全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 10 期 2016 年 5 月

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• 药材与资源 •
香鳞毛蕨 4CL 基因密码子使用特性及表达预测分析
李珊珊 1, 2，陈玲玲 1，王鹤萌 1，胡宝忠 1*，常 缨 1*
1. 东北农业大学生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150030
2. 齐齐哈尔大学生命科学与农林学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006
摘 要：目的 研究蕨类植物中 4CL 基因的表达与分析，为蕨类植物次级代谢产物的积累和调控奠定理论基础。方法 运
用 CHIPS、CUSP 和 CodonW 在线程序对自主克隆的香鳞毛蕨 4CL 基因（Df4CL）序列进行分析，并与大肠杆菌、酵母菌、
拟南芥、烟草等基因进行比较，对了解 Df4CL 基因密码子使用特性，为其选择合适的表达系统具有重要意义。结果 Df4CL
基因对 ATGC 选择没有偏向性，并且与小立碗藓的密码子使用偏好性相一致。在密码子使用频率上，Df4CL 基因与拟南芥
的差异小于与烟草、大肠杆菌、酵母的差异；基于 4CL 基因的密码子使用偏性的系统聚类分析表明，香鳞毛蕨与小立碗藓、
拟南芥聚为一类。结论 预示 Df4CL 基因更适合在拟南芥中外源表达。
关键词：香鳞毛蕨；4-香豆酸辅酶 A 连接酶；密码子使用特性；基因表达
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2016)10 - 1753 - 09
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.10.021
Analysis on codon using features and expression prediction of 4CL gene in
Dryopteris fragrans
LI Shan-shan1, 2, CHEN Ling-ling1, WANG He-meng1, HU Bao-zhong1, CHANG Ying1
1. College of Life Sciences, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China
2. College of Life Sciences and Agriculture and Forestry, Qiqihar University, Qiqihar 161006, China
Abstract: Objective Expression and analysis of 4CL gene of ferns, which lays the theoretical foundation for the accumulation and
regulation of secondary metabolites of ferns. Methods Cloned 4CL gene (Df4CL) sequence from Dryopteris fragrans was analyzed by
CHIPS, CUSP, and Codon W programs online, and then compared with Escherichia coli, yeast, Arabidopsis thaliana, and Nicotiana tabacum
L. It is important to identify the codon usage of Df4CL gene and select appropriate expression systems. Results Df4CL gene had not the bias
toward the synonymous codons with ATGC at the third codon position, but had the preference consistency with Physcomitrella patens codon
usage. The differences in codon usage frequency between Df4CL gene and A. thaliana were less than those in N. tobacum, E. coli, and yeast.
Based on 4CL gene codon usage bias of cluster analysis, it was shown that D. fragrans, P. patens, and A. thaliana were classed into one group.
Conclusion The A. thaliana expression system may be more suitable for the exogenous expression of Df4CL gene of D. fragrans.
Key words: Dryopteris fragrans (L.) Schott; 4-coumarate: CoA ligase (4CL); codon using features; gene expression

香鳞毛蕨Dryopteris fragrans (L.) Schott是鳞毛蕨
科（Dryopteridaceae）鳞毛蕨属 Dryopteris Adans 多年
生蕨类植物，其作为民间用药主要用于治疗关节炎及
各种皮肤病，目前国内外研究学者发现，香鳞毛蕨具
有抗肿瘤、抗菌、抗氧化、驱虫等作用[1-7]，由于其独
特的药用价值而引起人们的广泛关注。近年来对香鳞
毛蕨的研究主要集中在对其化学成分、功能及多样性
的研究[8-10]，而鲜少有关于次级代谢产物相关基因的
报道。4-香豆酸辅酶 A 连接酶（4CL，EC 6.2.1.12）
是苯丙氨酸代谢途径的关键酶，其途径产生的类黄
酮、木质素等次生物质在植物抗逆境、抗病害上有非
常重要的作用[11-13]。因此，深入研究 4CL 基因对次级
代谢产物的积累具有至关重要的意义。
为深入研究 4CL 基因的功能及蛋白质的特性
常常需要基因的外源表达，而基因的外源表达受到
很多因素的影响，其中密码子偏好性是影响外源基

收稿日期：2015-09-06
基金项目：国家自然科学基金资助项目（31070291）；齐齐哈尔市科学技术项目（NYGG-201206-4）
作者简介：李珊珊（1983—），女，讲师，博士研究生，主要从事植物分子生物学研究。E-mail: lishanshan83@163.com
*通信作者 胡宝忠（1962—），男，教授，博士，主要从事植物分子生物学。E-mail: bzhu@neau.edu.cn
常 缨（1970—），女，教授，博士，主要从事植物分子生物学。E-mail: changying@neau.edu.cn
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因表达的重要因素之一。已知物种对密码子的使用
不是随机的，往往倾向于使用一种或几种特定的同
义密码子，即存在密码子使用偏好性（codon usage
bias）[14]。密码子偏性的分析有助于揭示有关物种
间或某一物种的基因家族间的基因进化规律；了解
转录和翻译进程中的调控机制；在预测外源基因的
最适宿主和通过改良外源基因以提高其表达水平等
方面具有重要意义[15]。
本研究利用自主克隆的 Df4CL 基因序列，通过
CHIPS、CUSP 和 CodonW 在线程序在线程序分析
Df4CL 基因密码子使用偏好性，并且与大肠杆菌、
酵母菌、拟南芥、烟草等基因组密码子偏好性进行
比较，并进行聚类分析，以期为该基因实现异源表
达选择合适的宿主表达系统，或者通过优化密码子
提高基因的表达量，为深入了解该基因及表达调控
机制提供理论基础，为进一步研究 4CL 蛋白质的结
构和功能奠定基础。
1 材料和方法
1.1 序列数据
Df4CL 基因为前期试验所得，并提交到美国国
立生物技术信息中心 NCBI，基因序列号分别为
Df4CL1（KF801576）、Df4CL2（KF836752）、Df4CL3
（KF836753）和 Df4CL4（KF836754）。其他序列通
过 NCBI 收集获得（表 1）。小立碗藓 Physcomitrella
pAtens Bruch、火炬松 Pinus teada L.、拟南芥
Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.、烟草 Nicotiana
tabacum Linn.、水稻 Oryza sativa L.、黑麦草 Lolium
perenne L. 的序列通过 NCBI 收集获得（表 1）。
表 1 4CL 基因的完整 cDNA 和编码氨基酸序列
Table 1 Complete cDNA and coded amino acid sequences of 4CL gene
植物 物种 基因编号 数据库 cDNA 编号 CDS 长度/bp 数据库蛋白编号
At4CL1 At1g51680 1 686 NP175579
At4CL2 At3g21240 1 671 NP188761
At4CL3 At1g65060 1 686 NP176686
拟南芥
At4CL4 At3g21230 1 713 NP188760
Nt4CL1 D43773 1 629 BAA07828
Nt4CL2 U50845 1 644 AAB18637
双子叶植物
烟草
Nt4CL3 U50846 1 629 AAB18638
Os4CL1 NM001052604 1 665 NP001046069
Os4CL2 NM001054354 1 710 NP001047819
水稻
Os4CL4 NM001064787 1 680 NP001058252
Lp4CL1 AF052221 1 713 AAF37732
Lp4CL2 AF052222 1 671 AAF37733
单子叶植物
黑麦草
Lp4CL3 AF052223 1 674 AAF37734
Pt4CL1 U12012 1 614 AAA92668 裸子植物 火炬松
Pt4CL2 U12013 1 614 AAA92669
Pp4CL1 EU167552 1 758 ABV60447
Pp4CL2 EU167553 1 758 ABV60448
Pp4CL3 EU167554 1 731 ABV60449
苔藓植物 小立碗藓
Pp4CL4 EU167555 1 713 ABV60450
石松类植物 江南卷柏 Sem4CL1Sem4CL2 XM_002979027XM_002986499 1 614
1 635
XP_002969881
XP_002979073

