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Analysis on protein polypeptide in Zhenzhuye and Zhengzhu Mingmu Eye Drops

珍珠明目滴眼液及珍珠液中蛋白多肽类成分的分析



全 文 :中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 6期 2016年 3月 ·911·
珍珠明目滴眼液及珍珠液中蛋白多肽类成分的分析
丁晓萍,费毅琴,肖 凌*,侯俊杰,涂奇军
湖北省食品药品监督检验研究院,湖北 武汉 430064
摘 要:目的 分析不同厂家珍珠明目滴眼液及珍珠液中蛋白多肽类成分的差异,为保证原料药生产工艺的稳定性,有效地
控制珍珠明目滴眼液的质量提供参考依据。方法 采用 UPLC-Q-TOF MS正离子模式进行分析,鉴定珍珠明目滴眼液及珍珠
液中的肽类成分,Acquity UPLC BEH C18(50 mm×2.1 mm,1.7 μm)色谱柱,乙腈-0.1%甲醇水溶液作为流动相;柱前衍生
化 HPLC-DAD 法测定珍珠明目滴眼液中 16 种氨基酸。结果 不同生产企业的珍珠明目滴眼液及珍珠液中多肽的相对分子
质量(MW)、16种氨基酸分别占总氨基酸量的百分比差异较大。5家企业中 3家的原料药珍珠液中肽的 MW均小于 2 000,
另 2个厂家珍珠液中肽的 MW为 500~4 746,以大于 2 000的肽为主。7个厂家的珍珠明目滴眼液样品中,2个厂家样品中
肽的 MW以 2 000~4 000为主,并含有 4 000以上的肽,另 5个厂家样品中不含 4 000以上的肽。7个厂家的珍珠明目滴眼
液中 16种氨基酸质量浓度相对总氨基酸质量浓度的百分比差异较大,2个厂家采用酸/酶水解工艺的珍珠液中脯氨酸与丙氨
酸质量浓度的比值>1,5个厂家采用水直接提取工艺的二者比值小于 1。结论 建议修订珍珠液质量标准,明确制备工艺为
水直接提取,确保滴眼液中的有效成分多肽(MW在 500~5 000),珍珠液及珍珠明目滴眼液质量标准增加检查项脯氨酸与
丙氨酸质量浓度的比值及定量测定项氨基酸总量,以有效控制珍珠明目滴眼液的质量,确保其有效性。
关键词:珍珠明目滴眼液;珍珠液;多肽;UPLC-Q-TOF MS;氨基酸;RP-HPLC
中图分类号:R286.02;R284.2 文献标志码:A 文章编号:0253 - 2670(2016)06 - 0911 - 06
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.06.009
Analysis on protein polypeptide in Zhenzhuye and Zhengzhu Mingmu Eye Drops
DING Xiao-ping, FEI Yi-qin, XIAO Ling, HOU Jun-jie, TU Qi-jun
Hubei Institute for Food and Drug Control, Wuhan 430064, China
Abstract: Objective Analysis for the differences of protein polypeptide ingredients in Zhenzhu Mingmu Eye Drops and Zhenzhuye
in order to provide the reference data to ensure the stability of production process of crude material and effectively control the quality
of Zhenzhu Mingmu Eye Drops. Methods Polypeptide ingredients in Zhenzhu Mingmu Eye Drops and Zhenzhuye were identified by
UPLC-Q-TOF MS in positive mode using an Acquity UPLC BEH C18 (50 mm × 2.1 mm, 1.7 μm) column. Mobile phase is
acetonitrile-0.1% methanol; Contents of 16 amino acids were detected by pre-column derivatization RP-HPLC method. Results
Molecular weight (MW) of polypeptide and the contents of the amino acids in Zhenzhu Mingmu Eye Drops and Zhenzhuye were
significantly different. In the five manufacturers, MW of polypeptide was less than 2 000 in Zhenzhuye samples from the three
manufacturers, while MW of polypeptides were 500—4 746 for samples of the other two manufacturers and MW of main polypeptides
were higher than 2 000. MW ranges of main polypeptides in Zhenzhu Mingmu Eye Drops from two manufacturers were 2 000—4 000
and beyond 4 000. There were not the polypeptides with MW beyond 4 000 in samples of the other five manufacturers. The content
percentages of 16 amino acids in Zhenzhu Mingmu Eye Drops from the seven manufacturers were obviously different. The mass
concentration ratios of proline and alanine in Zhenzhuye produced by acid/enzyme hydrolysis from two manufacturers are beyond 1.
For the other five manufacturers with water extract technique, the mass concentration ratios of proline and alanine are below 1.
Conclusion The quality standard of Zhenzhuye should be revised and water extract should be applied in preparation process to ensure
the effective ingredients polypeptides (500—5 000). In quality standard of Zhenzhu Mingmu Eye Drops and Zhenzhuye, the mass
concentration ratio of proline/alanine and the total contents of amino acids should be added as check and content determination items,
respectively, so as to effectively control the quality of Zhenzhu Mingmu Eye Drops and ensure its validity.
Key words: Zhenzhu Mingmu Eye Drops; Zhenzhuye; polypeptides; UPLC-Q-TOF MS; amino acid; RP-HPLC

