全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 8 期 2013 年 4 月

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紫苏及其变种的分子鉴定和亲缘关系研究
夏 至 1，李贺敏 1，张红瑞 1，李家美 2，高致明 1*
1. 河南农业大学农学院，河南 郑州 450002
2. 河南农业大学生命科学学院，河南 郑州 450002
摘 要：目的 构建紫苏属种、变种之间系统发育关系，准确鉴别紫苏 Perilla frutescens var. arguta、白苏 P. frutescens 与其
他变种。方法 提取紫苏、白苏及其他变种的 DNA，对 ITS 和 psbA-trnH 序列扩增和测序，计算物种种内（变种内）种间
（变种间）Kimura 2-parameter（K2P）遗传距离。采用最简约法（MP）和邻接法（NJ）构建分子系统树，进行系统发育和鉴
定分析。结果 ITS 和 psbA-trnH MP 系统树显示白苏和紫苏的不同地域的样本聚为一单系分支（支持率为 100%和 93%），
紫苏与回回苏构成姐妹群分支（支持率为 95%和 90%），野生紫苏和耳齿紫苏构成一单系分支（支持率为 100%和 90%）；白
苏、紫苏与其他变种间的 ITS 和 psbA-trnH 序列遗传距离 0.008 21～0.018 18 和 0.002 38～0.029 31，明显大于白苏与紫苏间
遗传距离 0～0.001 65 和 0，大于各变种内遗传距离。结论 白苏和紫苏合并为一个种紫苏；紫苏与回回苏亲缘关系最近，
野生紫苏与耳齿紫苏亲缘关系最近；ITS 和 psbA-trnH 序列可以准确鉴别紫苏与其他变种。
关键词：紫苏属；紫苏；ITS；psbA-trnH；鉴定
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2013)08 - 1027 - 06
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2013.08.021
Molecular authentication and phylogenetic relationship of Perilla frutescens
and its varieties
XIA Zhi1, LI He-min1, ZHANG Hong-rui1, LI Jia-mei2, GAO Zhi-ming1
1. Agronomy College of Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China
2. College of Life Sciences, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China
Abstract: Objective In order to investigate the phylogenetic relationship of Perilla frutescens and its varieties, and to identify P.
frutescens and its varieties in Perilla L. Methods Total genomic DNA was isolated from P. frutescens and its varieties. Nuclear DNA ITS
and chloroplast gene psbA-trnH sequence were amplified and sequenced. The inter- and intra-specific Kimura 2-Parameter (K2P)
distances were calculated. Phylogenetic analyses including Maximum Parsimony (MP) and Neighbor-Joining (NJ) of nuclear DNA (ITS)
and chloroplast gene psbA-trnH sequences were conducted individually. Results The MP tree (ITS and psbA-trnH) indicated that the
different geographical population of P. frutescens and P. frutescens var. arguta formed a monophyletic clade [bootstrap (BS) = 100% and
93%], which was a sister branch to P. frutescens var. crispa (BS = 95% and 90%). Wild P. frutescens var. purpurascens and P. frutescens
var. auriculato-dentata formed a monophyletic clade (BS = 100% and 90%). The inter-specific genetic distances (ITS and psbA-trnH) of
P. frutescens, P. frutescens var. arguta, and other varieties were 0.008 21—0.018 18 and 0.002 38—0.029 31, which were obviously
higher than those of P. frutescens and P. frutescens var. arguta at 0—0.001 65 and 0, and were higher than intra-specific genetic distances
of each other variety. Conclusion P. frutescens and P. frutescens var. arguta should be classified into one species. P. frutescens is
relatively closed to P. frutescens var. crispa. The closest relationship is found between wild P. frutescens var. purpurascens and P.
frutescens var. auriculato-dentata. ITS and psbA-trnH are two efficient barcodes for the identification of P. frutescens and its varieties.