1.2 方法
1.2.1 4CL 基因家族密码子使用性参数分析 利用
CodonW 软件分析 Df4CL 基因及拟南芥、烟草、水
稻、黑麦草、火炬松、小立碗藓、江南卷柏等植物
4CL 基因家族密码子使用特性，参数包括：A3s、
G3s、C3s、T3s（同义密码子在第 3 位上相应碱基
的出现频率）、密码子适应指数（CAI）、密码子偏
爱指数（CBI）、最优密码子使用频率（FOP）、密
码子有效数（NC）、密码子第 3 位的（G＋C）量
（GC3s）、基因的（G＋C）量（GC）、同义氨基酸
数（L-xym）、氨基酸数（L-aa）、平均亲水性值
（Gravy）和芳香性值（Aroma）等。
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1.2.2 4CL 基因家族同义密码子相对使用度（RSCU）
分析 RSCU 是某一特定的密码子在编码对应氨基酸
的同义密码子中的相对概率。本研究应用 MEGA 5.0
软件计算各基因 CDS 序列的 RSCU 值。
1.2.3 Df4CL 基因家族表达预测 密码子使用频率
分别采用 EMBOSS 在线程序（http://vm-bioinfo.toul-
ouse.inra.fr/emboss）中的 CHIPS（codon heterozygosity
in a protein coding sequence）和 CUSP（create a codon
usage table）进行分析。本实验所采用的大肠埃希菌、
酵母、拟南芥、烟草基因组的密码子使用频率数据来
源于 Codon Usage Database（http://www.kazusa. or.jp/
codon）。
1.2.4 Df4CL 基因家族聚类分析 对植物中基因家
族密码子使用偏好性的聚类采用SPSS 19系统多元分
析软件。在此过程中，将每一条基因作为一个对象，
密码子的 RSCU 值作为变量。去除值始终为 1 的编码
Trp 和 Met 的密码子 UGG 和 AUG，再除去 3 个不编
码氨基酸的终止密码子，取余下的 59 个密码子的值
对基因的密码子使用偏好性进行聚类分析。
2 结果与分析
2.1 4CL 基因家族密码子使用性参数分析
利用 CodonW 软件分析江南卷柏、小立碗藓、
火炬松、拟南芥、烟草、大豆、水稻、黑麦草等植
物中的 4CL 基因家族密码子使用情况（表 2）。在
表 2 不同植物中 4CL 基因家族密码子使用特性
Table 2 Codon using feature of 4CL gene in various plants
基因 T3s C3s A3s G3s CAI CBI FOP NC GC3s GC L-sym L-aa Gravy Aroma
Df4CL1 0.355 0 0.280 7 0.262 8 0.360 2 0.223 −0.072 0.368 54.15 0.494 0.487 516 528 0.198 106 0.075 758
Df4CL2 0.325 2 0.331 3 0.242 6 0.344 9 0.233 −0.021 0.400 56.01 0.532 0.506 587 605 0.010 744 0.061 157
Df4CL3 0.340 9 0.398 4 0.245 6 0.226 0 0.249 0.105 0.470 56.93 0.509 0.495 566 585 0.029 060 0.066 667
Df4CL4 0.353 8 0.314 9 0.280 5 0.258 1 0.214 0.002 0.411 57.59 0.466 0.491 569 589 0.135 654 0.076 401
Sm4CL1 0.107 9 0.570 5 0.074 4 0.470 6 0.270 0.181 0.513 37.59 0.845 0.629 524 537 0.181 750 0.057 728
Sm4CL2 0.152 8 0.502 2 0.171 7 0.401 5 0.256 0.142 0.486 45.20 0.730 0.593 533 544 0.094 669 0.068 015
Pp4CL1 0.322 2 0.329 8 0.289 9 0.306 2 0.201 0.018 0.420 59.35 0.501 0.495 788 813 −0.150 923 0.065 191
Pp4CL2 0.262 7 0.394 9 0.259 7 0.322 6 0.211 0.031 0.424 57.22 0.572 0.522 705 726 −0.048 623 0.064 738
Pp4CL3 0.271 0 0.363 6 0.280 1 0.316 0 0.194 0.016 0.420 59.11 0.545 0.510 672 698 −0.252 006 0.080 229
Pt4CL1 0.255 8 0.428 6 0.214 1 0.364 8 0.257 0.094 0.467 49.55 0.617 0.530 527 537 0.099 814 0.068 901
Pt4CL2 0.257 5 0.423 0 0.207 1 0.375 3 0.258 0.100 0.471 49.60 0.620 0.532 527 537 0.105 587 0.068 901
At4CL1 0.313 6 0.366 2 0.286 7 0.293 8 0.262 0.110 0.477 56.69 0.514 0.481 547 561 0.018 360 0.065 954
At4CL2 0.289 2 0.384 1 0.281 7 0.302 1 0.219 0.035 0.431 55.41 0.536 0.484 541 556 −0.012 770 0.064 748
At4CL3 0.351 8 0.341 2 0.341 7 0.192 0 0.228 0.075 0.451 52.67 0.429 0.460 552 561 −0.017 290 0.065 954
At4CL4 0.329 0 0.324 7 0.290 3 0.313 1 0.250 0.068 0.455 58.24 0.496 0.477 552 570 −0.032 807 0.068 421
Nt4CL1 0.445 5 0.215 9 0.343 0 0.258 8 0.197 −0.090 0.359 50.61 0.361 0.423 529 542 0.029 520 0.075 646
Nt4CL2 0.443 2 0.204 5 0.323 0 0.291 0 0.222 −0.071 0.371 52.31 0.377 0.429 531 547 0.037 294 0.073 126
Nt4CL3 0.445 5 0.227 3 0.337 4 0.253 4 0.208 −0.060 0.377 51.85 0.366 0.423 528 542 0.022 694 0.075 646
Gm4CL1 0.290 1 0.389 0 0.274 6 0.280 5 0.238 0.061 0.448 57.44 0.534 0.500 534 546 0.077 473 0.069 597
Gm4CL2 0.320 8 0.429 2 0.239 0 0.264 2 0.226 0.040 0.436 51.45 0.546 0.497 535 547 −0.120 110 0.069 470
Gm4CL3 0.249 5 0.398 7 0.252 8 0.335 7 0.238 0.081 0.457 56.91 0.588 0.523 558 570 0.068 772 0.068 421
Gm4CL4 0.245 7 0.428 9 0.237 4 0.323 5 0.238 0.083 0.457 55.41 0.603 0.526 549 562 0.097 153 0.069 395
