全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 10 期 2016 年 5 月

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土鳖虫及其混淆品 HPLC 指纹图谱分析
王欣丽，李 清，李博惠，回 音，陈媛媛，毕开顺*
沈阳药科大学药学院，辽宁 沈阳 110016
摘 要：目的 通过 OPA-FMOC 在线自动衍生化，建立土鳖虫的 HPLC 指纹图谱分析方法。方法 色谱柱为 Durashell-AA
柱（150 mm×4.6 mm，3 μm）；流动相组成为 A：0.01 mol/L 磷酸氢二钠及四硼酸钠水溶液（盐酸调节 pH 值至 8.2）；流动
相 B：甲醇-乙腈-水（45∶45∶10）；体积流量 1.6 mL/min；检测波长：0～24 min，338 nm；24～27 min，228 nm；柱温 45 ℃；
梯度洗脱。结果 共得到 28 个共有峰，指认了其中 15 个化学成分，建立了土鳖虫及其混淆品 HPLC 指纹图谱并计算相似
度，根据 SPSS 聚类分析结果，将其分为 2 类，第 I 类药材为地鳖或冀地鳖，第 II 类为金边地鳖。结论 所建立的土鳖虫
HPLC 指纹图谱快速、准确、重复性好，为土鳖虫的质量控制提供科学依据。
关键词：土鳖虫；在线自动衍生化；指纹图谱；HPLC；混淆品
中图分类号：R286.6 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2016)10 - 1780 - 04
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.10.025
HPLC fingerprint analysis for Eupolyphaga steleophaga and its adulterants
WANG Xin-li, LI Qing, LI Bo-hui, HUI Yin, CHEN Yuan-yuan, BI Kai-shun
School of Pharmacy, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China
Abstract: Objective To establish the chromatographic fingerprint analysis for the quality control of Eupolyphaga steleophaga with
OPA-FMOC by on-line derivatization. Methods Analysis was completed with a gradient elution of 0.01 mol/L sodium dihydrogen
phosphate and 0.01 mol/L sodium tetraborate, pH = 8.2 (A) and methanol-acetonitrile-water was 45:45:10 (B). The wavelength was set
at 338 nm from 0−24 min, and at 228 nm from 24−27 min. Efficient and symmetrical peaks were obtained with data flowrate of 1.6
mL·min. Results A total of 28 peaks were detected, while 15 ingredients were identified. The 18 batches of samples were classified
into two groups based on the results of cluster analysis. The first category was E. sinensis and Steleophaga plancyi; The second
category was Opisthoplata orientalis and it was identified as the adulterants. Conclusion The HPLC fingerprint method is repeatable,
feasible in analysis of E. steleophaga and could be used scientifically to evaluate the quality of E. steleophaga with quality control.
Key words: Eupolyphaga steleophaga Walker; on-line derivatization; fingerprint; HPLC; adulterants

土鳖虫 Eupolyphaga Steleophaga 为鱉蠊科昆虫
地 鳖 Eupolyphaga sinensis Walker 或 冀 地 鳖
Steleophaga plancyi Boleny 的雌虫干燥体[1]。地鳖主
产于北京、华中、华东、华南和西部各省区；冀地
鳖分布于黄河北侧省地；赤边水蟅 Opisthoplata
orientalis Burm（习称金边地鳖）未被《中国药典》
2015 年版收录[2]，为土鳖虫混淆品，但在浙江、福
建、台湾、广东、海南等地[3]常被作为土鳖虫入药。
土鳖虫味咸，性寒，有小毒，归肝经，具破血逐瘀、
续筋接骨的功效，用于闭经、不孕不育、产后瘀阻、
症瘕等症；亦可用于骨折损伤、瘀滞疼痛、腰部扭
伤等症[4]。氨基酸是土鳖虫的主要组成成分之一，
总量约占土鳖虫的 40%，直接参与合成各种酶、激
素，在活血化瘀疗效中起着一定的作用[5]。土鳖虫
中共含有 18 种氨基酸，种类齐全，几乎包含了构成
蛋白质的所有氨基酸，其中人体必需的 8 种氨基酸
（包括婴儿必需的组氨酸）占氨基酸总量的 34.5%。
传统的氨基酸衍生化方法主要有柱前衍生法[6]和柱
后衍生法[7]，但以上 2 种方法操作繁琐、费时。本
实验建立了 OPA-FMOC[8]在线衍生化方法，测定了

