全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 19 期 2014 年 10 月 ·2797·

• 药理与临床 •
基于生物活性导向的 UPLC-Q/TOF 方法的玫瑰花抗炎药效物质基础研究
韩彦琪，周梦鸽，王增勇，姜 民*，白 钢
南开大学药学院，药物化学生物学国家重点实验室，天津市分子药物研究重点实验室，天津 300071
摘 要：目的 探究玫瑰花的抗炎活性，并建立基于超高效液相色谱-四级杆/飞行时间质谱（UPLC-Q/TOF）结合荧光素酶
报告基因检测系统筛选玫瑰花中核转录因子-κB（NF-κB）抑制剂的方法。方法 通过建立铜绿假单胞菌感染的小鼠急性肺
感染模型来进行玫瑰花水提物的抗炎药效学评价，同时采用 UPLC-Q/TOF 结合 NF-κB 荧光素酶报告基因检测系统筛选玫瑰
花提取物的抗炎药效物质基础。结果 动物实验结果表明，玫瑰花给药组能显著改善铜绿假单胞菌感染的小鼠肺部中性粒细
胞浸润，降低肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、IL-8 等细胞炎症因子水平。得到玫瑰花谱效关系图并筛选
出 7 个 NF-κB 抑制剂。结论 玫瑰花能减轻铜绿假单胞菌感染的小鼠炎症反应。7 个单体物质（包括没食子酸、4-O-没食子
酰基奎宁酸、没食子酸甲酯、矢车菊黄素、小木麻黄素、木麻黄鞣质及并没食子酸）可能为玫瑰花中潜在的 NF-κB 抑制剂。
关键词：玫瑰花；抗炎；UPLC-Q/TOF；NF-κB 抑制剂；药效物质基础
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)19 - 2797 - 06
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.19.013
Study on anti-inflammatory components in Rosae Rugosae Flos based on
bioactivity-integrated UPLC-Q/TOF method
HAN Yan-qi, ZHOU Meng-ge, WANG Zeng-yong, JIANG Min, BAI Gang
College of Pharmacy, State Key Laboratory of Medicinal Chemical Biology, Tianjin Key Laboratory of Molecular Drug Research,
Nankai University, Tianjin 300071, China
Abstract: Objective To investigate the anti-inflammatory effect of Rosae Rugosae Flos (RRF) and screen its bioactive components on
nuclear factor-κappa B (NF-κB) inhibition by ultra-performance liquid chromatography coupled with quadrupole/time of flight mass
spectrometry (UPLC-Q/TOF MS). Methods The anti-inflammatory effect of RRF was assessed in Pseudomonas aeruginosa strain-induced
acute lung infection mouse model. UPLC-Q/TOF MS coupled with NF-κB activity luciferase reporter assay system was applied to detect the
potential anti-inflammatory components in RRF extract. Results The administration of RRF extract could ameliorate the neutrophil
infiltration and diminish the levels of inflammatory cytokines such as tumor necrosis factor-α (TNF-α), interlukin-6 (IL-6), and IL-8 in P.
aeruginosa induced mice. Seven components were screened to have potential NF-κB inhibitory effects based on the bioactivity-integrated
UPLC-Q/TOF assay system. Conclusion RRF can contribute to the alleviation of inflammation in mice with acute lung infection induced by
P. aeruginosa strain. Seven potentially active ingredients, such as gallic acid, 4-O-galloylquinic acid, methylgallate, centaureidin, strictinin,
casuariin, and ellagic acid are found to have anti-inflammatory effects as NF-κB inhibitors.
Key words: Rosae Rugosae Flos; anti-inflammation; UPLC-Q/TOF; NF-κB inhibitor; effective substance

玫瑰花 Rosae Rugosae Flos 为蔷薇科植物玫瑰
Rosa rugosa Thunb. 的干燥花蕾[1]，主要含有挥发
油、黄酮、鞣质、脂肪油、氨基酸等化学成分[2]，
具有行气活血、和气、止痛的功效。现代药理研究
表明玫瑰花有着广泛的药理作用：玫瑰花水煎液有
很好的抗氧化活性和自由基清除能力；对金黄色葡
萄球菌、结核杆菌及伤寒杆菌均有明显的抑制作用；
对白血病病毒、人类免疫缺陷病毒等均有抗病毒作
用；还可减轻由冠状动脉结扎导致的心肌缺血程度，
有很好的扩张血管作用[3-5]。