Os4CL1 0.080 8 0.615 7 0.057 6 0.485 0 0.254 0.146 0.500 35.69 0.885 0.646 538 554 0.061 011 0.064 982
Os4CL2 0.329 0 0.324 7 0.290 3 0.313 1 0.250 0.068 0.455 58.24 0.496 0.477 552 570 −0.032 807 0.068 421
Os4CL4 0.118 3 0.548 4 0.090 7 0.477 8 0.255 0.172 0.513 40.13 0.825 0.630 544 559 0.075 313 0.064 401
Lp4CL1 0.033 2 0.580 9 0.037 1 0.565 4 0.275 0.214 0.535 32.55 0.941 0.692 555 570 0.201 754 0.057 895
Lp4CL2 0.110 6 0.597 9 0.076 6 0.429 6 0.294 0.237 0.550 37.91 0.842 0.644 544 556 0.167 446 0.061 151
Lp4CL3 0.038 7 0.651 6 0.047 7 0.496 3 0.281 0.215 0.537 32.64 0.928 0.662 544 557 0.085 637 0.059 246
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这些参数中，CAI、CBI 和 NC 常用于预测基因表
达水平[15]。一般 CAI 和 CBI 呈现正相关性，值在
0～1，越接近 1 表示密码子偏好性越强，基因表
达水平越高[16-17]，而与 NC 则呈现负相关，NC
数值一般在 20～61，越靠近 20 表示同义密码子偏
性越大，越靠近 61 表示同义密码子偏性越小[18]。
高表达基因其密码子偏爱程度大，CAI 和 CBI 值
偏大而 NC 值较小；低表达基因则含有较多种类
的稀有密码子，故偏爱程度低，CAI、CBI 值较小
而 NC 值较大，其值会受到基因氨基酸组成和基
因长短的影响[19-20]。从数据上看，黑麦草 Lp4CL1、
Lp4CL2 和 Lp4CL3，水稻 Os4CL1，小立碗藓
Sm4CL1 的 NC 值在 35 左右，表达水平较高，而
小立碗藓 Pp4CL1-4，拟南芥 At4CL2、At4CL4，
大豆 Gm4CL1、Gm4CL3-4，水稻 Os4CL2 的 NC
值在 55 以上，表达水平较低，剩下的 4CL 基因
表达水平一般。一般认为 GC 量和 GC3s 这 2 个因
素对基因的密码子选择有重要影响。在这 9 种植
物 28条基因序列中 13条 4CL基因GC量小于 0.5，
预示 4CL 基因对 GC 没有明显的偏好性。GC3s
值大于 0.5 的占 28%，说明大部分 4CL 基因偏好
以 A/T 结尾的密码子。
2.2 4CL 基因家族 RSCU 分析
RSCU 是一个氨基酸所对应的密码子实际运用
个数与理论运用个数之间的比值，能直观地反映出
密码子使用的偏好性程度[21]，与基因长度和氨基酸
丰度无关。当实际运用个数与理论运用个数相同时，
RSCU＝1，此时密码子不存在偏好性；当 RSCU＞1
时，则说明该密码子出现的频率比其他同义密码子
高，为基因偏好使用的密码子；当 RSCU＜1 时，则
密码子出现的相对频率较低，是基因较少使用的密
码子。通过比较发现（表 3），在烟草中，RSCU＞1
的密码子有 29 个，水稻中有 28 个，黑麦草中有 25
个，拟南芥中有 31 个，火炬松中有 28 个，江南卷
柏中有 28 个，这些密码子即为这些植物的最常使用
的密码子，即最优密码子。
表 3 香鳞毛蕨与其他植物中 4CL 基因家族 RSCU
Table 3 Relatively synonymous codon usage (RSCU) of 4CL gene in D. fragrans and other plants
个数 RSCU 氨基酸 密码子
1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8
Phe UUU 8.8 18.7 1.0 1.3 10.3 14.0 8.5 0.0 0.93 1.27 0.36 0.38 1.11 1.02 0.69 0.00
UUC 10.0 10.7 7.0 5.7 8.3 13.5 16.0 6.0 1.07 0.73 1.83 1.62 0.89 0.98 1.31 2.00
Leu UUA 3.3 7.3 0.3 0.0 4.8 7.5 2.0 0.0 0.35 8.30 0.06 0.00 0.70 0.75 0.36 0.00
UUG 13.8 11.3 0.3 1.0 5.8 12.8 8.0 6.5 1.47 1.66 0.06 0.16 0.85 1.27 1.43 1.10
CUU 11.8 9.0 8.0 7.7 9.3 9.8 7.0 3.0 1.25 1.32 1.47 1.20 1.36 0.97 11.50 0.51
CUC 8.3 5.3 10.3 14.7 12.8 13.3 4.5 14.0 0.88 0.78 1.90 2.30 1.88 1.32 9.00 2.37
CUA 8.0 1.3 4.3 7.3 5.8 5.8 4.0 5.0 0.85 0.20 0.80 1.15 0.85 0.57 0.72 0.85
CUG 11.3 6.7 9.3 7.7 2.5 11.0 8.0 7.0 1.20 0.98 1.71 1.20 0.37 1.10 1.43 1.18
Ile AUU 10.8 17.3 4.0 3.3 8.0 9.8 9.5 8.0 1.13 1.64 0.80 0.75 1.04 1.13 1.30 1.26
AUC 10.8 5.7 2.7 1.7 11.5 9.3 9.5 10.0 1.13 0.54 1.00 1.00 1.5 1.07 1.30 1.58
AUA 7.0 8.7 1.0 0.7 3.5 7.0 30.0 10.0 0.74 0.82 0.20 0.15 0.46 0.81 0.41 0.16
Met AUG 8.0 12.3 2.7 1.7 5.0 12.8 8.0 3.0 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 2.00 1.00
Val GUU 7.5 13.3 11.7 8.3 14.8 12.0 3.0 3.0 1.26 1.44 1.22 1.01 1.92 1.31 0.75 0.67
GUC 5.3 5.3 15.0 15.3 6.5 9.8 80.0 5.0 0.88 0.58 1.57 1.86 0.85 1.06 2.00 1.11
GUA 3.5 5.7 4.0 1.7 2.8 5.8 3.0 0.0 0.59 0.61 0.42 0.2 0.36 0.63 0.75 0.00
GUG 7.5 12.7 7.7 7.7 6.8 9.3 20.0 10.0 1.26 1.37 0.80 0.93 0.88 1.01 0.50 2.22
Ser UCU 12.3 11.0 1.0 1.3 12.3 16.5 11.0 7.0 1.05 1.68 0.36 0.49 1.41 1.16 1.18 0.88
UCC 12.8 7.3 6.3 5.0 8.5 14.3 8.0 12.0 1.09 1.12 2.28 1.84 0.98 1.00 0.86 1.52
UCA 10.8 8.3 1.3 1.3 9.5 13.8 10.0 5.0 0.92 1.27 0.48 0.49 1.10 0.96 1.07 0.63
UCG 10.0 3.7 5.0 5.3 4.0 17.5 10.0 10.5 0.85 0.56 1.80 1.96 0.46 1.23 1.07 1.33
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 10 期 2016 年 5 月