收稿日期:2015-11-17
作者简介:丁晓萍,女,副研究员,主要从事中药质量控制新技术、新方法研究。E-mail: dxp2888@126.com
*通信作者 肖 凌,女,副主任药师,主要从事中药质量标准研究。E-mail: lingyun724@126.com

中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 6期 2016年 3月 ·912·
珍珠明目滴眼液主要由珍珠液和冰片配伍制
成,是国家食品药品监督管理局批准的二级中药保
护品种,收载于《中药成方制剂》第 17册,其主要
功能为清热泻火、养肝明目,主要用于肝虚火旺引
起视力疲劳症和慢性结膜炎,长期使用可以保护视
力[1-4]。珍珠液作为珍珠明目滴眼液的原料药,主要
有效成分为蛋白多肽。
目前,市售珍珠液的生产工艺主要有水直接提
取、酸/酶水解提取,提取方法的差异易造成珍珠液
中肽类成分的不同;珍珠液的现行标准中未明确生
产工艺,多肽类成分采用紫外分光光度(UV)法测
定总蛋白量,方法专属性差,难以鉴别珍珠液中的
肽,而且珍珠液的制备工艺不同亦会引起肽类成分
的差异。而珍珠明目滴眼液现行质量标准中关于蛋
白多肽类成分的控制仅有氨基酸的鉴别项。工艺的
不确定及质量标准的不专属,都无法保证制剂质量
的稳定。目前,HPLC-MS 技术已经被广泛用于各
种生物样品中各种肽的鉴定和测定[5-15],此外,采
用酸水解样品经异硫腈酸苯酯(PITC)柱前衍生
HPLC-UV 方法多用于中药制剂中蛋白类成分的定
量测定[16-19]。
因此,本研究采用 UPLC-Q-TOF MS鉴定不同
厂家珍珠明目滴眼液制剂及珍珠液中的多肽,柱前
衍生化 RP-HPLC 法测定滴眼液制剂中 16 种氨基
酸,通过肽的相对分子质量(MW)及氨基酸相对质
量浓度的百分比来比较不同生产企业产品中肽类成
分的差异,评价不同生产企业制剂及原料药生产工
艺,为确保原料药生产工艺的稳定性及有效地控制
珍珠明目滴眼液的质量提供参考依据。
1 仪器与材料
Ultimate-3000 高效液相色谱仪,Phenomenex
Gemini C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);Waters
Acquity UPLC-G2-Q-TOF 液质联用仪,Acquity
UPLC BEH C18(50 mm×2.1 mm,1.7 μm)色谱柱;
DHG-90738S-III型电热恒温鼓风干燥箱,天津市中
环实验电炉有限公司;Mettler Toledo XP205电子天
平;DELTA-320 pH 计;冷冻干燥机,上海合康实
业有限公司。
异硫氰酸苯酯(PITC),批号NG162899,Thermo
Scientific公司;乙腈为色谱纯;甲酸为电子级;葡
聚糖凝胶 G25,上海源叶生物科技有限公司;水为
双蒸水;乙腈、正己烷、三乙胺为色谱纯,无水醋
酸钠、醋酸、盐酸均为分析纯。
Waters 公司的 17 种氨基酸液体混合对照品溶
液(Waters公司,批号 50G187498),其中天冬氨酸
(Asp)、谷氨酸(Glu)、丝氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、
组氨酸(His)、精氨酸(Arg)、苏氨酸(Thr)、丙
氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、酪氨酸(Tyr)、缬氨
酸(Val)、蛋氨酸(Met)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸
(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、赖氨酸(Lys)浓度为 2.5
μmol/mL,胱氨酸(Cys)浓度为 1.25 μmol/mL。
5家生产企业的珍珠液各 1批及 7家生产企业
共 95批的珍珠明目滴眼液信息见表 1。