收稿日期：2013-12-20
基金项目：国家自然科学基金资助项目（81102835）
作者简介：韩彦琪（1989—），女，硕士在读，研究方向为复方药物与系统生物学。Tel: (022)23504933 E-mail: hanyanqi619@163.com
*通信作者 姜 民，男，博士，副研究员，主要从事复方药物与系统生物学研究。Tel: (022)23506930 E-mail: minjiang@nankai.edu.cn
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炎症是机体对各种致炎因素引起的局部损伤
所产生的具有防御意义的应答性反应，是十分常见
而又非常重要的基本病理过程，可以发生于机体的
任何部位和任何组织，人类的大多数疾病都与炎症
过程有关[6]。核转录因子-κB（NF-κB）是一个十分
重要的转录因子，在炎症、免疫及细胞增殖、存活
和凋亡等许多生物过程中起着非常重要的作用，可
调控如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-2
（IL-2）、IL-6、IL-8 和嗜酸细胞激活趋化因子等大
量细胞因子、趋化因子和黏附分子的合成过程[7]。
传统的中药活性成分筛选方法需要提取、分离、纯
化等过程，并需要使用药理模型来进行筛选及验
证，消耗大量时间和样品。因此建立快速有效的中
药抗炎活性成分筛选方法显得非常重要[8]。
本实验复制了由铜绿假单胞菌引起的小鼠急
性肺部感染模型[9]，考察玫瑰花水提物对铜绿假单
胞菌的抑制作用，并建立了一种快速高效的基于超
高效液相色谱-四级杆/飞行时间质谱（UPLC-Q/
TOF）结合 NF-κB 荧光素酶报告基因检测系统筛选
玫瑰花抗炎活性成分的方法，探究玫瑰花的抗炎作
用药效物质基础，并为其进一步的抗炎机制研究提
供参考。
1 材料
1.1 仪器
超高效液相色谱仪串联四极杆/飞行时间质谱
（Waters ACQUITYTM UPLC-Q/TOF Premier）；超纯
水仪 Milli-Q（美国 MILLIPORE 公司）；680 型酶标
仪（美国 Bio-Rad 公司）。
1.2 试剂
细胞培养试剂（美国 GibcoBRL）；头孢拉定（海
南海力制药有限公司，批号 111102）；TNF-α（美国
PeproTech）；pGL4.32（美国 Promega）；脂质体 2000
转染试剂（美国 Invitrogen）；地塞米松（美国
Sigma）；TNF-α、IL-6、IL-8 酶联免疫试剂盒（美
国 Pierce/Endogen）；乙腈、甲醇（色谱纯，美国
Fisher）；甲酸（色谱纯，比利时 Acros）；亮氨酸-
脑啡肽醋酸盐（美国 Sigma-Aldrich 公司）；超纯水
由 Milli-Q 制备；其他所用试剂均为分析纯。
1.3 试药
玫瑰花购于河北省安国市长安中药材有限公
司，批号 70067800-7，经天津药物研究院张铁军研
究员鉴定为玫瑰 Rosa rugosa Thunb. 的干燥花蕾，
标本现存于南开大学药学院复方药物与系统生物
学实验室。
1.4 动物、细胞及菌株
ICR 小鼠（雄性，体质量 18～22 g）购自中国
食品药品检定研究院，许可证号 SCXK-（军）
2007-004XC。人胚肾细胞（HEK 293）购于上海拜
力生物技术有限公司。铜绿假单胞菌是从临床一例
支气管扩张患者送检的痰中分离得到的卡那霉素
敏感株，经美国全自动微生物分析仪VI TEK IMS60
鉴定为铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa，培
养于 Luria-Bertani 培养基并用已灭菌的 PBS 悬浮，
取终浓度为 1×109 cfu/mL 用于动物实验造模。
2 方法
2.1 玫瑰花实验样品的制备
2.1.1 动物实验样品制备 称取 80 g 玫瑰花药材
于砂锅中加 800 mL 水浸泡 2 h 后开火煮沸，再小火
继续煮 30 min，提取液滤过后旋蒸得浸膏于 4 ℃保
存，用于动物药效学实验研究。
2.1.2 细胞实验样品制备 玫瑰花粉末加入 10 倍
量的水超声 30 min，依次加入石油醚、二氯甲烷、
醋酸乙酯和水饱和正丁醇分别以 2 倍体积量萃取 2
次，分别得到石油醚、二氯甲烷、醋酸乙酯、正丁
醇、水提取部位，将各提取部位依次蒸干，残渣分
别溶于含 0.1% DMSO 的 DMEM 培养基中，用于细
胞实验研究。
2.2 分组、给药及模型制备
小鼠随机分为 5 组，即对照组、模型组、头孢
拉定（50 mg/kg）阳性药组及玫瑰花水提液高、低
剂量（3.250、1.625 g/kg）组，每组 10 只，各组均
ig 给予对应剂量的药物，对照组及模型组均给予等
量生理盐水，连续给药 14 d 后，除对照组外，其余
各组小鼠制备肺炎模型。每只小鼠鼻腔滴入 40 μL
铜绿假单胞菌（菌数为 1×109/mL）建模[9]。造模
24 h 后取小鼠血浆和肺组织，肺组织固定于 4%甲
醛溶液中用于 HE 染色实验。
2.3 炎症因子的测定
ELISA 方法测定小鼠血浆中的 TNF-α、IL-6 及
IL-8 炎症因子的水平，操作按试剂盒说明书进行。
2.4 玫瑰花样品对 NF-κB 抑制能力的测定
HEK 293 细胞培养于 96 孔板，细胞融合至 50%
左右时共转染 PGL4.32 及内参 Renilla 质粒，转染
24 h 后加入玫瑰花不同提取部位（预试验显示玫瑰
花水提物 0.3 mg/mL 为保证细胞存活率在 80%的最
大给药质量浓度，故各提取部位终质量浓度确定为
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 19 期 2014 年 10 月 ·2799·

