全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 10 期 2013 年 5 月

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高压脉冲电场法快速提取黄花乌头中关附甲素的工艺研究
白永智，李昌禹，赵景辉，王英平*
中国农业科学院特产研究所，吉林 吉林 130000
摘 要：目的 研究高压脉冲电场法对黄花乌头中关附甲素的最佳提取工艺，为工业化生产提供可靠的实验数据和理论依据。
方法 采用正交试验设计优化高压脉冲电场法快速提取方法，HPLC 法测定关附甲素的量。结果 提取黄花乌头关附甲素的
最佳提取工艺条件为以 90%乙醇为提取溶剂，电场强度 20 kV/cm，脉冲数为 10，料液比 1∶14，影响因素由大到小依次为
电场强度、料液比、脉冲数；此法提取黄花乌头中的关附甲素提取率达到 0.391%，浸膏得率为 39.92%。结论 本提取工艺
可行、经济、省时、回收率高。
关键词：黄花乌头；关附甲素；正交试验；高压脉冲电场；浸膏得率
中图分类号：R284.2 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2013)10 - 1267 - 04
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2013.10.011
Extracting technology of guanfubase A from Aconitum coreanum by high-voltage
pulsed electric field method
BAI Yong-zhi, LI Chang-yu, ZHAO Jing-hui, WANG Ying-ping
Institute of Special Wild Economic Animal and Plant Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Jilin 130000, China
Abstract: Objective To optimize the extracting technology for guanfubase A from Aconitum coreanum by high-voltage pulsed
electric field method and to provide the reliable experimental data and theoretical basis for the industrial production. Methods The
content of guanfubase A was detected by HPLC in orthogonal test. Results The optimal formulation was as follows: high voltage of
20 kV/cm, impulsion frequency of 10, and solid-to-solvent ratio of 1∶14, with 90% ethanol as extracting solvent, and the influence
factor in size was voltage, impulsion frequency, and solid-to-solvent ratio. The guanfubase A content and extract yield were up to
0.391% and 39.92% in A. coreanum, respectively. Conclusion The extracting technology is feasible and economic, which has the
advantage of time-saving and high recovery rate.
Key words: Aconitum coreanum (Lévl.) Raipaics; guanfubase A; orthogonal test; high-voltage plused electric field; extract yield

黄花乌头Aconitum coreanum (Lévl.) Raipaics系
毛茛科（Ranunculaceae）乌头属 Aconitum L. 植物，
称关白附，白附子[1]，大多以根、块根入药，少数
以全草入药。现代药理研究表明，其根在镇痛、抗
炎、抗心律不齐和强心作用等方面功能显著，其内
含叔胺类二萜生物碱——关附甲素（guanfubase A），
具有明显的抗心律失常作用，而被称为“特异性减
慢心率药”，已开发成我国的原创一类新药，即盐酸
关附甲素注射液[2-4]。目前，在实验研究与生产中，
大多用酸水、加热回流、超声、微波等常规提取方
法，不仅费时费力，而且耗能巨大。高压脉冲电场
辅助提取动植物有效成分是新兴发展起来的一种新
非热源提取技术[5]，起初主要用于牛奶灭菌，原理
是高压脉冲电场在瞬间击穿细胞壁和细胞膜，使其
发生不可逆破坏，从而增大膜透性使其有效成分流
出，进而有助于天然产物的提取。该法由于常温提
取、传递均匀、耗能较低、瞬时提取、对环境无污
染等特点，可有效避免天然物质化学结构被破坏，
同时也容易实现工业连续化生产。
近几年，高压脉冲电场辅助提取植物有效成分
已有研究[6-9]，但尚未见采用此技术提取黄花乌头块
根中关附甲素的文献报道。本实验采用高压脉冲电