• 1757 •
续表 3
个数 RSCU 氨基酸 密码子
1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8
Pro CCU 9.8 9.0 14.3 11.7 9.3 13.3 11.5 13.0 1.12 1.23 1.15 0.97 1.18 1.09 1.03 0.95
CCC 7.8 7.7 12.7 11.0 6.5 8.8 9.0 13.0 0.89 1.05 1.02 0.92 0.83 0.72 0.81 0.95
CCA 10.8 7.7 9.3 9.3 9.0 16.3 13.0 21.5 1.24 1.05 0.75 0.78 1.31 1.34 1.71 1.58
CCG 6.5 5.0 13.3 16.0 6.5 10.3 11.0 7.0 0.75 0.68 1.07 1.33 0.83 0.85 0.99 0.51
Thr ACU 4.3 8.0 1.7 2.0 9.0 11.3 3.0 4.0 0.83 1.23 0.54 0.75 1.31 0.98 0.67 0.94
ACC 5.0 2.7 3.7 5.3 7.0 10.3 2.0 1.0 0.98 0.41 1.19 2.00 1.02 0.90 0.44 0.24
ACA 8.8 10.7 2.7 1.0 8.3 17.5 9.0 7.0 1.71 1.64 0.86 0.38 1.20 1.53 2.00 1.65
ACG 2.5 4.7 4.3 2.3 3.3 6.8 4.0 5.0 0.49 0.72 1.41 0.88 0.47 0.59 0.89 1.18
Ala GCU 9.0 14.3 20.3 26.0 11.0 15.3 12.0 19.0 0.82 1.91 1.44 1.54 1.60 1.21 1.37 1.23
GCC 12.5 4.7 14.3 2.0 1.14 15.8 6.0 13.0 1.70 0.62 1.02 1.28 1.02 1.25 0.69 0.84
GCA 16.8 9.0 9.3 10.0 7.8 13.0 11.0 16.0 1.53 1.20 0.66 0.59 1.13 1.03 1.26 1.03
GCG 5.5 2.0 12.3 10.0 0.5 6.3 6.0 14.0 1.80 0.27 0.88 0.59 0.25 0.50 0.69 0.90
Tyr UAU 8.3 8.7 1.7 0.7 6.3 5.3 4.0 1.0 1.14 0.98 0.91 0.44 1.39 0.93 1.00 0.67
UAC 6.3 9.0 2.0 2.3 2.8 6.0 4.0 2.0 0.86 1.02 1.09 1.56 0.61 1.07 1.00 1.33
His CAU 14.3 6.3 15.0 16.3 13.0 18.3 0.5 21.0 1.36 1.15 1.06 1.07 1.06 1.23 0.13 1.33
CAC 6.8 4.7 13.3 14.3 11.5 11.5 2.0 10.5 0.64 0.85 0.94 0.93 0.94 0.77 0.50 0.67
Gln CAA 11.5 9.7 18.0 17.3 16.3 19.8 9.0 13.5 1.24 1.18 1.24 1.37 1.59 1.20 1.29 1.06
CAG 7.0 6.7 11.0 80 4.3 13.3 5.0 12.0 0.50 0.82 0.76 0.63 0.41 0.80 0.71 0.94
Asn AAU 8.8 12.3 1.7 0.7 9.8 14.3 13.0 1.0 1.15 1.32 0.71 0.33 1.07 1.18 1.18 1.00
AAC 6.5 6.3 3.0 3.3 8.5 10.0 9.0 1.0 0.85 0.68 1.29 1.67 0.93 0.82 0.82 1.00
Lys AAA 9.5 21.7 2.7 2.7 15.5 10.3 7.0 1.0 0.92 1.24 0.52 0.43 1.41 0.78 1.56 0.29
AAG 11.3 13.3 7.7 9.7 6.5 16.0 2.0 6.0 1.08 0.76 1.48 1.57 0.59 1.22 0.44 1.71
Asp GAU 11.0 18.7 12.0 14.3 23.0 14.5 9.0 8.0 1.07 1.42 0.75 0.88 1.50 1.00 0.90 0.78
GAC 9.5 7.7 20.0 18.3 7.8 14.5 11.0 12.5 0.93 0.58 1.25 1.12 0.50 1.00 1.10 1.22
Glu GAA 10.8 13.3 12.0 11.3 17.3 18.0 18.5 7.0 1.01 1.25 0.75 0.96 1.16 1.01 1.57 1.17
GAG 10.5 8.0 14.7 12.3 12.5 17.5 5.0 5.0 0.99 0.75 1.10 1.04 0.84 0.99 0.43 0.83
Cys UGU 9.5 8.7 2.7 2.0 7.0 15.5 7.0 6.0 0.86 0.76 0.52 0.46 0.90 1.02 0.78 0.86
UGC 12.5 14.0 7.7 6.7 8.5 15.0 11.0 8.0 1.14 1.24 1.48 1.54 1.10 0.98 1.22 1.14
Arg CGU 3.5 3.0 20.0 20.3 15.0 9.5 16.5 16.0 0.58 0.53 1.40 1.31 1.42 0.82 1.14 1.18
CGC 3.8 2.3 28.3 33.0 9.0 6.5 6.0 16.5 0.63 0.42 1.98 2.31 0.85 0.56 0.41 1.21
CGA 4.3 6.7 17.7 18.3 13.5 16.5 18.0 12.0 0.71 1.19 1.24 1.18 1.28 1.43 0.88 0.88
CGG 5.5 2.0 14.0 14.7 9.8 9.3 15.5 19.0 0.92 0.36 0.98 0.95 0.92 0.80 1.07 1.40
Ser AGU 9.5 4.3 0.3 1.0 9.0 13.0 4.0 3.0 0.81 0.66 0.12 0.37 1.04 0.91 0.43 0.38
AGC 15.0 4.7 2.7 2.3 8.8 10.5 13.0 10.0 1.28 0.71 0.96 0.86 1.01 0.74 1.39 1.26
Arg AGA 9.5 12.0 1.3 1.7 11.0 13.8 13.0 8.0 1.58 2.14 0.12 0.09 1.04 1.19 0.90 0.59
AGG 9.5 7.7 4.0 5.3 5.0 13.8 18.0 10.0 1.58 1.37 0.28 0.34 0.47 1.19 1.24 0.74
Gly GGU 9.8 7.0 18.3 17.3 12.3 12.3 6.0 8.0 1.20 0.98 0.92 0.91 1.46 1.24 0.91 0.65
GGC 7.5 5.0 26.3 27.7 6.8 7.5 9.0 17.5 0.92 0.70 1.33 1.46 0.81 0.76 1.36 1.41
GGA 8.3 10.7 20.0 18.0 10.5 12.5 5.0 11.0 1.02 1.49 1.01 0.95 1.25 1.27 0.75 0.89
GGG 7.0 6.0 130 14.7 4.0 7.3 6.5 13.0 0.86 0.84 0.74 0.68 0.48 0.73 0.98 1.05
1-香磷毛厥 2-烟草 3-水稻 4-黑麦草 5-拟南芥 6-小立碗藓 7-火炬松 8-江南卷柏
1-D. fragrans 2-N. tabacum 3-O. sAtiva 4-L. perenne 5-A. thaliana 6-P. patens 7-P. teada 8-S. moellendorffii
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 10 期 2016 年 5 月