表 1 不同生产企业原料药及制剂
Table 1 Raw material and preparation from different
manufacturers
序号
珍珠液
(原料药)
珍珠明目滴眼液
(制剂)
制剂批数
1 A厂 A1(A厂产品) 10
2 B厂 B1(B厂产品) 20
3 C厂 -
4 D厂 D1(D厂产品) 19
5 E厂 E1(E厂产品) 20
6 - F厂 5
7 - G厂 3
8 - H厂 18

2 方法与结果
2.1 供试品溶液制备
2.1.1 珍珠液 取 5个厂家提供的珍珠液,经 0.22
μm的微孔滤膜滤过,直接质谱进样。
2.1.2 珍珠明目滴眼液 取 7个不同厂家的珍珠明
目滴眼液各 40 mL,冷冻干燥,获得固体粉末,采
用 1 mL水复溶,将样品过 G25凝胶柱,收集馏出
液,0.22 μm滤膜滤过,进样。
2.2 多肽分析方法
2.2.1 色谱条件 色谱柱为Acquity UPLC BEH C18
柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm);流动相为乙腈-0.1%
甲酸水溶液,梯度洗脱:0~50 min,1%~99%乙腈;
柱温 30 ℃;体积流量 0.2 mL/min;进样量为 2 μL。
2.2.2 质谱条件 ESI正负离子模式,锥孔电压 40
V,毛细管电压 2 600 V,离子源温度 100 ℃,脱溶
剂气温度 350 ℃,脱溶剂气体体积流量 600 L/h。
采集方式 MSE,采集时间 40 min。质量扫描范围
m/z 100~5 000。碰撞能量:低能量 6 V,梯度高能
量 20~30 V。碰撞气体:高纯氩气。

中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 6期 2016年 3月 ·913·
2.3 氨基酸分析方法
氨基酸测定方法采用柱前衍生化RP-HPLC法。
色谱条件、柱前衍生化方法,氨基酸混合对照品溶
液、供试品溶液及空白溶液的制备方法均参考郑丽
慧等[20]建立的方法。
2.4 珍珠液中多肽分析
从 5家企业珍珠液 UPLC-Q-TOF MS测定的基
峰离子流(base peak ion,BPI)图(图 1)中可看出,
5 家企业珍珠液的相同点为均明显可见肽类主要成
分峰(峰 1~4),但其量明显不同,从图 2(峰 1~
6 的 MS 图)中可得出峰 1 的 MW为 960、峰 2 的
MW为 1 093、峰 3的 MW为 772、峰 4的 MW为 986。
A和 B 2家企业的珍珠液与其他 3家企业生产的明
显不同,可见峰 5、6,此 2峰呈现多肽类成分簇状
峰,采用Mass Ent 3软件对此 2峰计算 MW,结果
显示,峰 5的MW约为 2 622、峰 6的MW约为 4 746。
按上述色谱峰的分析结果,对 5家企业珍珠液
中肽类成分的MW分布进行分析,并与其制备工艺相
对应,结果见表 2。研究结果表明,原料珍珠液存在
2 种明显不同的制备工艺,一种是直接水提,所得
肽类成分的 MW范围较广,多为多肽类成分;另一
种是酸、酶水解,多为寡肽,MW多在 1 000及以下。
2.5 珍珠明目滴眼液中多肽测定
从 7个厂家样品的 UPLC-Q-TOF MS测定的总
离子流色谱图(total ions chromatogram,TIC,图 3)
中可看出,各厂家样品中的肽类主要成分峰分为 3
个区域,其中 A1 和 F厂样品的肽类成分主要集中
在区域 2和 3,D1和 E1厂样品的肽类成分主要集
中在区域 1和 2,而另外 3个厂家 G、B1、H样品
则只在区域 2有肽类成分。



图 1 5家生产企业珍珠液的 BPI图
Fig. 1 BPI figures of Zhenzhuye from five manufacturers













图 2 峰 1~6的MS图
Fig. 2 Mass spectrograms of peaks 1—6

区域 1中不同保留时间(tR)峰的MS图见图 4。
tR在 5.416 min的肽 MW为 1 094;tR在 9.249 min的
肽 MW为 1 300。从图中可看出,此区域肽类成分的
MW在 1 000左右。
1
2
3 4
6
5
A厂
B厂
C厂
D厂
E厂
空白
0 5 10 15 20 25 30
t/min
峰 1
峰 2
峰 3
峰 4
峰 5
峰 6
500 1 000 1 500 2 000 2 500
m/z
1 000 2 000 3 000 4 000
m/z
500 600 700 800 900 1 000
m/z
500 600 700 800 900 1 000
m/z
500 600 700 800 900 1 000 1 100
m/z
500 600 700 800 900 1 000
m/z