Key words: Perilla L.; Perilla frutescens (Linn.) Britt.; ITS; psbA-trnH; authentication

唇形科（Labiatae）紫苏属 Perilla L. 植物作为
传统的药、油、菜、香料兼用作物在我国广泛栽培，
具有多方面开发利用价值[1]。《中国药典》2010 年版
中紫苏Perilla frutescens (Linn.) Britt. 入药部位以茎、

收稿日期：2012-10-29
基金项目：科技部国家星火计划项目（2012GA750004）；国家自然科学基金面上项目（31070171，31270236）
作者简介：夏 至（1974—），男，讲师，博士，研究方向为中药资源及分子鉴定。
Tel: (0371)63554995 Fax: (0371)63554995 E-mail: xiazhiemail@126.com
*通信作者 高致明，教授，主要从事中药资源的规范化种植研究。E-mail: gaozhiming672@sohu.com
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叶及种子为主，具止痛、安胎、解表散寒、行气
和胃、降气化痰、润肠通便的功效，主治胸隔痞
闷、胎动不安、风寒感冒、妊娠呕吐、咳嗽气短
和肠躁便秘[2]。紫苏属下变种等级划分和变种数目
一直存在争议，《中国药用植物志》[3]记载紫苏属有
1 个种白苏 P. frutescens (L.) Britt. 和 1 个变种紫苏
P. frutescens var. arguta (Thunb.) Hand. -Mazz.。《中
国植物志》[4]认为白苏和紫苏在形态上变异（如叶、
花颜色的差异等）因栽培原因引起，将二者合并为
1 个种紫苏 Perilla frutescens (Linn.) Britt.，此外，紫
苏属还包括 3 个变种，野生紫苏 P. frutescens var.
purpurascens (Hayata) H. W. Li、回回苏 P. frutescens
var. crispa (Thunb.) Hand. -Mazz.[5]和耳齿紫苏 P.
frutescens var. auriculato-dentata C. Y. Wu. et Hsuan
ex H. W. Li[6]。近年来，部分学者依据植物形态结
构、种子显微特征、挥发油化学成分、花粉及同
工酶分析等特征，支持白苏和紫苏独立分开，将
紫苏作为白苏的 1 个变种[7-11]。至此，紫苏属有 1
个种 4 个变种，即白苏（包括原变种）、紫苏、野
生紫苏、回回苏和耳齿紫苏。由于长期的引种栽
培，紫苏属植物在我国生态适应幅度大，种下变
种的形态特征极为相似[5]，且这些形态特征易受
地理环境、生长发育时期的影响，从而影响鉴定
的准确性，造成传统鉴定困难，常有混淆现象，直
接影响到临床用药的安全。因此，对紫苏属植物
开展分子鉴定研究，构建属下种、变种间系统发
育关系，用分子数据验证白苏和紫苏的分类地位，
找到快速准确鉴定药材紫苏与其变种的方法是非
常必要的。
近年来，中药分子鉴定主要集中在核酸序列分
析的 DNA 条形码鉴定技术[12]，DNA 条形码技术
（DNA barcoding）为中药材物种亲缘关系及鉴定研
究提供了方便快捷的方法。DNA 条形码技术是利用
标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的 DNA
片段对物种进行快速的自动鉴定[13]，克服传统分类
学鉴定方法的诸多缺陷。目前，药用植物的 DNA
条形码鉴定研究得到快速发展，广泛应用于多个科
属的药用植物及药材鉴定[14-19]。刘美子等[20]认为中
药材物种分子鉴定和亲缘关系研究应根据研究问题
选择适当 DNA 条形码序列。本研究选用核基因 ITS
片段和叶绿体基因 psbA-trnH 片段被广泛应用于药
用植物属下种间及种下较低分类阶元的分子鉴定和
亲缘关系研究[21-23]。通过对上述基因片段扩增、测
序、并应用 DNA 条形码技术对紫苏属 1 种 4 变种
进行分析，探讨紫苏属属下种、变种之间的亲缘关
系，用分子数据验证白苏和紫苏的分类地位，旨在
为紫苏属药用植物的快速鉴定找到可行的方法。
1 材料与方法
1.1 材料
材料收集包括紫苏属 1 个种白苏，4 个变种紫
苏、野生紫苏、回回苏和耳齿紫苏。样品采自河南、
河北、江苏、广西、湖北和安徽。实验材料由中国
科学院植物研究所系统与进化植物学国家重点实验
室王印政研究员鉴定，凭证标本保存于河南农业大
学。实验材料来源于植物新鲜叶片，经变性硅胶快
速干燥后保存于−80 ℃冰箱，详细信息、GenBank
登录号及下载序列见表 1。
1.2 方法
1.2.1 样品 DNA 的提取、扩增和测序 采用改良
后 CTAB 法[24]提取样品总 DNA，ITS 序列的扩增使
用由 Wendel 等[25]设计的引物 ITS1（5’-AGAAGT-
