全 文 ：道[ 3 ,4 ] ,采用甲醇21 %冰醋酸 (30 ∶70) ,金丝桃苷和
芦丁保留时间分别约为 21、22 min ,但本品采用该
色谱条件时 ,两者不能达到基线分离 ,为使其达到完
全分离的目的 ,实验对流动相甲醇与 1 %冰醋酸的
比例进行了筛选 ,甲醇与 1 %冰醋酸的比例分别为
30 ∶70、29 ∶31 及乙腈与冰醋酸的比例为 20 ∶80
时 ,样品中金丝桃苷和芦丁均不能达到基线分离 ,最
终确定甲醇与 1 %冰醋酸的比例为 28 ∶72 时 ,两者
的分离度达到了 115 ,采用 HPL C2二极管阵列检测
器检测峰纯度为 01999 ,理论板数分别为 4 805、
4 228 ,保留时间分别约为 37、40 min。
313 　提取方法的研究 :采用乙醇和 70 %乙醇加热 回流 30 min 的方法处理样品 ,发现安神颗粒的70 %乙醇溶液黏度大 ,不易滤过 ,而乙醇溶液色谱峰形不理想。另外取本品加甲醇分别采用加热回流30 min、超声处理 20、30 min 进行测定 ,测定结果无明显差异 ,因此选择超声 20 min 处理样品。参考文献 :[ 1 ] 　万德光 ,裴　瑾 ,严铸云 ,几种金丝桃属药用植物的金丝桃苷含量测定[J ]1中药材 ,2004 ,27 (6) :39723981[ 2 ] 　许乾丽 ,熊慧林 ,芧向军1 黔产 3 种金丝桃属植物药中金丝桃苷的含量测定[J ]1药物分析杂志 ,2003 ,23 (6) :41424171[ 3 ] 　Wu Y , Zhou S D , Li P1 Drtermination of flavonoids in H y2pericum per f oratum by HPLC analysis [J ]1 A cta Pharm S in ,2002 , 37 (4) : 28022821[ 4 ] 　黄琴伟 ,张文婷 ,赵维良1 HPLC 法测定鱼腥草不同生长季节、不同药用部位中黄酮类成分 [J ]1 中草药 ,2007 ,38 (8) : 1253212551
热毒宁注射液中细菌内毒素的测定研究
刘 　涛1 ,2 ,萧 　伟1 ,王振中1 ,万德光2 ,彭国平3 ,王永香1 3
(11 江苏康缘药业股份有限公司 ,江苏 连云港 　222001 ;21 成都中医药大学 ,四川 成都 　610075 ;
31 南京中医药大学 ,江苏 南京 　210046)
摘 　要 :目的 　对热毒宁注射液进行细菌内毒素定量检查试验 ,建立定量检测热毒宁注射液中细菌内毒素的试验
方法。方法 　采用《中国药典》2005 年版二部附录检测细菌内毒素的动态浊度法。结果 　热毒宁注射液在稀释至
120 倍时用细菌内毒素定量法检测无干扰因素影响 ,内毒素回收率在 50 %～200 %。结论 　使用动态浊度法可以
高效地测定热毒宁注射液的细菌内毒素。
关键词 :热毒宁注射液 ;细菌内毒素 ;动态浊度法 ;干扰试验
中图分类号 :R286102 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2009) 1021585203
　　热毒宁注射液主要组成药味为青蒿、栀子、金银
花 ,具有清热、疏风、解毒之功效 ,临床用于上呼吸道
感染 (外感风热症) 所致的高热、微恶风寒、头身痛、
咳嗽、痰黄等症 ,其疗效显著。热毒宁注射液质量标
准中对注射剂采用家兔法进行热原检查 ,但家兔法
进行热原检查操作复杂 ,时间长。根据细菌内毒素
定量检测方法 (动态浊度法)具有灵敏度高、快速、准
确、操作简便等优点 ,本实验按《中国药典》2005 年
版二部附录的细菌内毒素法及其应用指导原则建立
热毒宁注射液细菌内毒素定量检测方法 ,确保临床
用药安全。
1 　仪器与材料
　　B ET —16M 细菌内毒素测定仪 (天津市天大天
发科技有限公司) ;涡旋混合器 (天津天大天发科技
有限公司) ; FZQ —2 型涡旋混合器 (江苏泰县医疗
器械厂) 。
　　鲎试剂 (批号 0812062 ,λ= 0103 EU/ mL ,规格
016 mL/ Amp ,湛江博康海洋生物有限公司) ;细菌
内毒素工作标准品 (批号 150601220086 , 160 EU/
Amp ,中国药品生物制品检定所) ;细菌内毒素检查
用水 (批号 080320 ,规格 5 mL/ Amp ,湛江博康海洋
生物制品有限公司) 。热毒宁注射液由江苏康缘药
