全 文 ：黄花乌头中 Hetisine型生物碱的高速逆流色谱分离与结构鉴定
蒋　凯 1 , 杨春华2 , 刘静涵 1* , 汤庆发1
(中国药科大学 1. 天然药物化学教研室 , 2. 分析测试中心 , 江苏 南京 210009)
摘要:目的　研究黄花乌头块根的化学成分 , 寻找更多天然活性物质。方法　采用高速逆流色谱法分离纯化黄
花乌头块根中的生物碱类化学成分 ,根据理化性质 、波谱学分析鉴定化合物的结构。结果　高速逆流色谱的两相溶
剂分离系统采用氯仿-甲醇-0.2 m o l L - 1 HC l(体积比为 10∶3∶3), 从黄花乌头块根中一次性分离得到 8个化合物 ,分
别鉴定为 2α-prop iony l-11α, 13β-diace ty l-14-hydroxyhetisine ( I)、关附巳素( II)、关附庚素( III)、关附己素( IV)、关附 Z
素(V)、关附辰素(VI)、关附甲素(VII)、关附壬素(V III)。结论　化合物 I为新化合物 , 命名为关附未素(Guanfu
base R)。
关键词:高速逆流色谱;黄花乌头;二萜生物碱
中图分类号:R284. 1;R284. 2　　　文献标识码:A　　　文章编号:0513 - 4870(2006)02 -0128 - 04
收稿日期:2005-04-26.
基金项目:国家高技术研究发展计划(863计划)重大专项资助
项目(2002AA2z3102).
*通讯作者　Tel / Fax:86 - 25 - 83271328,
E-m ai l:L iu jingh an@ vip. sina. com
Isolation and identification ofHetisine-type alkaloids from Aconitum
coreanum by high speed countercurrent chromatography
JIANG K ai
1 , YANG Chun-hua2 , LIU Jing-han1* , TANG Q ing-fa1
(1. D epartm en t of Phytochem istry, 2. Center for Instrum en ta l Ana ly sis, China Pharmaceu tical University, Nanjing 210009 , Ch ina)
Abstract:A mi 　To search for more bioac tive compounds from the roots of Aconitum coreanum
(Lèv.l )Rapaics. Methods　H igh speed countercurrent chrom atog raphy w as successfu lly applied to the
separation of a lkalo ids from Aconitum coreanum. The structures we re e lucida ted by the ir phy sicochem ica l
properties and spec troscopic analy sis. Results　Tw o-phase so lvent sy stem composed of CHC l3-CH3OH-
0.2mo l L -1 HC l(10∶3∶3, vo lume ra tio)was used in this expe riment, eigh t a lkaloids w ere obtained
from the roots o f Aconitum coreanum , which w ere identified as:2α-p ropiony l-11α, 13β-diacety l-14-
hydroxyhetisine (I), Guanfu base P (II), Guanfu base G (III), Guanfu base F (IV), Guanfu base Z
(V), Guanfu baseO (VI), Guanfu base A (VII), Guanfu base B (VIII). Conclusion　Compound I
is a new alka lo id, named Guanfu base R.