0.3 mg/mL）或地塞米松（10 μmol/L）孵育 6 h，再
加入 TNF-α（10 ng/mL）刺激 6 h 后裂解细胞，用
双荧光素酶报告基因试剂盒检测各组细胞 NF-κB
的表达量[10]。数据以相对荧光比值表示：相对荧光
比值＝NF-κB 荧光值/内参 Renilla 荧光值。
2.5 UPLC 色谱条件及样品流分收集
ACQUITY UPLC BEH C18 色谱柱（100 mm×
2.1 mm，1.7 μm，Waters），流动相为乙腈（A）-0.1%
甲酸超纯水（B），梯度洗脱条件：0～3 min，2% A；
3～15 min，2%～15% A；15～16 min，15%～95% A；
16～20 min，95% A；体积流量 0.4 mL/min，柱温
35 ℃，进样量 2 μL。使用 96 孔深孔板进行流分收
集，按照 UPLC 分离时间，每隔 30 s 收集至 1 个孔。
40 ℃减压干燥，残渣用 100 μL 细胞培养基溶解以
进行生物活性分析。
2.6 质谱条件
采用电喷雾离子源（ESI），正、负模式测定。
参数：V 模式；毛细管电压负模式 2.5 kV、正模式
3.0 kV；锥孔电压负模式 25 V、正模式 30 V；离子
源温度 100 ℃；脱溶剂气温度 300 ℃；脱溶剂氮
气流量 600 L/h；锥孔气流量 50 L/h；检测器电压
1 800 V；采样频率 0.1 s，间隔 0.02 s；检测范围 m/z
100～1 200；Lockmass 采用LEA（[M－H]− 553.277 5，
[M＋H]+ 555.293 1）。
2.7 统计分析方法
采用 SPSS 18.0 软件进行统计分析，实验数据
均以 ±x s 表示，组间比较采用方差分析（One-Way
ANOVA）。
3 结果
3.1 对肺炎小鼠的影响
3.1.1 肺组织病理观察结果 小鼠肺组织经 HE 染
色后进行切片观察，结果见图 1。对照组小鼠肺组
织结构完整，无炎症表现。与对照组比较，模型组
小鼠肺组织呈现大量炎症细胞聚集，炎症细胞以中
性粒细胞浸润为主，肺泡壁结构破坏；头孢拉定组
和玫瑰花水提液给药组小鼠肺组织炎症状况有明
显改善，且玫瑰花水提液高剂量组炎症程度轻于低
剂量组。