业股份有限公司生产。
2 　方法和结果
211 　细菌内毒素细菌内毒素限值 (L ) 的确定 :按
《中国药典》2005 年版二部附录可知人每千克每小
·5851·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 10 期 2009 年 10 月
3 收稿日期 :2009203212　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :国家科技攻关项目 (2004BA721A42)
作者简介 :刘　涛 (1976 —) ,男 ,四川南充人 ,高级工程师 ,成都中医药大学在读博士 ,研究方向为中药品种、质量及资源开发研究 ,已在
各类核心期刊发表论文 15 篇 ,曾荣获江苏省科技进步二等奖、连云港市科技进步特等奖等 8 项市级以上奖励 ,享受连云港市
政府特殊津贴。Tel : (0518) 85521943 　E2mail :liutao0578 @sina1com3 通讯作者　王永香　Tel : (0518) 85521933
时最大能承受细菌内毒素的量为 5 EU/ ( kg ·h) ,
人均体质量按 60 kg 计算 ,则人体最大能承受细菌
内毒素的量为 5 ×60 = 300 EU/ ( kg ·h) ,根据《中
国药典》2005 年版二部得 019 %氯化钠注射液和
5 %葡萄糖注射液中细菌内毒素不得大于 015 EU/
mL ,则 250 mL 019 %氯化钠注射液和 5 %葡萄糖注
射液中含细菌内毒素限值为 015 ×250 = 125 EU ,则
热毒宁注射液中细菌内毒素限值 (L ) 为 ( 300 -
125) / 20 = 8175 EU/ mL 。
212 　标准曲线的可靠性试验 :用细菌内毒素检查用
水对细菌内毒素标准品溶解 ,并稀释至最终浓度为
210、015、01125、01031 25 EU/ mL 的溶液。各取 011
mL 分别加到预先装有复溶的 011 mL 鲎试剂反应管
内 ,混合均匀 ,进行检测 ,同时设阴性对照管 ,其中每
一浓度重复 3 管 ,检测时间设定为 3 600 s ,见表 1 ,得
回归方程 lg T = 31065 5 - 01244 lg C, r = - 01998 5 ,
最低内毒素检测浓度λ1 = 01031 25 EU/ mL ,空白对
照管在规定检测时间外 ,内毒素标准曲线成立。
表 1 　标准曲线的可靠性试验
Table 1 　Reliability of standard curve
样品溶液/
( EU ·mL - 1)
反应时间/ s
实测内毒素浓度/
( EU ·mL - 1)
变异系数
0 > 3 600 0
> 3 600 0
> 3 600 0
210 997 11858 7 0125
　1 002
　1 000
015 　1 368 01527 4 0163
　1 359
　1 351
01125 　1 833 01139 9 2153
　1 867
　1 928
01312 5 　2 904 01028 5 4154
　2 654
　2 755
213 　干扰预试验
21311 　供试品最大有效稀释倍数 ( MVD) 的计
算[ 1 ] :按 MVD = C L/λ1 计算 ,式中 C 为供试品的溶
液浓度 ,其中当 L 以 EU/ mL 表示时 ,C 为 110 mL/
mL ,L 为供试品的内毒素限值 (为 817510 EU/ ml) ,
λ1 为标准曲线的最低浓度 01031 25 EU/ mL ,计算
得供试品的 MVD 为 280 倍。
21312 　供试品溶液的预干扰试验 :将热毒宁注射液
用细菌内毒素检查用水依次稀释为 15、30、60、120、
240 倍 ,每个倍数两个平行样 ,记为 Ai 液 ;同时另取
5 管 ,进行同样倍数稀释 ,并在稀释液中添加近中点
内毒素浓度λm 为 015 EU/ mL 的细菌内毒素标准
液 ,作为供试品阳性对照管 ,记为 Bi 液。分别取上
述各液 011 mL 加入预先加有 011 mL 鲎试剂溶液的
反应管内 ,混匀后立刻插入浊度仪内进行检测 ,其中
每个浓度重复 2 管 ,计算回收率[回收率 = (Bi 液内毒
素浓度值 - Ai 液内毒素浓度值) /λm ×100 %] ,结果见
表 2。可见 60、120、240 稀释倍数下的热毒宁注射液