Key words:high speed coun tercurren t chrom atog raphy;Aconitum coreanum;dite rpenoid alkalo id
　 　高速逆流色 谱 (high speed countercu rrent
chromatography, HSCCC)是一种不用固态支撑体或
载体的液-液分配色谱技术 [ 1] ,它建立在单向性流体
动力平衡体系之上 。在细管绕成的螺旋管柱里 ,互
不相溶的两相溶剂利用螺旋柱在行星运动时产生的
离心力不断混合 ,同时保留其中的一相 (固定相),
利用恒流泵连续输入另一相 (流动相 ),形成固定相
与流动相连续的两相分割趋势与对流趋势 ,实现连
续 、高效的液-液分配过程。随流动相进入螺旋柱的
溶质在两相之间反复分配 ,按分配系数的次序 ,被依
次洗脱。
黄花乌头 [Acon itum coreanum (Lèv.l )Rapaics]
为毛茛科乌头属植物 ,药用部位为块根 ,又称关白
附 ,为中医临床常用中药之一。古代本草记载具有
祛风 、化痰 、燥湿和止痛之功效;现代药理学证明其
中的一些成分有抗心律失常的作用[ 2] 。国内外学
者对关白附植物化学成分的研究主要集中在活性成
128 药学学报 Ac ta Pharm aceu tica S in ica 2006, 41(2):128 - 131
DOI牶牨牥牣牨牰牬牫牳牤j牣牥牭牨牫牠牬牳牱牥牣牪牥牥牰牣牥牪牣牥牥牱
分生物碱 ,迄今为止从中分离出 20余种 C19和 C20的
二萜生物碱 [ 3] ,分离大都采用溶剂法或柱色谱等方
法 。本文首次采用高速逆流色谱法 (HSCCC)对关
白附的化学成分进行研究和搜索 ,分离并鉴定了 8
个化合物 ,皆为 C20二萜生物碱 (图 1),分别为 2α-
propiony l-11α, 13β-diace tyl-14-hydroxyhetisine ( I)、
关附巳素(II)、关附庚素 (III)、关附己素 (IV)、关
附 Z素(V)、关附辰素 (VI)、关附甲素 (VII)和关附
壬素(VIII)。其中化合物 I为一个新生物碱 ,命名
为关附未素 (Guanfu base R)。 II ～VIII为已知化合
物 。本法简便 、快速 、高效 ,为今后关白附及其他植
物活性成分的分离制备提供了一条新途径 。
I Guan fu base R R1 =p rop iony l R2 =R3 =Ac
II Guan fu base P R1 =isobutylryl R2 =R3 =Ac
III Guan fu base G R1 =R2 =R3 =A c
IV Guan fu base F R1 =isobutylryl R2 =H　R3 =Ac
V Guan fu base Z R1 =isobutylryl R2 =R3 =H
V I Guan fu base O R1 =p rop iony l R2 =H　R3 =Ac
V II Guan fu base A R1 =R3 =A c R2 =H
V III Guan fu base B R1 =A c R2 =R3 =H
F igure 1　S tructu res o f compounds I -VIII
F igure 2　K ey HMBC corre lations of compound I
化合物 I　无色方晶 (CHC l3),碘化铋钾反应呈
阳性 , mp 156 ～ 157 ℃。 UV(λmax nm):205(末端)。
高分辨质谱给出该化合物的准分子离子峰 [M +
H ] +的准确相对分子质量为 486.245 3(理论值为
486.248 6),提示其分子式为 C27H35NO 7 ,不饱和度
为 11。 IR cm -1 (KB r压片 ):3 433(-OH ), 1 737,
1 228(-COOR), 3 004 , 1 650, 910(环外 C =CH 2)。
该化合物(图 2) 1H NMR中 δ5.25(1H , br s,W1 /2 =
10.2 Hz), 5.11(1H , d, J =9 Hz), 5.09(1H , s)显示
C20二萜生物碱骨架上仲醇被酰化后向低场位移的
C2 , C11 , C13位质子信号 ,且 H-2, H-11为 β-H , H-13
为α-H[ 4, 5] ;δ4.86(1H , br s), 5.04(1H , br s)显示骨
架上 C17位 2个环外双键质子信号 (C20骨架含环外
双键 );δ1.19(3H , s)显示 C18甲基质子信号 ,未见
甲氧基的信号 ,表明该化合物可能不是 C19二萜生物
碱(天然 C19骨架的生物碱多含甲氧基 )。以上特征
提示该化合物可能是典型的 C20型二萜生物碱。化
合物 I的 13C NMR在 δ90 ～ 99, 11 ～ 16, 40 ～ 55处没