• 1758 •
2.3 Df4CL 基因家族密码子使用分析
通过表 1 可以看出，4CL 基因在不同物种中
一般以基因家族的形式出现，而本研究中前期获
得的 Df4CL 基因，通过序列比对也确定为一个家
族。利用 CodonW 软件分析 Df4CL 基因家族密码
子使用情况（表 2），发现香鳞毛蕨 Df4CL2-4 的
NC 值在 55 以上，表达水平较低，而 DF4CL1 的
CAI 值最大，NC 值相对较小，推测在无外界胁迫
下，Df4CL 基因家族内部更偏向于使用 DF4CL1。
Df4CL 家族内部的 GC 量平均为 0.495，GC3s 平
均量为 0.500，说明香鳞毛蕨对 ATGC 选择没有偏
向性。总体来看，香鳞毛蕨与小立碗藓的密码子
使用情况基本一致。
通过对 4CL 基因家族 RSCU 分析（表 3），在
香鳞毛蕨中，最优密码子 RSCU＞1 的密码子有
29 个，其中 22 个与拟南芥最优密码子使用情况
相一致，20 个与烟草最优密码子使用情况相一致，
密码子相对使用度越一致越容易实现基因的外源
表达。而其余密码子略有不同，例如 Phe 在香鳞
毛蕨中密码子应用 UUC，而拟南芥和烟草密码子
使用 UUU 等。
2.4 Df4CL 基因家族表达预测
鉴定基因的功能、蛋白特性及转基因经常需要
基因的异源表达，而这个过程常常受到各种因素
的限制，其中基因密码子与宿主密码子使用偏性
的差异是影响表达的重要因素之一。如果外源基
因含有大量与宿主表达系统差异较大的罕见密码
子，特别是当罕见密码子成连续分布的时候，就
会造成表达量极低或翻译提前终止。所以 4CL 基
因在异源宿主内表达时必须要考虑密码子偏好性。基
因密码子与宿主密码子使用频率的比值在 0.5～2.0，
表示二者的密码子偏好性较为接近，比值≤0.5 或比
值≥2.0，表示偏好性差异较大。本研究将 Df4CL
基因家族与大肠杆菌、酵母、拟南芥、烟草密码
子使用频率进行比较。从表 4 中不难发现，在
Df4CL1 基因与大肠杆菌、酵母、拟南芥和烟草的
使用频率比值中，分别有 20、21、16 和 17 个；
分析 Df4CL2 基因与大肠杆菌、酵母、拟南芥和
烟草的使用频率比值中，分别有 19、22、16 和
20 个；在 Df4CL3 中与大肠杆菌、酵母、拟南芥
和烟草的使用频率比值中，分别有 18、18、14
和 20 个，在 Df4CL4 中与大肠杆菌、酵母、拟
南芥和烟草的使用频率比值中，分别有 26、18、
14 和 12 个，说明 Df4CL1、Df4CL2、Df4CL3
基因更适合在拟南芥中外源表达；而 Df4CL4 基
因更适合在拟南芥和烟草中表达。
表 4 香鳞毛蕨 4CL 基因与其他植物基因组的密码子出现频率 (f)
Table 4 Codon frequency and ratios of Df4CL gene in D. fragrans and various plants genome
香鳞毛蕨 (f×10−3) 大肠杆菌 (f×10−3) 酵母 (f×10−3) 拟南芥 (f×10−3) 烟草 (f×10−3) 密码子 氨基酸
4CL1 4CL2 4CL3 4CL4 4CL1 4CL2 4CL3 4CL4 4CL1 4CL2 4CL3 4CL4 4CL1 4CL2 4CL3 4CL4 4CL1 4CL2 4CL3 4CL4
GCA A 38.889 21.452 23.891 23.729 1.888 1.041 1.160 1.152 2.415 1.332 1.484 1.474 2.222 1.226 1.365 1.356 1.684 0.929 1.034 1.027
GCC A 20.370 23.102 13.652 30.508 0.799 0.906 0.535 1.196 1.630 1.848 1.092 2.441 1.978 2.243 1.325 2.962 1.630 1.848 1.092 2.441
GCG A 14.815 14.851 10.239 8.475 0.467 0.468 0.323 0.267 2.429 2.435 1.679 1.389 1.646 1.650 1.138 0.942 2.554 2.561 1.765 1.461
GCT A 27.778 24.752 22.184 30.508 1.781 1.587 1.422 1.956 1.316 1.173 1.051 1.446 0.982 0.875 0.784 1.078 0.890 0.793 0.711 0.978
TGC C 9.259 11.551 5.119 6.780 1.342 1.674 0.742 0.983 1.970 2.458 1.089 1.443 1.286 1.604 0.711 0.942 1.286 1.604 0.711 0.942
TGT C 11.111 4.950 1.706 3.390 2.020 0.900 0.310 0.616 1.389 0.619 0.213 0.424 1.058 0.471 0.162 0.323 1.134 0.505 0.174 0.346
GAC D 11.111 19.802 23.891 20.339 0.597 1.065 1.284 1.093 0.550 0.980 1.183 1.007 0.646 1.151 1.389 1.183 0.657 1.172 1.414 1.203
GAT D 37.037 31.353 22.184 20.339 1.154 0.977 0.691 0.634 0.980 0.829 0.587 0.538 1.012 0.857 0.606 0.556 1.004 0.850 0.601 0.551
GAA E 20.370 21.452 22.184 23.729 0.533 0.562 0.581 0.621 0.420 0.442 0.457 0.489 0.594 0.625 0.647 0.692 0.566 0.596 0.616 0.659
GAG E 55.556 44.554 18.771 27.119 3.139 2.517 1.061 1.532 2.909 2.333 0.983 1.420 1.725 1.384 0.583 0.842 1.890 1.515 0.638 0.922
TTC F 16.667 23.102 27.304 13.559 0.986 1.367 1.616 0.802 0.916 1.269 1.500 0.745 0.805 1.116 1.319 0.655 0.926 1.283 1.517 0.753
TTT F 31.481 11.551 15.358 30.508 1.357 0.498 0.662 1.315 1.206 0.443 0.588 1.169 1.444 0.530 0.704 1.399 1.254 0.460 0.612 1.215
GGA G 9.259 11.551 17.065 15.254 1.029 1.283 1.896 1.695 0.849 1.060 1.566 1.399 0.383 0.477 0.705 0.630 0.399 0.498 0.736 0.658
GGC G 12.963 23.102 22.184 30.508 0.465 0.828 0.795 1.093 1.336 2.382 2.287 3.145 1.409 2.511 2.411 3.316 1.157 2.063 1.981 2.724
GGG G 22.222 13.201 6.826 15.254 1.967 1.168 0.604 1.350 3.704 2.200 1.138 2.542 2.179 1.294 0.669 1.495 2.116 1.257 0.650 1.453
GGT G 12.963 18.152 15.358 27.119 0.531 0.744 0.629 1.111 0.540 0.756 0.640 1.130 0.584 0.818 0.692 1.222 0.581 0.814 0.689 1.216
CAC H 14.815 14.851 13.652 10.169 1.512 1.515 1.393 1.038 1.924 1.929 1.773 1.321 1.703 1.707 1.569 1.169 1.703 1.707 1.569 1.169
CAT H 9.259 23.102 25.597 20.339 0.681 1.699 1.882 1.496 0.676 1.686 1.868 1.485 0.671 1.674 1.855 1.474 0.691 1.724 1.91 1.518
ATA I 25.926 6.601 3.413 18.644 4.801 1.222 0.632 3.453 1.457 0.371 0.192 1.047 2.058 0.524 0.271 1.480 1.852 0.472 0.244 1.332
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 10 期 2016 年 5 月