收稿日期：2012-11-14
基金项目：吉林省自然科学基金资助项目（201115131）；吉林市科技局项目（201222306）
作者简介：白永智（1985—），男，在读硕士，研究方向为药用植物资源及天然活性组分。Tel: 13944272307 E-mail: byz2075503@163.com
*通信作者 王英平 E-mail: yingpingw@126.com
网络出版时间：2013-03-28 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/12.1108.R.20130328.2015.018.html
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场辅助提取黄花乌头块根中的有效成分关附甲素，
以关附甲素提取率和浸膏得率为指标，采用正交试
验法[10]优化高压脉冲电场提取工艺，为黄花乌头中
关附甲素的提取和开发提供实验基础。
1 仪器与材料
R—201 旋转蒸发器（上海申胜生物技术有限公
司）；LDT—100/4—25.2 型中药高压电场发生器（长
春华迪生物科技开发有限公司）；AL204 型电子分
析天平（美国梅特勒公司）；101—3C 型烘箱（上海
实验仪器厂）；美国 Agilent 1200 高效液相色谱仪。
黄花乌头块根于2011年9月采集于吉林省吉林
市左家镇，经中国农业科学院特产研究所孔祥义副
研究员鉴定为Aconitum coreanum (Lévl.) Raipaics的
根，自然晾干，粉碎备用。
盐酸关附甲素对照品（中国药品生物制品检定
所，批号 100665-200901），乙腈、甲醇为色谱纯，
乙醇、甲酸均为国产分析纯，水为超纯水。
2 方法与结果
2.1 关附甲素的测定
2.1.1 色谱条件 美国 Agilent 公司 TC C18 色谱柱
（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相 A 为 0.2%甲酸
水溶液，B 为 0.2%甲酸乙腈溶液，梯度洗脱：0～5
min，10% B；5～10 min，10%～16% B；10～15 min，
16% B；15～16 min，16%～10% B；16～21 min，
10% B；体积流量 1 mL/min，柱温 35 ℃，进样量 5
μL。色谱图见图 1。
2.1.2 对照品溶液的制备 取盐酸关附甲素对照品
适量，精密称定，加 95%乙醇制成 0.5 mg/mL 溶液，
再将其稀释为 0.05 mg/mL 作为对照品溶液。
2.1.3 供试品溶液的制备 取黄花乌头块根干样约






图 1 关附甲素对照品 (A) 和供试品 (B) 的 HPLC 图
Fig. 1 HPLC chromatograms of guanfubase A reference
substance (A) and sample (B)
50.0 g，粉碎并过 80 目筛，加入 500 mL 95%乙醇浸
湿混匀并隔夜，然后泵入高压脉冲电场提取器（电
场强度 15 kV/cm，脉冲数 10）进行提取，滤液减压
浓缩并定容至100 mL，精确量取2 mL转移至10 mL
容量瓶中，用 95%乙醇定容至刻度，摇匀，即得。
2.1.4 线性关系考察 分别精密吸取 0.05 mg/mL
盐酸关附甲素对照品溶液 2、4、8、16、20、30 μL
注入液相色谱仪，按照“2.1.1”项色谱条件测定。
以进样量为横坐标（X），峰面积积分值为纵坐标（Y）
进行线性回归，得回归方程为 Y＝15.97 X－1.724 1，
r＝0.992 4，结果表明盐酸关附甲素在 0.10～1.50 μg
呈良好的线性关系。
2.1.5 精密度试验 精密吸取 0.05 mg/mL 盐酸关
附甲素对照品溶液 5 μL，在“2.1.1”项色谱条件下
重复进样 6 次，测定盐酸关附甲素峰面积，结果其
峰面积的 RSD 为 0.13%。
2.1.6 稳定性试验 取“2.1.3”供试品溶液，分别
于 0、2、4、6、8、10、12 h 进样 5 μL，测定盐酸
关附甲素峰面积，结果其峰面积的 RSD 为 0.29%，
表明供试品溶液在 12 h 内基本稳定。
2.1.7 重复性试验 按“2.1.3”项方法制备供试品
溶液 5 份，在“2.1.1”项色谱条件下测定，结果样
品中盐酸关附甲素质量分数的 RSD 为 1.49%。
2.1.8 加样回收率试验 取黄花乌头 25.0 g，精密
称定，加入 0.05 mg/mL 盐酸关附甲素对照品溶液适
量，按“2.1.3”项方法制备供试品溶液，在“2.1.1”
项色谱条件下测定盐酸关附甲素的峰面积，计算其
回收率，结果平均回收率为100.86%，RSD为0.92%。
2.1.9 样品测定 取黄花乌头块根 5 份，每份约
50.0 g，精密称定，按“2.1.3”方法制备供试品溶液，
然后各取 5 μL，按“2.1.1”项色谱条件检测关附甲
素的峰面积，并用外标法计算其质量分数分别为
0.386%、0.393%、0.381%、0.376%、0.370%。
2.2 溶剂浓度选择及样品处理
本实验选择 8 种溶液为提取溶剂，分别为水及
40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%乙醇。提
取参数为电场强度 15 kV/cm，脉冲数 8，料液比 1∶
10。取黄花乌头块根干样，粉碎并过 80 目筛，分别
称取 100 g，加入上述不同提取溶液浸湿混匀并隔
夜，然后通过高压脉冲电场提取器进行提取，滤液
减压浓缩并定容至 100 mL，精确量取 2 mL 用于检
测关附甲素的量，其他浓缩后烘干，计算浸膏得率
及关附甲素提取率。结果见表 1。结果显示提取溶
4.0 5.0 6.0 7.0
t / min
4.0 5.0 6.0 7.0
A
B
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表 1 乙醇体积分数对提取效果的影响
Table 1 Effect of ethanol concentration on extraction
乙醇 / % 浸膏 / g 浸膏得率 / % 关附甲素提取率 / %
0 43.05 43.93 0.054
40 61.25 62.50 0.045
50 67.87 69.25 0.231
60 44.35 45.25 0.242
70 52.68 53.75 0.239
80 49.25 50.25 0.317
90 39.69 40.50 0.432
95 40.06 40.88 0.406