收稿日期：2015-10-29
基金项目：教育部科学技术研究重点项目（212032）；辽宁省教育厅创新团队—中药质量控制关键技术（LT2012018）
作者简介：王欣丽（1987—），硕士在读，研究方向为中药质量控制。Tel: 13840122035 E-mail: wangxinli0703@163.com
*通信作者 毕开顺 Tel: (024)23986012 E-mail: bikaishun@126.com
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不同来源的土鳖虫及其混淆品中氨基酸的指纹图
谱，为其质量评价提供了一定参考依据。
1 仪器与材料
Agilent 1100 高效液相色谱仪，包括四元泵、
在线脱气机、柱温箱、DAD 检测器、全自动进样
（美国 Agilent 公司）；AB135-S 十万分之一天平
（Mettler Toledo 仪器有限公司）；BP210S 电子天
平（Sartorius 公司）；HC-2516 高速离心机（科大
创新股份有限公司）。
甲醇、乙醇、乙腈（色谱纯，山东禹王有限公
司）；磷酸、盐酸、磷酸氢二钠（分析纯，天津科
密欧化学试剂开发中心）；纯净水（杭州娃哈哈集
团有限公司）；四硼酸钠（天津博迪化工股份有限
公司）；临苯二甲醛（OPA）、9-芴基氯甲酸甲酯
（FMOC）、硼酸盐缓冲液（天津博纳艾杰尔科技有
限公司）；15 种氨基酸对照品（批号 624-200104）
购自中国食品药品检定研究院。本实验收集土鳖虫
样品共 18 批，由沈阳药科大学生药学教授贾英鉴
定为土鳖虫 Eupolyphaga Steleophaga 及其混淆品金
边地鳖雌虫干燥体。药材信息见表 1。药材经粉碎
后，过 60 目筛，置于干燥阴凉处保存备用。
表 1 18 批药材来源
Table 1 Sources of 18 samples
批次 名称 产地
1 地鳖 山东临沂
2 地鳖 江苏常州
3 金边地鳖 广西南宁
4 冀地鳖 河北安国
5 金边地鳖 海南澄迈
6 地鳖 江苏常州
7 地鳖 安徽亳州
8 地鳖 安徽亳州
9 地鳖 江苏常州
10 冀地鳖 北京
11 地鳖 浙江苏州
12 地鳖 河南南阳
13 金边地鳖 河南洛阳
14 冀地鳖 河南洛阳
15 金边地鳖 广西钦州
16 地鳖 江苏淮安
17 地鳖 浙江杭州
18 地鳖 上海
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Durashell-AA（150 mm×4.6 mm，3
μm）；流动相组成为 A：0.01 mol/L 磷酸氢二钠及的
四硼酸钠水溶液（盐酸调节 pH 值至 8.2）；流动相
B：甲醇-乙腈-水（45∶45∶10）；体积流量 1.6
mL/min；检测波长：0～24 min，338 nm；24～27 min，
228 nm；柱温 45 ℃；进样量 1 μL。梯度洗脱程序：
0～6 min，5%～8% A；6～11 min，8%～13% A；
11～19 min，13%～28% A；19～22 min，28%～36%
A；22～27 min，36%～75% A。
2.2 在线自动衍生化方法
2.2.1 衍生化试剂的配制 稀盐酸（0.1 mol/L）：取
36%盐酸 4.16 mL，加水稀释至 500 mL；衍生试剂
（OPA）：取 A 试剂 1 支，加入 B 试剂 60 μL，混匀；
稀释剂：取 100 mL 流动相 A，加磷酸 0.5 mL，混匀。
2.2.2 在线自动衍生化程序的设置 取进样瓶 6
个，编号 1～6，并依此加入硼酸缓冲液、水、OPA
衍生剂、FMOC 衍生剂、稀释剂、待测样品。设置自
动衍生化程序为分别从 1 号瓶中吸取硼酸盐缓冲液 5
μL，从 6 号瓶中吸取样品 1 μL，在空气中以最大速度
混合 6 次。等待 0.5 min，从 2 号瓶中吸取水 10 μL，
从 3 号瓶中吸取 OPA 衍生剂 1 μL， 在空气中以最大
的速度混合 6 次。从 2 号瓶中吸取水 10 μL，从 4 号
瓶中吸取 FMOC 衍生剂 1 μL，在空气中以最大的速
度混合 10 次。从 5 号瓶中吸取稀释剂 32 μL，在空气
中以最大的速度混合 8 次后进样。
2.3 供试品溶液的制备
取药材粉末 5.0 g，置于锥形瓶中，加入乙醇-
水（50∶50）25 mL，混匀，超声提取 30 min，涡
旋 5 min，10 000 r/min 离心机离心 2 次，每次 3 min。
取上清液经 0.45 μm 微孔滤膜滤过，续滤液作为供
试品溶液。
2.4 对照品溶液的制备
分别精密称取 15 种氨基酸对照品适量，加入浓
度为 0.1 mol/L 稀盐酸溶解并摇匀，制得浓度分别为
丝氨酸 0.21 mol/L、组氨酸 0.52 mol/L、甘氨酸 0.37
mol/L、苏氨酸 0.18 mol/L、精氨酸 0.685 mol/L、丙
氨酸 1.52 mol/L、酪氨酸 0.27 mol/L、缬氨酸 0.46
mol/L、色氨酸 0.18 mol/L、异亮氨酸 0.61 mol/L、
苯丙氨酸 0.28 mol/L、赖氨酸 0.45 mol/L、亮氨酸
0.49 mol/L、脯氨酸 0.83 mol/L、天冬氨酸 0.76
mg/mL 的混合对照品溶液。
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2.5 方法学考察
2.5.1 精密度试验 取第 15 批药材供试品溶液，在
“2.1”项色谱条件下重复进样 6 次，记录各色谱峰
的保留时间和峰面积。计算各共有峰相对于内参比
峰（13 号峰）的相对保留时间和相对峰面积。结果
表明，各共有峰相对保留时间的 RSD 均小于 0.2%，
相对峰面积的 RSD 均小于 1.7%。表明仪器的精密
度良好。
2.5.2 重复性试验 取第15批药材6份，精密称定。
按“2.3”条件制备供试品溶液，在上述色谱条件下
进行 HPLC 分析，记录各色谱峰的保留时间和峰面
积。计算各共有峰相对于内参比峰（13 号峰）的相
对保留时间和相对峰面积。结果表明，各共有峰相
对保留时间的RSD均小于0.9%，相对峰面积的RSD
均小于 3.7%。表明方法的重复性良好。
2.5.3 稳定性试验 取第 15 批药材供试品溶液，室
温下分别在 0、2、4、6、8、12 h 进样分析，记录
各色谱峰的保留时间和峰面积。计算各共有峰相对
于内参比峰（13 号峰）的相对保留时间和相对峰面
积。结果表明，各共有峰相对保留时间的 RSD 均小
于 0.6%，相对峰面积的 RSD 均小于 4.4%。表明供
试品溶液室温下 12 h 内稳定。
2.6 HPLC 指纹图谱的建立
2.6.1 样品 HPLC 指纹图谱的建立 HPLC 指纹图
谱共标定 28 个共有峰。以对照品对照，指认了 15
种氨基酸。标准指纹图谱见图 1。