CGTAACAAGGTTTCCGTA-3’）和 ITS4（5’-TCCT-
CCGCTTATTGATATGC-3’）；psbA-trnH 序列的扩增
使用 DNA 条形码通用引物，引物由上海生工生物工
程技术服务有限公司合成。PCR 反应条件及扩增程
序参考 Xia 等[26]和 Kress 等[27]的研究。PCR 产物用
上海生工 UNIQ-10 PCR 产物纯化试剂盒纯化后直
接用于测序，纯化产物送到北京六合华大基因科技
股份有限公司，用 ABI 3730X 测序仪（Applied
Biosystems Co.，美国）进行双向测序。
1.2.2 数据处理 测序所得的峰图采用 CodonCode
Aligner V3.0（CodonCode Co.，USA）对序列峰图进
行校对拼接，去除引物区和低质量的序列，利用软
件 PAUP* version 4.0b10[28]构建简约（Maximum
Parsimony，MP）和邻接（Neighbor-Joining，NJ）系
统发育树，利用 Bootstrap（BS）（1 000 次重复）检
验各分支的支持率。对紫苏属种及其变种之间亲缘
关系进行分析，并计算物种种内（变种内）、种间（变
种间）Kimura 2-parameter（K2P）遗传距离，应用
NJ 树对紫苏属种及其变种进行鉴定分析。
2 结果
2.1 ITS 序列信息、序列种内（变种内）和种间（变
种间）变异分析
紫苏属 1 个种及其 4 个变种的 PCR 及测序成功
率均为 100%。5 个物种的 ITS 序列长度为 616～617
bp，其中 ITS1 序列长度为 224 bp，5.8 S 为 158 bp，
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表 1 样品来源
Table 1 Sources of samples
GenBank 号 编号 样品 来源
ITS psbA-trnH
1 内类群 白苏 Perilla frutescens 河南郑州 KC011244 KC011255
2 白苏 河北巨鹿 KC011245 KC011256
3 白苏 GenBank JF708208 FJ528996
4 白苏 GenBank FJ606749
5 白苏 GenBank AF477785
6 白苏 GenBank DQ667246
7 白苏 GenBank DQ471339
8 白苏 GenBank DQ471340
9 紫苏 P. frutescens var. arguta 河南郑州 KC011246 KC011257
10 紫苏 河北巨鹿 KC011247 KC011258
11 紫苏 江苏南京 KC011248 KC011259
12 回回苏 P. frutescens var. crispa 广西南宁 KC011249 KC011260
13 回回苏 广西南宁 KC011250 KC011261
14 回回苏 GenBank DQ471342
15 野生紫苏 P. frutescens var. purpurascens 广西金秀 KC011253 KC011264
16 野生紫苏 广西环江 KC011254 KC011265
17 耳齿紫苏 P. frutescens var. auriculato-dentata 湖北建始 KC011251 KC011262
18 耳齿紫苏 安徽巢湖 KC011252 KC011263
19 耳齿紫苏 GenBank DQ471343
20 外类群 二蕊紫苏 Collinsonia canadensis GenBank DQ667248 DQ667358
21 罗勒 Ocimum basilicum GenBank DQ667240 DQ667350

ITS2 序列长度为 234～235 bp。河南、河北和江苏取
样的白苏 2 个样本和紫苏 3 个样本与 GenBank 下载
的 4 个白苏的 ITS 序列同源性高达 100%。种内（变
种内）种间（变种间）K2P 遗传距离结果显示，ITS
序列在各变种内不同样本间的遗传距离为 0，白苏种
内不同样本间的遗传距离为（0～0.001 65），白苏和
紫苏的不同样本间遗传距离也为（0～0.001 65），不
能将种白苏和变种紫苏区分开。但白苏、紫苏与其
他各变种间序列变异较大，白苏、紫苏与其他变种
间的 ITS 序列遗传距离 0.008 21～0.018 18，明显大
于白苏与紫苏间遗传距离 0～0.001 65，大于各变种
内遗传距离 0，因此，核基因 ITS 序列片段可以用作
紫苏、白苏与其他变种的分子鉴定。
2.2 psbA-trnH 序列信息、序列种内及种间变异分析
紫苏属 1个种及其 4个变种的 PCR及测序成功
率均为 100%。5 个物种的 psbA-trnH 序列长度为
435～436 bp，在河南、河北和江苏取样的白苏 2 个
样本和紫苏 3 个样本与 GenBank 下载的 1 个白苏的