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续表 4
香鳞毛蕨 (f×10−3) 大肠杆菌 (f×10−3) 酵母 (f×10−3) 拟南芥 (f×10−3) 烟草 (f×10−3)
密码子 氨基酸
4CL1 4CL2 4CL3 4CL4 4CL1 4CL2 4CL3 4CL4 4CL1 4CL2 4CL3 4CL4 4CL1 4CL2 4CL3 4CL4 4CL1 4CL2 4CL3 4CL4
ATC I 24.074 24.752 37.543 23.729 0.995 1.023 1.551 0.981 1.416 1.456 2.208 1.396 1.301 1.338 2.029 1.283 1.732 1.781 2.701 1.707
ATT I 22.222 37.954 27.304 20.339 0.746 1.274 0.916 0.683 0.731 1.248 0.898 0.669 1.034 1.765 1.270 0.946 0.799 1.365 0.982 0.732
AAA K 24.074 16.502 23.891 27.119 0.725 0.497 0.720 0.817 0.570 0.391 0.566 0.643 0.782 0.536 0.776 0.880 0.738 0.506 0.733 0.832
AAG K 35.185 36.304 27.304 28.814 3.288 3.393 2.552 2.693 1.146 1.183 0.889 0.939 1.076 1.110 0.835 0.881 1.050 1.084 0.815 0.86
CTA L 3.704 1.650 8.532 10.169 0.926 0.413 2.133 2.542 0.278 0.124 0.642 0.765 0.268 0.120 0.618 0.737 0.394 0.176 0.908 1.082
CTC L 29.630 14.851 23.891 16.949 2.694 1.350 2.172 1.541 5.487 2.750 4.424 3.139 1.840 0.922 1.484 1.053 2.409 1.207 1.942 1.378
CTG L 11.111 18.152 17.065 16.949 0.218 0.357 0.335 0.333 1.068 1.745 1.641 1.630 1.134 1.852 1.741 1.729 1.089 1.780 1.673 1.662
CTT L 20.370 18.152 23.891 28.814 1.741 1.551 2.042 2.463 1.683 1.500 1.974 2.381 0.845 0.753 0.991 1.196 0.849 0.756 0.995 1.201
TTA L 7.407 8.251 8.532 5.085 0.533 0.594 0.614 0.366 0.277 0.309 0.320 0.190 0.583 0.650 0.672 0.400 0.553 0.616 0.637 0.379
TTG L 20.370 21.452 15.358 30.508 1.455 1.532 1.097 2.179 0.754 0.795 0.569 1.130 0.975 1.026 0.735 1.460 0.913 0.962 0.689 1.368
ATG M 24.074 28.053 29.01 28.814 0.892 1.039 1.074 1.067 1.152 1.342 1.388 1.379 0.983 1.145 1.184 1.176 0.963 1.122 1.160 1.153
AAC N 12.963 3.300 13.652 5.085 0.606 0.154 0.638 0.238 0.521 0.133 0.548 0.204 0.620 0.158 0.653 0.243 0.724 0.184 0.763 0.284
AAT N 14.815 18.152 18.771 15.254 0.797 0.976 1.009 0.82 0.408 0.500 0.517 0.420 0.664 0.814 0.842 0.684 0.529 0.648 0.670 0.545
CCA P 14.815 23.102 13.652 6.780 1.743 2.718 1.606 0.798 0.814 1.269 0.750 0.373 0.920 1.435 0.848 0.421 0.748 1.167 0.689 0.342
CCC P 14.815 13.201 20.478 11.864 2.554 2.276 3.531 2.046 2.179 1.941 3.011 1.745 2.795 2.491 3.864 2.238 2.245 2.000 3.103 1.798
CCG P 12.963 11.551 6.826 10.169 0.595 0.530 0.313 0.466 2.446 2.179 1.288 1.919 1.507 1.343 0.794 1.182 2.593 2.310 1.365 2.034
CCT P 18.519 9.901 20.478 28.814 2.537 1.356 2.805 3.947 1.362 0.728 1.506 2.119 0.990 0.529 1.095 1.541 0.990 0.529 1.095 1.541
CAA Q 11.111 23.102 20.478 16.949 0.741 1.540 1.365 1.130 0.404 0.840 0.745 0.616 0.573 1.191 1.056 0.874 0.537 1.116 0.989 0.819
CAG Q 20.37 14.851 22.184 11.864 0.691 0.503 0.752 0.402 1.683 1.227 1.833 0.980 1.340 0.977 1.459 0.781 1.358 0.990 1.479 0.791
AGA R 12.963 6.601 5.119 8.475 4.47 2.276 1.765 2.922 0.609 0.310 0.240 0.398 0.682 0.347 0.269 0.446 0.810 0.413 0.320 0.530
AGG R 5.556 8.251 3.413 6.780 2.924 4.343 1.796 3.568 0.604 0.897 0.371 0.737 0.505 0.750 0.310 0.616 0.455 0.676 0.280 0.556
CGA R 1.852 6.601 8.532 5.085 0.475 1.693 2.188 1.304 0.617 2.200 2.844 1.695 0.294 1.048 1.354 0.807 0.349 1.245 1.610 0.959