添加内毒素的回收率均在 50 %～200 % ,为了得到更
好的回收率 ,干扰试验时选用 120 倍稀释液。
表 2 　热毒宁注射液干扰预试验结果
Table 2 　Determination of pre2interference test
of Reduning Injection
稀释液倍数
内毒素浓度/ ( EU ·mL - 1)
A i Bi
回收率/ %
15 < 01031 25 0 0
30 < 01031 25 01 095 3 19
60 < 01031 25 01 044 42 88
120 < 01031 25 01 677 135
240 < 01031 25 01 717 5 143
21313 　供试品溶液的干扰试验 :取 7 批热毒宁注射
液 ,细菌内毒素检查用水分别稀释 120 倍 ,另取 7 管
进行同样倍数稀释 ,并在稀释液中添加近中点内毒
素浓度λm 为 01 5 EU/ mL 的细菌内毒素标准溶液 ,
作为供试品阳性对照管。同时制备内毒素标准曲线
各浓度系列 ,分别取上述各液 011 mL 加入预先加
有 011 mL 鲎试剂溶液的反应管内 ,混匀后立刻插
入浊度仪内进行检测 ,其中每 1 浓度重复 2 管 ,结果
见表 3。结果表明 :热毒宁注射液中的内毒素均在
检测限以下 ,且添加内毒素回收率均在 50 %～
200 % ,表明热毒宁注射液在稀释 120 倍时 ,检测已
完全排除了干扰因素影响。且实测内毒素值也恰在
选用细菌内毒素标准曲线以内 ,故热毒宁注射液的
日常检验取 120 倍稀释液即可。
表 3 　热毒宁注射液干扰试验结果
Table 3 　Determination of interference test
of Reduning Injection
批　号
内毒素浓度/ ( EU ·mL - 1)
120 倍液 120/λm 液
回收率/ %
080309 < 01031 25 01 704 9 139
080501 < 01031 25 01 953 4 190
080601 < 01031 25 01 966 8 193
080701 < 01031 25 01 456 0 91
080801 < 01031 25 01 906 8 181
080905 < 01031 25 01 965 2 193
081005 < 01031 25 01 943 5 188
214 　供试品的检测 :按上述细菌内毒素定量测定法
规定方法 ,按 8175 EU/ mL 内毒素限值对 11 批热
·6851· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 10 期 2009 年 10 月
毒宁注射液在稀释 120 倍时进行内毒素定量检测 ,
同时与热原检查法进行对比试验 ,结果见表 4。
表 4 　热毒宁注射液细菌内毒素的检测结果
Table 4 　Determination of endotoxin in Reduning Injection
样品
批号
阴性对照反
应时间/ s
120 倍液反
应时间/ s
变异系
数/ %
实测内毒素/
( EU ·mL - 1 )
原液/
( EU ·mL - 1 )
热原检
测结果
080309 > 3 600 　3 184 41 19 01 012 8 　11 536 合格
080501 > 3 600 > 3 600 — — < 检测限 合格
080502 > 3 600 　3 123 21 40 01 018 1 　21 172 合格
080601 > 3 600 > 3 600 — — < 检测限 合格
080610 > 3 600 > 3 600 — — < 检测限 合格
080701 > 3 600 > 3 600 — — < 检测限 合格
080801 > 3 600 > 3 600 — — < 检测限 合格
080809 > 3 600 > 3 600 — — < 检测限 合格
080901 > 3 600 > 3 600 — — < 检测限 合格
080905 > 3 600 > 3 600 — — < 检测限 合格
081005 > 3 600 > 3 600 — — < 检测限 合格
3 　讨论
干扰试验结果表明热毒宁注射液用定量鲎试剂检测
在稀释 1～30 倍出现干扰 ,以致无法检测 ,将样品稀
释至 60 倍时 ,方可完全排除干扰因素影响 ,内毒素
