放冷，
抽滤，旋转蒸发至尽干，用适量甲醇溶解，转入 50
mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，从中精密吸取

表 1 L9(34) 正交试验设计方案及结果 (n = 3)
Table 1 Design and results of L9(34) orthogonal test (n = 3)
因素 提取率/(μg·g−1)
编号
A/% B/h C/℃ D/倍 葛根素 毛蕊异黄酮 芒柄花素
综合评价值
1 55 (1) 1.5 (1) 60 (1) 15 (1) 1 790 10.15 5.80 0.317
2 55 (1) 2.0 (2) 70 (2) 20 (2) 1 923 15.20 5.30 0.342
3 55 (1) 2.5 (3) 80 (3) 25 (3) 2 140 13.10 6.45 0.379
4 70 (2) 1.5 (1) 70 (2) 25 (3) 2 212 6.10 5.60 0.388
5 70 (2) 2.0 (2) 80 (3) 15 (1) 1 860 7.80 5.95 0.328
6 70 (2) 2.5 (3) 60 (1) 20 (2) 1 900 14.70 4.90 0.337
7 85 (3) 1.5 (1) 80 (3) 20 (2) 1 980 7.30 4.50 0.348
8 85 (3) 2.0 (2) 60 (1) 25 (3) 2 168 1.54 4.40 0.384
9 85 (3) 2.5 (3) 70 (2) 15 (1) 1 852 7.30 5.15 0.326
混合对照品
养阴通脑颗粒组方样品
1
3 2
3 2
1
0 5 10 15 20
t/min
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5.2 mL 置于 250 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，
即得 9 个样品溶液，密封放置冰箱内备用。最后测
定葛根素、毛蕊异黄酮和芒柄花素的提取率。提取
率＝各指标黄酮的量/生药材量，结果见表 1。
2.2.3 综合评价值的计算 使用 R 语言进行编程，
计算熵权权重值[11]，得到葛根素、毛蕊异黄酮和芒
柄花素的权重系数分别为 0.173、0.436 和 0.391。综
合评价值＝葛根素提取率×0.173＋毛蕊异黄酮提
取率×0.436＋芒柄花素提取率×0.391。正交试验结
果见表 1。
2.3 R语言环境下 BP神经网络建模
本实验采用 3 层结构的 BP 神经网络来建立模
型，输入节点数为 4 个，即乙醇体积分数、提取时
间、提取温度、乙醇用量；输出节点数为 1 个，即
综合评价值。9 组正交试验数据分别采用留一法交
叉验证进行训练，初始随机权（rang）为 0.3，参数
重量衰变（decay）为 5×10−5，最大迭代次数（maxit）
为 600，其他参数设为默认值。而隐层中的神经元
（size）数则经过前期的调试训练，选取为 0。
由结果可知，9 组数据经留一法交叉验证，其
平均拟合误差为 1.25%，平均预测误差为 3.30%，
均小于 5%，都具有显著性意义。综上所述，此 BP
神经网络稳定可靠。
2.4 R语言编程中遗传算法进行目标优化
采用实数编码方式，种群大小为 1 000，接近的
最大代数为 100，最大不可变代数为 10，收敛公差
为 1×10−4，其他参数均设为默认值。运用 R 语言
代码进行编程，由遗传算法得到的结果如下：总共
运行了 12 代，运行时间为 5 s，运行到第 2 代时得
出网络预测综合评价值为 0.389。得到该结果的条件
分别为乙醇体积分数 85%，提取时间 1.5 h，提取温
度 80 ℃，乙醇用量 25 倍。
2.5 验证试验
按上述优化后的提取工艺条件，称取 200 g 药
材，共 4 份，进行乙醇热回流提取实验，测定总黄
酮中葛根素、毛蕊异黄酮和芒柄花素的提取率。结
果见表 2。由表 2 可知，其平均综合评价值为 0.394，
网络预测值为 0.389，实验测量值和网络预测值的相