CGC R 11.111 13.201 15.358 10.169 0.529 0.629 0.731 0.484 4.273 5.077 5.907 3.911 2.924 3.474 4.042 2.676 3.003 3.568 4.151 2.748
CGG R 0.000 1.650 3.413 1.695 0.000 0.262 0.542 0.269 0.000 0.971 2.008 0.997 0.000 0.337 0.697 0.346 0.000 0.446 0.922 0.458
CGT R 1.852 3.300 6.826 6.780 0.091 0.163 0.336 0.334 0.285 0.508 1.050 1.043 0.206 0.367 0.758 0.753 0.247 0.440 0.910 0.904
AGC S 12.963 24.752 25.597 20.339 0.810 1.547 1.600 1.271 1.336 2.552 2.639 2.097 1.147 2.190 2.265 1.800 1.296 2.475 2.560 2.034
AGT S 3.704 1.650 3.413 1.695 0.390 0.174 0.359 0.178 0.261 0.116 0.240 0.119 0.265 0.118 0.244 0.121 0.278 0.124 0.257 0.127
TCA S 5.556 13.201 10.239 22.034 0.712 1.692 1.313 2.825 0.296 0.702 0.545 1.172 0.304 0.721 0.560 1.204 0.316 0.750 0.582 1.252
TCC S 5.556 16.502 25.597 20.339 0.624 1.854 2.876 2.285 0.391 1.162 1.803 1.432 0.496 1.473 2.285 1.816 0.545 1.618 2.510 1.994
TCG S 3.704 11.551 10.239 3.390 0.426 1.328 1.177 0.390 0.436 1.359 1.205 0.399 0.398 1.242 1.101 0.365 0.699 2.179 1.932 0.640
TCT S 22.222 18.152 25.597 16.949 2.554 2.086 2.942 1.948 0.946 0.772 1.089 0.721 0.882 0.720 1.016 0.673 1.111 0.908 1.280 0.847
ACA T 12.963 18.152 11.945 16.949 1.581 2.214 1.457 2.067 0.728 1.020 0.671 0.952 0.826 1.156 0.761 1.080 0.745 1.043 0.686 0.974
ACC T 1.852 6.601 20.478 10.169 0.081 0.290 0.898 0.446 0.147 0.524 1.625 0.807 0.180 0.641 1.988 0.987 0.191 0.681 2.111 1.048
ACG T 11.111 9.901 3.413 6.780 0.751 0.669 0.231 0.458 1.406 1.253 0.432 0.858 1.443 1.286 0.443 0.881 2.469 2.200 0.758 1.507
ACT T 18.519 6.601 13.652 11.864 2.035 0.725 1.500 1.304 0.912 0.325 0.673 0.584 1.058 0.377 0.780 0.678 0.912 0.325 0.673 0.584
GTA V 18.519 11.551 13.652 22.034 1.668 1.041 1.230 1.985 1.569 0.979 1.157 1.867 1.871 1.167 1.379 2.226 1.624 1.013 1.198 1.933
GTC V 14.815 23.102 34.13 15.254 0.981 1.53 2.260 1.010 1.277 1.992 2.942 1.315 1.157 1.805 2.666 1.192 1.335 2.081 3.075 1.374
GTG V 42.593 39.604 15.358 20.339 1.670 1.553 0.602 0.798 4.018 3.736 1.449 1.919 2.448 2.276 0.883 1.169 2.550 2.371 0.920 1.218
GTT V 20.370 24.752 29.010 18.644 1.101 1.338 1.568 1.008 0.926 1.125 1.319 0.847 0.749 0.910 1.067 0.685 0.760 0.924 1.082 0.696
TGG W 0.000 1.650 3.413 5.085 0.000 0.109 0.225 0.335 0.000 0.16 0.331 0.494 0.000 0.132 0.273 0.407 0.000 0.135 0.280 0.417
TAC Y 12.963 13.201 8.532 15.254 1.071 1.091 0.705 1.261 0.888 0.904 0.584 1.045 0.946 0.964 0.623 1.113 0.960 0.978 0.632 1.130
TAT Y 12.963 11.551 11.945 11.864 0.786 0.700 0.724 0.719 0.686 0.611 0.632 0.628 0.888 0.791 0.818 0.813 0.728 0.649 0.671 0.667
TAA * 0.000 1.650 1.706 1.695 0.000 0.825 0.853 0.848 0.000 1.650 1.706 1.695 0.000 1.833 1.896 1.883 0.000 1.500 1.551 1.541
TAG * 1.852 0.000 0.000 0.000 6.173 0.000 0.000 0.000 3.704 0.000 0.000 0.000 3.704 0.000 0.000 0.000 3.704 0.000 0.000 0.000
TGA * 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
*终止密码子；下划线：表示两个物种密码子比较具有明显偏差（≤0.5，≥2.0）的分值
*Terminate codons. Data with underline: There are obvious differences of values (≤ 0.5, ≥ 2.0) between the codons of two species
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 10 期 2016 年 5 月