液为 90%乙醇时，关附甲素提取率最高，所以选取
90%乙醇为最佳提取溶剂。
浸膏得率＝(提取液浓缩后烘干的质量 / 黄花乌头块根
质量)×100/98
提取率＝提取液中关附甲素的质量 / 黄花乌头块根质量
2.3 提取工艺优化
2.3.1 正交试验 在预试验基础上，以影响黄花乌
头提取的主要因素电场强度（A）、脉冲数（B）及
料液比（C）为考察对象，选用 L9(34) 正交表优化
提取条件，以黄花乌头块根浸膏得率和关附甲素提
取率为考察指标，采用综合评分法评价。
综合评分＝浸膏得率×0.1＋关附甲素提取率×0.9
取样品 9 份，每份 100 g，按正交表 L9(34) 所
列试验因素及水平进行试验，计算各提取液浸膏得
率及关附甲素提取率，进行综合评分，并以综合评
分为考察指标进行方差分析。试验设计与结果见表
2，方差分析见表 3。
由直观分析可知，影响黄花乌头块根提取的主
次因素依次为 A＞C＞B，即电场强度＞料液比＞脉
冲数；由方差分析可知，因素 A、C 具有极显著性
差异（P＜0.01），因素 B 具有显著性差异（P＜0.05），
故选定最佳工艺条件组合为 A3B2C3。综合“2.2”中
选取出的最佳提取溶剂可知，黄花乌头块根提取最
佳工艺条件为以 90%乙醇为提取溶剂，电场强度 20
kV/cm，脉冲数为 10，料液比 1∶14。

表 2 L9(34) 正交试验设计与结果
Table 2 Design and results of L9(34) orthogonal test
试验号 A / (kV·cm−1) B C D (误差) 浸膏得率 / % 关附甲素提取率 / % 综合评分
1 10 (1) 8 (1) 1∶10 (1) (1) 32.50 0.348 29.60
2 10 (1) 10 (2) 1∶12 (2) (2) 35.55 0.293 32.29
3 10 (1) 12 (3) 1∶14 (3) (3) 36.75 0.285 33.36
4 15 (2) 8 (1) 1∶12 (2) (3) 33.60 0.305 30.54
5 15 (2) 10 (2) 1∶14 (3) (1) 37.23 0.292 33.80
6 15 (2) 12 (3) 1∶10 (1) (2) 32.50 0.302 29.55
7 20 (3) 8 (1) 1∶14 (3) (2) 39.53 0.390 35.97
8 20 (3) 10 (2) 1∶10 (1) (3) 37.25 0.300 33.83
9 20 (3) 12 (3) 1∶12 (2) (1) 38.45 0.394 35.00
K1 95.25 96.11 92.98 98.40
K2 93.89 99.92 97.83 97.81
K3 104.80 97.91 103.13 97.73
R 10.91 3.81 10.15 0.67