中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 6期 2016年 3月 ·914·
表 2 5家生产企业珍珠液中多肽的MW
Table 2 MW of polypeptide in Zhenzhuye from five
manufacturers
样品
编号
生产
厂家
肽 MW分布
制备工艺
(企业提供)
1 A厂 519~4 746 水提
2 B厂 519~4 746 水提
3 C厂 597~872 酸、酶水解
4 D厂 532~1 093 酸、酶水解
5 E厂 525~1 303 酸、酶水解




图 3 7个厂家滴眼液的多肽 TIC图
Fig. 3 TIC spectra of polypeptide in eye drops from seven
manufacturers






图 4 区域 1中 tR 5.416 min (a) 和 tR 9.249 min (b) 肽的
MS图
Fig. 4 Mass spectrograms of peaks tR at 5.416 (a) and 9.249
min (b) in zone 1
区域 2中不同 tR峰的MS图见图 5。图中 tR为
18.379 min(c)、18.766 min(d)、21.235 min(e)、
21.673 min(f)的 4个峰均呈多肽类成分簇状峰。
区域 3中不同 tR峰的MS图见图 6。图中 tR为









图 5 区域 2中不同 tR峰的MS图 (c~f)
Fig. 5 Mass spectra of peaks at different tR (c—f) in zone 2







图 6 区域 3不同 tR峰MS图 (g~i)
Fig. 6 Mass spectra of peaks at different tR (g—i) in zone 3
2 3
1
A1
F
G
B1
H
D1
E1
空白
0 10 20 30 40
t/min
a
b
c
d
e
f
g
h
i
250 750 1 250 1 750
m/z
600 800 1 000 1 200 1 400 1 600
m/z
250 750 1 250 1 750
m/z
600 800 1 000 1 200 1 400 1 600
m/z
600 800 1 000 1 200 1 400 1 600
m/z
600 800 1 000 1 200 1 400 1 600
m/z
600 1 000 1 400 1 800
m/z
800 1 200 1 600
m/z
800 1 200 1 600
m/z

中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 6期 2016年 3月 ·915·
25.993 min(g)、27.099 min(h)、27.407 min(i)
的 3个峰均呈多肽类成分簇状峰。
采用Mass Ent 3软件对图 3中的 1、2、3区域
中峰的 MW进行计算,7 家生产企业的滴眼液中肽
类成分的 MW分布结果见表 3。

表 3 7个厂家滴眼液中肽类成分的MW
Table 3 MW of polypeptide in eye drops from seven
manufacturers
厂家
肽 MW
1区域
(5~10 min)
2区域
(17~22 min)
3区域
(25~30 min)
A1 665.6~1 169.2 1 975.7~4 793.6,量较高 8 534.8~9 814.8
F — 1 017.8~4 895.5,量较高 4 368.3~9 814.8
G — 1 017.8~4 895.5,量较低 —
B1 — 1 017.8~4 895.5,量较低 —
H — 1 017.8~4 895.5,量较低 —
D1 149.0~1 300.6 1 017.8~4 895.5,量较低 —
E1 149.0~1 094.5 1 017.8~4 895.5,量较低 —

2.6 珍珠液和珍珠明目滴眼液中的氨基酸测定
5 个生产企业提供的珍珠液经柱前衍生 RP-
HPLC法测定16种氨基酸分别占总氨基酸量百分比
的结果见表 4,16种氨基酸中 Gly百分比最高,其
他氨基酸百分比不同厂家不尽相同。95批不同厂家
的珍珠明目滴眼液中 16 种氨基酸占总氨基酸量百
分比的平均值结果见表 5,其中 Gly的百分比最高,
与珍珠液结果一致,但不同厂家之间的差异比珍珠
液中 Gly的差异显著。
将珍珠液和滴眼液中 Pro与 Ala的质量浓度测
定结果作比值分析,结果见图 7,图中 C、D、E厂
比值均大于 1,其中 D和 E厂珍珠液原料药制备工
艺来自 C生产厂家,生产企业提供的珍珠液制备工
艺为酸/酶水解提取工艺。而其他厂家的远低于 1,
采用水提取工艺。通过 Pro与 Ala质量浓度比值能
够对珍珠液的生产工艺进行区分。
3 讨论
通过 UPLC-Q-TOF MS测定不同厂家珍珠液原
料药和滴眼液制剂中多肽类成分的 MW,发现不同
厂家样品间差异较大。一般肽中含有的氨基酸的数
目为 2~9,根据肽中氨基酸数量的不同,肽通常被
命名为二肽到九肽。MW段在 50~1 000 的称为小
肽、寡肽、低聚肽,也称为小分子活性多肽。由 10~
100氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫多肽,MW
表 4 5家生产企业珍珠液中各氨基酸占总氨基酸量百分比
Table 4 Percentages of every amino acid to total content of
16 amino acids in zhenzhuye from 5 manufacturers
氨基酸
占比/%
A B C D E
Asp 5.451 2.835 4.087 0.925 1.784
Glu 7.451 11.339 8.456 4.311 6.762
Ser 8.418 3.622 5.691 4.450 2.096
Gly 26.440 23.858 26.589 26.022 30.785
His 0.857 0.787 0.797 0.731 0.508
Arg 7.604 11.181 8.052 12.590 14.719
Thr 2.110 1.811 2.220 2.572 1.204
Ala 11.560 15.906 8.809 11.563 9.911
Pro 3.670 10.157 10.030 14.561 14.264
Tyr 4.044 0.945 1.090 1.138 1.365
Val 3.648 2.756 3.592 3.414 1.525
Met 2.330 2.677 2.311 2.294 0.865
Ile 5.429 1.417 6.206 1.952 2.007
Leu 4.220 3.622 2.119 4.496 0.955
Phe 5.802 2.283 3.401 2.997 5.085
Lys 0.989 4.803 6.599 6.013 6.146