2-天冬氨酸 4-丝氨酸 5-组氨酸 6-甘氨酸 7-苏氨酸 10-精氨酸 13-丙氨酸（S） 15-酪氨酸 18-缬氨酸 20-色氨酸 21-异亮氨酸 22-苯丙
氨酸 23-赖氨酸 24-亮氨酸 28-脯氨酸
2-Asp 4-Ser 5-His 6-Gly 7-Thr 10-Arg 13-Ala(S) 15-Tyr 18-Val 20-Trp 21-Ile 22-Phe 23-Lys 24-Leu 28-Pro
图 1 土鳖虫标准指纹图谱
Fig. 1 Standard fingerprint of E. steleophaga
2.6.2 指纹图谱相似度计算 将 18 批药材
HPLC 指纹图谱导入中药色谱指纹图谱相似度
评价系统（2009 版）进行处理，获得土鳖虫及
其混淆品的标准指纹图谱，以此为基准，计算
样品共有色谱峰与共有模式的相似度，对 18 批
供试品进行评价，其相似度见表 2，指纹图谱相
似性比对见图 2。相似度分析结果显示，第 3、
5、13、15 批相似度为 0.909～0.923，较其他各
批次低；其余各批次的相似度均高于 0.941。其
中，相似度略低的 4 批均属于金边地鳖。根据
各色谱峰之间响应值高低可判断，缬氨酸在各
批次中质量分数差别较大，相差约 11 倍，其余
各氨基酸在不同批次中质量分数差别约为 5～8
倍。第 2、6、11、17 批次中，各氨基酸响应值
整体较其他批次略高。
2.6.3 系统聚类分析 实验中应用 SPSS 软件，以
表 2 18 批药材相似度结果
Table 2 Results of similarity of 18 batches of samples
批次 相似度 批次 相似度
1 0.970 10 0.948
2 0.969 11 0.974
3 0.913 12 0.963
4 0.941 13 0.911
5 0.906 14 0.944
6 0.966 15 0.902
7 0.965 16 0.950
8 0.949 17 0.968
9 0.967 18 0.943