表 3 方差分析
Table 3 Analysis of variance
误差来源 离偏差平方和 自由度 F 值 显著性
A 23.564 2 264.764 P＜0.01
B 2.422 2 27.213 P＜0.05
C 17.182 2 193.056 P＜0.01
D (误差) 0.089 2
F0.05(2, 2)＝19.0 F0.01(2, 2)＝99.0
2.3.2 验证试验 取 3 份样品各 100 g，按“2.3.1”
项中最佳工艺条件进行试验，计算浸膏得率及关附
甲素提取率。重复验证试验，得黄花乌头块根浸膏
得率为 39.32%，RSD 为 1.17%（n＝3），关附甲素
提取率为 0.391%，RSD 为 0.68%（n＝3）。结果表
明该工艺稳定可行。
2.4 与常规提取方法比较
2.4.1 渗漉法 称取黄花乌头块根干样 100 g，粉碎
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并过 80 目筛，以 90%乙醇为渗漉溶剂（用量为药
材干质量的 12 倍），以 2.0 mL/min 的体积流量渗漉
24 h，收集渗漉液，其他操作按“2.2”项方法，重
复测定 3 次，计算浸膏得率及关附甲素提取率，结
果见表 4。
2.4.2 乙醇加热回流法 称取黄花乌头块根干样
100 g，粉碎并过 80 目筛，置于圆底烧瓶中，以 90%
乙醇为溶剂，加热回流提取 3 次，溶剂用量分别为
1 000、800、800 mL，提取时间分别为 2.0、1.5、
1.5 h。合并 3 次滤液，其他操作按“2.2”项方法，
重复测定 3 次，计算浸膏得率及关附甲素提取率，
结果见表 4。
2.4.3 超声法 称取黄花乌头块根干样 100 g，粉碎
并过 80 目筛，置于圆底烧瓶中，以 90%乙醇为提
取溶剂，置于超声波发生器中，超声功率为 100 W，
溶剂用量为 800 mL，提取时间为 40 min。收集滤液，
其他操作按“2.2”项方法，重复测定 3 次，计算浸
膏得率及关附甲素提取率，结果见表 4。
2.4.4 几种方法结果比较 渗漉法、乙醇加热回流
法和超声法提取时间均较长，特别是乙醇加热回流
法提取温度较高，导致关附甲素结构破坏，使得关
附甲素提取率较低；而高压脉冲电场法提取时间短，
无需加热高温，关附甲素提取率最高，浸膏得率也
较高，结果见表 4。

表 4 不同提取方法比较
Table 4 Extraction efficacies by different methods
提取方法 时 间 提取温度 浸膏得率 / % 关附甲素提取率 / %
渗漉法 24 h 常温 27.00 0.256
乙醇加热回流法 4 h 90 ℃ 42.13 0.093
超声法 40 min 常温 40.50 0.343
高压脉冲电场法 30～60 s 常温 39.32 0.391

3 讨论
本实验以黄花乌头块根浸膏得率和关附甲素提
取率为考察指标，采用加权评分法进行综合评分，
并通过正交试验进行极差和方差分析，得出了黄花
乌头块根关附甲素的最佳提取工艺条件，并得到了
验证。
同时，考察了不同提取方法对浸膏得率和目标
产物含量的影响，结果表明，乙醇加热回流法浸膏
得率最大，但是关附甲素提取率最低，可见在提取
过程中，温度过高会导致目标物质结构遭到破坏，
所以实验过程应尽量在常温下进行。而高压脉冲法
提取关附甲素提取效率最高，浸膏得率也较高，并
且提取时间短，无需高温，可以避免活性成分结构
被破坏，有较好的应用前景。因此，该提取方法是
一种较为理想的提取方法，可适用于黄花乌头浸膏
及关附甲素工业化生产。
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