• 1760 •
2.5 香鳞毛蕨 4CL 基因家族聚类分析
为进一步了解所列物种 4CL 基因密码子使用
差异的大小，根据表 3 中基于密码子使用频率的聚
类树状图（图 1）分析，可以看出，火炬松密码子
使用频率与其他植物相比具有明显的差异性，而香
鳞毛蕨与小立碗藓聚为一类，这表明亲缘关系较近
的物种，密码子使用偏好性也比较相近，但它们与
拟南芥也聚为一类，说明某些物种也存在一定的差
异，但也进一步说明，香鳞毛蕨基因在拟南芥植物
中表达是可行的。


图 1 基于 4CL 基因的 RSCU 的聚类树状图
Fig. 1 Cluster dendrogram of RSCU values based on 4CL gene
3 讨论
苯丙烷代谢途径是植物三大代谢途径之一，
可产生植物体中约有五分之一的次级代谢产物，
而这些次级代谢产物不但对于植物本身具有不可
替代的作用，而对于人们的健康也具有非凡的意
义。黄酮类物质就是其中一个，为了更好地发挥
药效，以期次级代谢产物更多的积累，而这条代
谢途径中的关键基因将影响次级代谢产物的积累
和调控。本研究中主要研究苯丙烷代谢途径中的
关键调节酶 4CL 的基因，通过密码子使用特性预
测其表达体系，为更好地表达蛋白提供重要的理
论依据。
通过前期实验获得 Df4CL 基因 4 条，通过序列
比对、保守区确定获得的 4 条 4CL 基因为一个基因
家族。将 Df4CL 基因密码子使用频率与代表生物大
肠杆菌、酵母和拟南芥、烟草基因组密码子使用频
率进行比较，结果显示 Df4CL 基因密码子与大肠杆
菌、酵母、烟草的差异较大，要想在其内表达，还
需经过密码子优化，Df4CL 基因更适合在拟南芥中
表达。这一结果可以为今后 Df4CL 基因在宿主中实
现较高水平表达的研究确立方向，也可为通过优化
密码子提高基因的表达量提供依据。
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水稻

黑麦草

江南卷柏

香鳞毛蕨

小立碗藓

拟南芥

烟草

火炬松
0 5 10 15 20 25
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 10 期 2016 年 5 月

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