psbA-trnH 序列同源性高达 100%。耳齿紫苏与其他
变种在 116 bp 存在一个 T-A 的变异。耳齿紫苏、野
生紫苏与紫苏、白苏和回回苏在 131～150 bp，共有
10 个碱基的变异。回回苏与其他变种在 295 bp 处有
一个 G-A 的突变。种内（变种内）种间（变种间）
K2P 遗传距离结果显示，psbA-trnH 序列在种内（变
种内）不同样本间，及白苏和紫苏变种间的遗传距
离均为 0，不能将种白苏和变种紫苏区分开。但白苏、
紫苏与其他各变种间序列变异较大，白苏、紫苏与
其他变种间的 psbA-trnH 序列遗传距离 0.002 38～
0.029 31，明显大于白苏与紫苏间，各变种内遗传距
离 0。因此，叶绿体基因 psbA-trnH 序列片段可以用
作紫苏、白苏与其他变种的分子鉴定。
2.3 紫苏属属下种、变种邻接系统发育树的鉴定
本实验应用 PAUP version 4.0b10 构建紫苏属的
ITS、psbA-trnH 序列的 NJ 系统发育树（图 1、2）。
外类群选择与紫苏属近缘的二蕊紫苏属 Collinsonia
L. 和罗勒属 Ocimum L.[29]。从 NJ 树可以看出，ITS
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分支上部和下部数值表示 NJ 和 MP 分析 BS 分析对该分支
的支持强度（＞50%），下同
BS values of NJ and MP (> 50%) are shown above and below
branches, same as below
图 1 基于 NJ 和 MP 法 (ITS 数据) 构建系统发育树
Fig. 1 Phylogenetic tree constructed based on NJ and MP
methods (ITS data)

图 2 基于NJ和MP法 (psbA-trnH 数据) 构建系统发育树
Fig. 2 Phylogenetic tree constructed based on NJ and MP
method (psbA-trnH data)
序列构建的分子系统树并不能将变种紫苏和白苏区
分开，紫苏和白苏来源于不同地域的样本，并没有
各自独立聚为一个分支，二者来源于 9 个地域的 11
个居群样本聚为一个单系分支（95%）。ITS 序列可
将紫苏、白苏与其他 3 个变种很好的区分开，其中
回回苏、野生紫苏、耳齿紫苏 3 个物种不同样本间
形成 3 个独立分支，支持率均为 90%以上。
psbA-trnH 序列构建的分子系统树并不能将紫
苏和白苏区分开，紫苏和白苏来源于不同地域的样
本并没有各自独立聚为一个分支，二者来源于 4 个
地域 6 个居群样本聚为一个单系分支（90%）。
psbA-trnH 序列可将紫苏、白苏与其他 3 个变种很好
的区分开，回回苏、耳齿紫苏 2 个变种不同样本间
形成 2 个独立分支，支持率分别为 75%和 70%。
2.4 紫苏属属下种、变种简约系统发育树的分析
为探讨紫苏属各变种间的亲缘关系，本实验应
用 PAUP* version 4.0b10 构建紫苏属的 ITS、psbA-
trnH 序列的 MP 系统发育树。外类群选择与紫苏属
近缘的二蕊紫苏属和罗勒属[29]。最大 MP 树和 NJ
树的拓扑结构完全一致（图 1、2）。ITS 矩阵的序列
总长度为 625 bp，最大简约法分析得出 1 棵最简约
树，树长为 129。在 ITS 最简约树上（图 1），紫苏
属的单系得到 100%支持，紫苏属内形成两大分支，
紫苏、白苏先聚为一单系分支，与回回苏形成一姐
妹群分支，野生紫苏与耳齿紫苏两变种形成另一单
系分支，各分支间支持率均在 95%以上。这表明紫
苏，白苏与回回苏亲缘关系最近，野生紫苏与耳齿
紫苏亲缘关系最近。psbA-trnH 序列矩阵的序列总长
度为 436 bp，最大简约法分析得出 1 棵最简约树，
树长为 276 bp。在 psbA-trnH 最简约树上（图 2），
紫苏属的单系得到 100%支持，同样，紫苏属内形
成两大分支，紫苏、白苏与回回苏形成一单系分支，
野生紫苏与耳齿紫苏两变种形成另一单系分支，各
分支间支持率均在 90%以上。这表明紫苏、白苏和
回回苏亲缘关系最近，野生紫苏与耳齿紫苏亲缘关
系最近。
3 讨论
3.1 紫苏属属下种、变种间系统发育关系
紫苏属属下系统分类争议主要体现在紫苏和白
苏的划分。本研究通过对紫苏属属下1种4变种的 ITS
和 psbA-trnH 两个基因片段分析，构建紫苏属下的分
子系统发育树，结果均支持将白苏与变种紫苏合并为
一个种。染色体核型分析[30]结果表明紫苏与白苏的核
不对称型均为 2A，与其他变种不同，也支持二者合
并为 1 个种。参照《中国药典》2010 年版[2]、《中国
植物志》[4]和 Flora of China 紫苏种的命名，本研究
将白苏 P. frutescens 和变种紫苏 P. frutescens var.