组间平均联接法聚类（between-group），利用欧式距
离平方（squared euclidean distance）作为样品相似
度的测度[9]。18 批药材可分为 2 类，样品 1、2、4、
0 5 10 15 20 25
3
2
1
4
5
13(S)
106
7 8 119
12
14
15
16
19
18
17
23
21
20 22
25
24 27
26

28
t/min
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图 2 土鳖虫及其混淆品 HPLC 指纹图谱
Fig. 2 HPLC fingerprint of E. steleophaga and its adulterants
6、7、8、9、10、11、12、14、16、17、18 号为第 I
类，样品 3、5、13、15 号为第 II 类。第 I 类药材均
为地鳖或冀地鳖，其中第 4、10、14 批为冀地鳖，其
余批次为地鳖；第 II 类均为金边地鳖。通过聚类分析
结果（图 3）显示，不同批次的药材主要按照不同属
来聚类区分，与产地关系较小。说明土鳖虫主要成分
及量受遗传及进化影响大于其受土壤、水分、温度等
生长环境差别。地鳖、冀地鳖为《中国药典》2015
年版中收录的土鳖虫药材，聚类分析结果显示，地鳖、
冀地鳖的质量相近；金边地鳖尚未被《中国药典》2015
年版收录，且通过其氨基酸指纹图谱相似度及系统聚
类分析结果显示，金边地鳖与其他 2 类药材相比，相
似度较低，进一步证实金边地鳖为土鳖虫混淆品。因
此，建议禁止金边地鳖作为土鳖虫入药。


图 3 18 批药材系统聚类分析结果
Fig. 3 Dendrogram of hierarchical clustering analysis of
18 batches of samples
3 讨论
3.1 检测波长的选择
采用二极管阵列检测器考察了 190～370 nm 不
同检测波长处的色谱图，结果表明一级氨基酸和二
级氨基酸分别在在 338 nm 和 228 nm 处有最大吸
收，因此采用切换波长法进行检测：0～24 min，338
nm；24～27 min，228 nm。
3.2 流动相的选择
实验中考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇乙腈-加盐
水溶液等多种流动相系统，结果表明采用流动相组成
为 A：0.01 mol/L 磷酸氢二钠及 0.01 mol/L 的四硼酸
钠水溶液，盐酸调节 pH 值至 8.2；流动相 B：甲醇-
乙腈-水（45∶45∶10）时，各色谱峰分离度较好。
3.3 色谱柱的选择
实验中考察了普通 C18色谱柱与 Venusil AA 氨基
酸分析专用柱。Venusil AA 氨基酸分析专用柱基线平
稳，色谱峰数目较多，分离度和峰形较好，因此选用
Venusil AA 氨基酸分析专用柱进行指纹图谱研究。
3.4 衍生化方法及衍生剂的选择
本实验采用在线衍生化方法，在巯基试剂 N-
乙酰半胱氨酸存在下，一级氨基酸首先与 OPA 反应
生成 1-硫代-2-烷基异吲哚一级氨基酸产物[7]，而二
级氨基酸不和 OPA 反应，然后再用 FMOC 与二级
氨基酸反应生成 FMOC-二级氨基酸衍生物[10]。相
比于传统柱前衍生化更加简便、快捷、误差小。使
用 OPA 和 FMOC 作为衍生剂，样品制备简单、衍
生化反应迅速、分析时间短、灵敏度高。本实验采
用非挥发性的巯基试剂 N-乙酰半胱氨酸，与常用的
3-巯基丙酸（MPA）相比，具有无毒、无臭等优点。
0 5 10 15 20 25
6
11
12
2
17
9
1
7
8
16
18
4
10
14
3
5
13
15
I
II
S18

S17

S16

S15

S14

S13

S12

S11

S10

S9

S8

S7

S6

S5

S4

S3

S2

S1
0 5 10 15 20 25
t/min
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