对照 模型 头孢拉定

玫瑰花水提液高剂量 玫瑰花水提液低剂量
图 1 各组小鼠肺组织病理观察结果
Fig. 1 Histopathological observation of lung tissue in mice of each group
3.1.2 对血浆炎症因子的影响 各组小鼠血浆
TNF-α、IL-6 和 IL-8 测定结果见图 2。可以看出，头
孢拉定组和玫瑰花水提液给药组小鼠血浆中 TNF-α、
IL-6 和 IL-8 水平均较模型组有明显降低（P＜0.001），
且玫瑰花水提液高剂量组比低剂量组降低更明显。
动物实验结果表明，玫瑰花水提液给药 14 d 可以预
防由铜绿假单胞菌引起的小鼠急性肺部感染。
3.2 玫瑰花不同提取部位对 NF-κB 抑制活性比较
玫瑰花石油醚、二氯甲烷、醋酸乙酯、水饱和
正丁醇和水提取部位对 NF-κB 的抑制作用见图 3。
结果显示，阳性药地塞米松组（10 μmol/L）和玫瑰
花水提取部位组（300 μg/mL）的 NF-κB 表达与模
型组相比有明显降低（P＜0.01、0.001），说明玫瑰
花水提取部位对 NF-κB 有很好的抑制作用。因此，
·2800· 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 19 期 2014 年 10 月



与对照组比较：###P＜0.001；与模型组比较：***P＜0.001
###P < 0.001 vs control group; ***P < 0.001 vs model group
图 2 各组小鼠血浆中 TNF-α、IL-6 和 IL-8 水平比较 ( ± = 6x s , n )
Fig. 2 Comparison on levels of TNF-α, IL-6, and IL-8 in mice plasma ( ± = 6x s , n )



与对照组比较：###P＜0.001；与模型组比较：**P＜0.01 ***P＜0.001
###P < 0.001 vs control group; ***P < 0.001 **P < 0.01 vs model group
图 3 玫瑰花 5 个不同提取部位对 NF-κB 抑制作用比较
( ± = 6x s , n )
Fig. 3 Comparison on effects of five extracts from RRF on
NF-κB inhibition ( ± = 6x s , n )
在筛选玫瑰花抗炎有效成分实验中选取玫瑰花水
提取部位进一步研究。
3.3 玫瑰花水提取部位的抗炎活性单体筛选
为了筛选出玫瑰花中的抗炎活性成分，对其水
提取部位进行 UPLC 分离，按照保留时间每 30 s 为
1 个流分进行收集，分别进行细胞水平的 NF-κB 抑
制实验，比较每个流分对 NF-κB 的抑制效果。图 4
为玫瑰花水提取部位谱效关系图。图中显示了与
UPLC 保留时间相对应的流分对 NF-κB 的抑制率，
得到抑制率较强的 7个色谱峰为抑制NF-κB表达的
潜在活性物质。
3.4 玫瑰花抗炎活性单体的鉴定
为鉴定出玫瑰花中的抗炎活性物质，使用
UPLC-Q/TOF对细胞实验所筛选出的几个抗炎活性
单体进行二级质谱鉴定。运用小数点后四位的精确
质量数进行元素组成分析，选择 [M－H]−和 [M＋
H]+为母离子进行二级质谱实验。将精确质量数和二
级质谱裂解碎片与文献进行对比，并结合物质保留
时间对其进行鉴定[11]。得到抗炎活性物质的鉴定结
果，分别为没食子酸、4-O-没食子酰基奎宁酸、没
食子酸甲酯、矢车菊黄素、小木麻黄素、木麻黄鞣
质及并没食子酸，见表 1。
4 讨论
玫瑰花在我国有着悠久的应用历史，随着医疗
模式的转变和人们保健意识的增强，玫瑰花在心血
管疾病治疗、抗衰老及美容保健方面的作用得到人
们越来越多的关注，然而针对玫瑰花抗炎、抗菌功
效的研究仍比较匮乏。因此，本实验建立了用铜绿
假单胞菌感染的小鼠肺部急性感染模型来探究玫
瑰花的体内抗菌效果。实验结果表明，玫瑰花水提
物可以通过降低 TNF-α、IL-6 和 IL-8 的表达来有效
预防铜绿假单胞菌引起的肺部感染，对肺组织起到
很好的保护作用。
化学物质基础模糊，作用机制不明确仍然是中
药现代化进程中亟待解决的问题。近几十年来，
HPLC 及其他现代分离技术联合活性检测的筛选方
法已被应用于中药活性物质筛选，传统的通过分
离、纯化结合动物实验来评价活性的筛选方法不但
花费高而且耗时长，已逐渐被代替[12-13]。UPLC 与
HPLC 相比，有着更强的分离能力，更高的分辨率
和灵敏度，结合 TOF-MS 技术在结构信息方面的独
特优势，UPLC-Q/TOF 近几年来已广泛应用于中药
成分的分离鉴定[14]。基于 DNA、蛋白质、细胞等