arguta 合并为一个种紫苏 P. frutescens。紫苏属内，
ITS 和 psbA-trnH 系统树均支持野生紫苏和耳齿紫
苏亲缘关系最近。《中国植物志》[4]曾记载耳齿紫苏
与野生紫苏形态特征极相似，不同之处在于叶基圆
形或心形，具耳状齿缺，雄蕊稍伸出于花冠。刘月
秀等[7]认为，耳齿叶这种变异现象有时会出现在紫

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苏和野生紫苏的主茎顶或侧枝顶。此外，本研究作
者野外观察发现，雄蕊稍伸出于花冠这一区别特征，
在耳齿紫苏与野生紫苏之间差异并不显著，形态和
分子证据支持二者的亲缘关系最近。回回苏被认为
是紫苏在栽培过程中变异的类型，其叶形变异很
大，是紫苏属较为进化的一个变种[7,31]，在全国各
地栽培，与紫苏一样均可药用。《中国植物志》[4]
记载回回苏的叶形，叶边缘锯齿变异范围介于紫苏
的栽培和野生类型之间。本研究分子系统学结果支
持紫苏与回回苏之间亲缘关系最近。 ITS 和
psbA-trnH 分子系统树显示紫苏属被分为两独立分
支，紫苏和回回苏构成一分支，野生紫苏和耳齿紫
苏构成一分支，两独立分支内，紫苏相对于回回苏
表现出较为原始的特性，如形态特征变异幅度大，
分布区域广阔[4]；野生紫苏相对于耳齿紫苏表现出原
始的形态性状，如植株矮小、叶小、果小[7]，这表明
紫苏和变种野生紫苏可能代表紫苏属早期开始分化
的 2 个物种。
3.2 ITS 和 psbA-trnH 序列对紫苏与其变种的鉴定
罗玉明等[32]对紫苏属的 ITS 序列分析结果表
明，白苏和变种紫苏的鉴别位点仅在 ITS 序列上位
于第 430 个位点，白苏为 A，紫苏为 G。可能由于
取样的不同，该位点在本研究取样的白苏和紫苏的
ITS 序列均为 G，不存在差异。对于紫苏属的回回
苏和耳齿紫苏的 ITS 序列出现的鉴别位点[32]与本研
究的结果完全一致。对紫苏属紫苏与其变种进行种
内（变种内）和种间（变种间）遗传距离比较，及
NJ 树分析结果表明，ITS 和 psbA-trnH 序列种间（变
种间）变异均大于种内（变种内）变异，NJ 树聚类
分析均能准确鉴别紫苏与其他变种，因此，ITS 和
psbA-trnH 序列可以作为紫苏与其他变种进行鉴定
的条形码序列。
3.3 ITS 和 psbA-trnH 在药用植物亲缘关系构建和
鉴定中应用
ITS 和 psbA-trnH 序列作为国际通用条形码序
列，在种间及种下分类等级具有进化速率快、变异
程度高、区分物种能力强的特点[33]。在药用植物与
其近缘种类等较低分类阶元的分子鉴定中，ITS 和
psbA-trnH 序列经常单独（如单个基因片段 ITS、
psbA-trnH 和 ITS2），或联合作为 DNA 条形码序列
使用，在药用植物鉴定中发挥关键作用。例如，Chen
等[16]和 Li 等[34]研究结果表明，ITS2 和 ITS 序列应
纳入到国际条形码鉴定的核心序列，适用于种子植
物鉴定研究，psbA-trnH 序列适合作为 ITS2 和 ITS
互补序列[16]。但在构建药用植物与其近缘种类的亲
缘关系时，单个基因片段可能会因为谱系分选、网
状进化、杂交事件等[33,35]给药用植物与其近缘种类
系统发育重建带来误差，并不能真实反映物种之间
的亲缘关系，需要来自不同基因组的多基因联合分
析验证[36]。在大多数被子植物中，核基因通常是双
亲遗传，而叶绿体基因则是母系遗传[37]。因此，选
用来自核基因组 ITS 和叶绿体基因组 psbA-trnH 等
多个基因片段进行序列联合分析验证，构建分子系
统树，可准确构建药用植物与其近缘种类的亲缘关
系。药用植物的分子鉴定是药用植物种质鉴别的重
要手段，确保中医临床用药的安全和疗效。药用植
物亲缘关系的准确界定，是开展药用植物亲缘学研
究的基础和关键[38]，对于扩大药用植物基源种类和
药用植物栽培品种选育具有重要意义。通过对核基
因 ITS 和叶绿体 psbA-trnH 序列等多基因联合使用，
将为药用植物分子鉴定、亲缘关系构建、扩大新药
源和选育新品种提供新的思路。
志谢：中国科学院植物研究所王印政研究员协
助查阅标本并指导鉴定植物标本。
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