对误差为 1.27%。优化后提取工艺的测量值结果与预
测值吻合度较优，说明模型具有较好的网络预测性。
3 讨论
3.1 实验因素的确定
查阅文献和相关资料[12-13]，乙醇体积分数、提
表 2 最佳工艺下的验证试验
Table 2 Varification under optimal condition
提取率/(μg·g−1)
编号
葛根素 毛蕊异黄酮 芒柄花素
综合评价值
1 2 278 10.90 5.05 0.401
2 2 220 11.00 5.70 0.392
3 2 187 10.10 5.65 0.385
4 2 254 9.65 5.00 0.397

取次数、提取时间、提取温度和乙醇用量对葛根素、
毛蕊异黄酮和芒柄花素提取率有较大影响。
分别考察了回流提取乙醇体积分数 55%、70%、
85%，提取次数 1、2、3 次，提取时间 1.5、2.0、
2.5 h，提取温度 60、70、80 ℃，乙醇用量 15、20、
25 倍，发现乙醇体积分数、提取时间、提取温度和
乙醇用量对葛根素、毛蕊异黄酮和芒柄花素提取率
影响最大。发现经提取 3 次后，葛根素、毛蕊异黄
酮和芒柄花素提取率没有明显增加，从环保、经济
等考虑，将提取次数定为 2 次。
3.2 考察指标的确定
据已有文献报道[14]和《中国药典》2010 年版[15]，
4 味药材中黄酮类物质的量较高的为葛根与黄芪，
而该 2 味药材的黄酮类部位中又以葛根素、毛蕊异
黄酮和芒柄花素为典型代表。故以上述 3 个成分为
考察指标，为养阴通脑颗粒组方中有效成分的质量
评价和质量控制提供参考，也可为中药复方定量测
定提供参考。
3.3 液相测定方法的选择
据相关文献报道[16]和《中国药典》2010 年版[15]
记载葛根素、毛蕊异黄酮和芒柄花素的液相测定条
件，在此基础上摸索并加以改进。
由于流动相系统多采用甲醇-水系统和乙腈-水
系统。因此，本实验就以乙腈配比不同百分比的甲
酸和磷酸水溶液，甲醇配比不同百分比的甲酸和磷
酸水溶液作为流动相进行初期摸索。由于本样品为
中药提取物，杂质较多，实验发现乙腈-0.06%、0.1%
磷酸水溶液进行梯度洗脱能初步把葛根素、毛蕊异
黄酮和芒柄花素峰分离，达到分离要求。并且 0.1%
磷酸水溶液能很好地抑制峰的拖尾现象，且较稳定，
故最终确定流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液。由于有
3 种指标成分需分离并同时测定，故采用上述
“2.1.1”项梯度以节省时间并洗脱充分。
采用液相紫外全波长扫描，发现 3 种指标成分
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都在 251 nm 处有较大吸收，故选取此波长进行定
量测定。
3.4 熵权法赋予权重
在相关中医药类文献报道中[17]，实验者往往主
观赋予各考察指标相应的权重系数，由于引进了人
为干预，难以摆脱人为因素及随机性的影响，这在
很大程度上具有很强的主观性。所以本实验采取了
熵权法进行权重赋予，较好地规避了人为介入产生
的误差。
熵权法是一种客观赋予权重的方法。在使用过
程中，熵权法根据各个指标的变异程度，利用信息
熵计算出各指标的熵权，再通过熵权对各指标的权
重进行修正，从而得到较为客观的指标权重。其优
点主要有 2 个：①客观性，相对于那些主观赋值法，
精度较高、客观性较强，能够很好地解释所得到的
结果；②适应性，可以用于任意评价或多目标优化
问题中的确定指标权重和任何需要确定权重的过
程，同时也可以结合一些方法一起使用。这种方法
给出的权重系数客观、真实、有效。
多目标提取工艺评价符合中药多成分、多靶点
的特点。近年来，多目标决策方法被广泛用于中医
药研究领域。本实验运用 R 语言结合 BP 神经网络
和遗传算法，进行数据处理并寻找最优工艺条件，
该数学模型具有简单、快捷、准确等优点；且所建
立的测定方法准确、灵敏、简便，且稳定性和重复
性良好，为实现中药有效成分多目标寻优提供了新
的参考。
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