回收率在 50 %～200 %。根据表 3 可得热毒宁注射
液的日常检验取 120 倍稀释液即可。
　　对 10 批热毒宁注射液中的内毒素定量检测表
明 ,热毒宁注射液内毒素实际检测值均远远低于限
值 (8175 EU/ mL) ;表明热毒宁注射液在生产过程
中未被污染 ,较为安全。
　　中药注射剂由于组分较复杂 ,干扰因素多 ,加之
原药材和制备工艺的变化使干扰因素变化不定 ,在
用本法测定内毒素时 ,应同时进行加样加收考察以
排除可能因素对实验结果的干扰。
HPLC法测定板蓝根和板蓝根颗粒中 RS2告伊春和腺苷
王钢力1 ,聂黎行1 ,迟玉明2 ,姚令文1 ,刘 　莹2 ,刘丽丽 3 ,张晓兰2 ,林瑞超1
(11 中国药品生物制品检定所 ,北京 　100050 ;21 北京同仁堂科技发展股份公司 ,北京 　100075)
摘 　要 :目的 　建立板蓝根颗粒及药材中腺苷和 RS2告伊春的测定方法。方法 　RS2告依春的测定采用 Dikma Dia2
monsil C18色谱柱 (200 mm ×416 mm ,5μm) ;流动相 :乙腈2水2三乙胺 (10 ∶90 ∶012 ,用冰醋酸调 p H 值 512) ;柱温 :
室温 ;体积流量 :018 mL/ min ;检测波长 :245 nm ;腺苷的测定采用 Dikma Diamonsil C18色谱柱 (200 mm ×416 mm ,5
μm) ;流动相 :乙腈2水 (5 ∶95) ;柱温 :室温 ;体积流量 :110 mL/ min ;检测波长 :260 nm。结果 　RS2告依春的线性范
围为 01676～1311μg/ mL ;板蓝根颗粒和药材的平均回收率分别为 101166 %、99174 % ,RSD 分别为 019 %、114 %
( n = 6) ;腺苷的线性范围分别 01005～0105 mg/ mL ,板蓝根颗粒和药材的平均回收率分别为 97176 %、97132 % ,
RSD 分别为 1162 %、0162 %( n = 6) 。结论 　所建立的方法准确、可靠 ,可用于板蓝根颗粒及药材的质量控制。
关键词 :板蓝根 ;板蓝根颗粒 ;RS2告依春 ;腺苷 ;高效液相色谱
中图分类号 :R286102 　　　文献标识码 :B 　　　文章编号 :025322670 (2009) 1021587203
　　板蓝根为十字花科植物菘蓝 Isatis i ndi gotica
Fort1 的干燥根 ,含有生物碱类、核苷类、氨基酸类
及有机酸类成分 ,具有清热解毒、凉血利咽之功效 ,
主要用于瘟毒发斑、舌绛紫暗、大头瘟疫、痄腮、烂喉
丹痧、丹毒、痫肿等症。《中国药典》2005 年版一部
板蓝根项下仅有以精氨酸为对照的薄层色谱鉴别和
性状鉴别项。现有的板蓝根制剂包括颗粒剂、茶剂、
片剂、注射剂、糖浆剂等多种剂型 ,其中板蓝根颗粒
是《中国药典》2005 年版一部收载品种 ,仅收载了理
化鉴别和检查项。现代药理研究表明 :板蓝根中的腺
苷具有抗炎作用 ,还可用于冠心病诊断 ,具有较高的
敏感性和特异性[1 ] ; RS2告依春具有明显的抗流感病
毒作用[2 ] 。因此本实验建立了高效液相色谱法 ,分别
测定腺苷和专属性成分 RS2告依春 ,为板蓝根制剂及
其原料质量标准的修订与完善和制剂生产的过程控
制提供了可供借鉴的检测手段和科学依据。
1 　仪器与试药
　　Waters 269522487 HPL C 色谱系统 , Empower
色谱工作站。
　　乙腈 (Merck)为色谱纯 ,水为超纯水 ,其他试剂
均为分析纯。RS2告依春对照品、腺苷对照品均由
中国药品生物制品检定所提供 ;板蓝根颗粒 (含糖型
·7851·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 40 卷第 10 期 2009 年 10 月
3 收稿日期 :2009201228　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :北京市科技计划项目 ( H30230130011)
作者简介 :王钢力 (1969 —) ,女 ,北京人 ,研究员 ,2001 年毕业于北京中医药大学 ,获博士学位 ,从事有关中药活性成分及质量控制的研
究工作。Tel : (010) 67095424 　E2mail :dunneer @163. com3 桂林医学院 2004 级药学本科实习生