表 5 7家生产企业滴眼液中各氨基酸占总氨基酸量百分比
Table 5 Percentages of every amino acid to total content of
16 amino acids in eye drops from seven manufacturers
氨基酸
占比/%
A1 F G B1 H D1 E1
Asp 2.330 3.718 6.832 1.947 3.839 1.263 0.929
Glu 3.224 1.007 7.047 3.012 2.448 3.780 3.214
Ser 9.745 5.728 4.963 7.687 7.364 3.307 3.375
Gly 28.838 34.407 25.028 20.439 25.347 50.718 46.631
His 2.388 2.101 1.944 6.488 4.506 0.836 0.766
Arg 6.418 6.531 9.139 8.687 5.591 8.434 8.208
Thr 2.258 2.995 1.698 4.968 4.084 1.430 1.384
Ala 12.602 6.004 8.261 9.879 15.673 8.062 8.384
Pro 4.462 4.167 3.624 6.918 4.574 10.429 11.604
Tyr 4.260 9.633 5.828 5.910 3.678 0.870 0.974
Val 3.197 3.264 2.758 3.359 2.270 1.833 2.530
Met 0.886 0.181 0.966 0.925 0.246 0.470 0.455
Ile 2.131 2.718 1.754 1.579 1.865 0.881 1.269
Leu 6.042 9.844 10.081 5.127 7.258 2.435 3.100
Phe 7.200 4.979 5.415 8.050 7.373 1.851 2.309
Lys 4.019 2.722 4.663 5.026 3.883 3.401 4.869

中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 6期 2016年 3月 ·916·


图 7 不同厂家珍珠液和滴眼液中 Pro与 Ala质量浓度比值
Fig. 7 Content ratios of proline/alanine in Zhenzhuye and
eye drops from different manufacturers

段在 5 000~10 000,能透过半透膜;由 50个以上
的氨基酸组成的肽就称为蛋白质,蛋白质有时也被
称为多肽。眼球视网膜上的视紫质由蛋白质组成,
蛋白质缺乏,可导致视紫质合成不足,进而出现视
力障碍。可见,滴眼液中的多肽对眼睛起着重要的
保护作用。多肽的 MW分布测定结果表明,不同企
业的滴眼液中含高 MW多肽的 2个厂家 A1和 F厂
的样品质量较好。
氨基酸测定结果表明,Pro 与 Ala 质量浓度的
比值可用于区分珍珠液的不同制备工艺,目前珍珠
液的生产工艺主要有水直接提取、酸/酶水解提取,
Pro/Ala<1为水直接提取工艺,Pro/Ala>1为酸/酶
水解工艺。结合多肽分析结果,水直接提取工艺制
备珍珠液,其肽类成分 MW段在 500~5 000,较易
通过眼球半透膜,可保证滴眼液制剂质量的有效性。
通过本研究,建议修订珍珠液质量标准,明确
制备工艺为水直接提取,珍珠液及珍珠明目滴眼液
质量标准增加Pro与Ala质量浓度的比值为检查项,
总氨基酸测定为定量测定项,以有效控制珍珠明目
滴眼液的质量,确保其质量的稳定性和有效性。
参考文献
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滴眼液
珍珠液
1.6


1.2


0.8


0.4


0.0
Pr
o

A
la







A厂 B厂 C厂 D厂 E厂 F厂 G厂 H厂
区别珍珠液提取
工艺的临界值