60

40

20

0
15
12
9
4
2
0
60
40
20

4
2
0
TN
F-
α
/ (
pg
·m
L−
1 )

IL
-6
/
(n
g·
m
L−
1 )

IL
-8
/
(n
g·
m
L−
1 )

### ### ###
*** ***
***
*** ***
*** ***
*** ***
600
400
200
30
20
10
0
N
F-
κB
相
对
荧
光
比
值

对照 模型 头孢拉定 3.250 1.625
玫瑰花水提液 / (g·kg−1)
对照 模型 头孢拉定 3.250 1.625
玫瑰花水提液 / (g·kg−1)
对照 模型 头孢拉定 3.250 1.625
玫瑰花水提液 / (g·kg−1)
###
*** **
对照 模型 地塞米松 水 正丁醇 醋酸乙酯 二氯甲烷 石油醚
玫瑰花提取部位
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 19 期 2014 年 10 月 ·2801·



A-254 nm 紫外吸收谱图 B-正离子模式 BPI 图 C-负离子模式 BPI 图 D-NF-κB 抑制率
A-UV chromatogram of 254 nm B-BPI chromatogram in positive mode C-BPI chromatogram in negative mode
D-The bioactivity chromatogram of NF-κB inhibition
图 4 UPLC-Q/TOF 结合荧光素酶报告基因检测系统筛选玫瑰花水提取部位中抑制 NF-κB 活性的单体成分
Fig. 4 Screening of NF-κB inhibitors in water extract from RRF using UPLC-Q/TOF coupled with
luciferase reporter assay system
表 1 玫瑰花中部分具有生物活性化合物的质谱数据
Table 1 MS/MS data from (+/−) ESI-MS of bioactive compounds in RRF
峰号 tR/min 模式 质荷比 质谱二级碎片 分子式 化合物
1 1.54 负/正 168.972 8 125 [M−H−CO2]− C7H6O5 没食子酸
2 1.75 负/正 343.036 0 299 [M−H−CO2]−, 125 [M−H−CO2−C7H10O5]− C14H16O10 4-O-没食子酰基奎宁酸
3 6.75 负 182.990 1 168 [M−H−CH3]−, 125 [M−H−CH3−CO2]− C8H8O5 没食子酸甲酯
4 7.58 负 358.982 5 344 [M−H−CH3]−, 326 [M−H−CH3−H2O]−,
316 [M−H−CH3−CO]−
C18H16O8 矢车菊黄素
5 9.10 负 633.083 5 465 [M−H−C7H4O5]−,
301 [M−H−C7H4O5−C6H8O3−2H2O]−
C27H22O18 小木麻黄素
6 12.73 负 783.304 9 633 [M−H−C7H2O4]−,
465 [M−H−C7H2O4−C7H4O5]−
C34H24O22 木麻黄鞣质
7 14.11 负 300.967 6 283 [M−H2O]−, 257 [M−H2O−C2H2]−,
201 [M−H2O−C2H2−2C2H4]−
C14H6O8 并没食子酸

80
60
40
20
0
−20
N
F-
κB
抑
制
率
/
%
1 2 3 4 5 6
7
7
6
54
3
1
2
1
2
1
2 3
5
6
7
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
t / min
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D
空白对照
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高通量筛选的生物系统可以快速检测大量具有潜
在生物活性的物质，其中萤火虫荧光素酶基因作为
活性检测的报告基因具有信号灵敏、细胞体内合成
迅速且不会长时间积累的优点 [15]。因此，将
UPLC-Q/TOF与NF-κB依赖的双荧光素酶报告基因
系统整合，建立了快速有效的筛选 NF-κB 抑制剂的
新方法。本实验中分析鉴定出玫瑰花水层萃取物中
7 个抗炎活性单体，分别为没食子酸、4-O-没食子
酰基奎宁酸、没食子酸甲酯、矢车菊黄素、小木麻
黄素、木麻黄鞣质及并没食子酸。
分离、筛选中药中的有效成分不仅能明确药效
物质基础，更是阐释作用机制必不可少的条件。本
实验对玫瑰花中 NF-κB 抑制剂的筛选不仅明确了
其抗炎药效物质基础，更有助于阐释玫瑰花抗炎的
作用靶点及通路，为玫瑰花后续作用机制的研究提
供了实验基础。
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