有同时出现信号 , 说明 I的结构中没有恶唑环 、
N-CH 3 , N-CH2 CH3 ,这与 Hetisine型生物碱母核的特
征一致 [ 5] , 进一步推测化合物 I属于 C20二萜
Hetisine型生物碱 。 1H NMR中 δ2.03(3H , s), 2.04
(3H , s)及 13C NMR中 δ169.2, 170.5(两组信号峰分
别在 HMBC中有相关)的信号峰提示该化合物可能
含有 2个乙酰基;1H NMR中 δ1.16(3H , t), 2.51
(2H , q)(1H-1H COSY谱显示两者相关信号 )与
13
C NMR中 δ173.8的羰基碳相关 ,提示可能含有丙
酰基 。除以上这 3个不饱和度 ,分子中还剩余 8个
不饱和度 ,与 Hetisine型母核的 8个不饱和度相符。
化合物 I的 1H NMR与关附庚素 (Guanfu base G ,
III)十分相似 ,只是在 III的 1H NMR上 δ2.0左右出
现 3个-COCH3信号 ,而 I的氢谱上 δ2.0左右仅出
现 2个-COCH3信号 ,在 δ2.51(2H , q), 1.16(3H , t)
出现丙酰基信号。化合物 I的 13C NMR和关附巳素
(Guanfu base P, II)基本相符 ,只是在高场比 II少了
1个甲基碳(表 1)。根据 I的 HMBC谱 , δ169.2的
羰基碳与甲基氢 δ2.04(3H , s)以及 H-13(δ5.09)
相关 ,确定 C13位连着乙酰基;δ170.5的羰基碳与甲
基氢 δ2.03(3H , s)以及 H-11(δ5.11)相关 ,确定
C11位也连着乙酰基;δ173.8的羰基碳与 δ1.16
(3H , t), δ2.51(2H , q)相关 ,说明分子中存在 1个
丙酰基 ,由 1H NMR可知 ,母核上的 C2 , C11 , C13位上
有酰基取代 ,故推断丙酰基连接在 C2位上 (图 2)。
故化合物 I为:2α-propiony l-11α, 13β-d iacety l-14-
hydroxyhe tisine,为一新化合物 , 命名为关附未素
(Guanfu base R)。
129 蒋　凯等:黄花乌头中 H etisine型生物碱的高速逆流色谱分离与结构鉴定
实验部分
XT-4双目显微熔点仪 (温度未校正 );N ico let
A va ter 360 FT红外分光光度计;岛津 UV-2401PC;
Ag lient 1100 系 列 LC /ES I /TOF 质 谱仪;B ruker
AV300型核磁共振谱仪;HSCCC-TBE 300型高速逆
流色谱仪 ,上海同田生化技术有限公司;DBS-100型
电脑全自动部分收集器。薄层色谱硅胶 GF254(10 ～
40 μ)和柱色谱用氧化铝(200 ～ 300目 )均为青岛海
洋化工厂生产 。色谱用溶剂均为 AR级 ,南京化学
试剂厂生产 。药材采自辽宁西丰地区 ,由沈阳药科
大学吴维春教授鉴定为毛茛科乌头属植物黄花乌头
[ Aconitum coreanum (Lèv.l ) Rapaics]的块状根 。
1　提取分离
取黄花乌头干燥块根粉末 (过 1号筛 ) 3 kg,
95%乙醇回流提取 3次。合并提取液 ,浓缩至无醇
味 。用稀盐酸酸化 ,乙酸乙酯萃取 ,得提取物 A和
酸水液 B。 B部分用氨水碱化 ,再用乙酸乙酯萃取 ,
得总碱 C(11 g),经常压氧化铝柱粗分离 ,用乙醚洗
脱 ,分得 D , E(4.4 g)和 F部分 。用氯仿-甲醇-0.2
mol L - 1 HC l(体积比 10∶3∶3)作为 HSCCC分离的
溶剂系统 ,置分液漏斗中 ,混匀 ,静置 ,分成固定相
(上层)和流动相(下层 )。首先将固定相泵入高速
逆流色谱仪 ,接着泵入流动相 ,达到平衡时 ,固定相
保留量约为 150 mL(保留率为 50%)。取 E部分
1 g,用等体积的流动相 、固定相约 10 mL溶解 ,进
样 ,流速 2mL m in- 1 ,转速 850 r m in- 1 ,用自动流
分收集器每 10mL收集 1管 ,并用 TLC(硅胶 G板 ,
展开剂为乙酸乙酯-石油醚 1∶1 ,氨水饱和。以碘化
铋钾显色 )进行检测 ,去掉组分重叠的试管 ,合并相
同 Rf值的试管 。总分离时间为 11.2 h,结果得到化
合物 I (31 mg), II(12mg), III(133mg), IV (127
mg), V (76mg), VI(10 mg), VII(156mg)和 VIII
(88 mg)。
Table 1　NMR spectra l data o f compound I (CDC l3)
No. δC* δC 　δH (H z) 　　　HM BC 1H-1H COSY
1 29. 9 29.9 1.62(d)** H-20, H-9, H-5, H-3 2-H , 3-H
2.93(d, J =15. 2) 2-H , 3-H
2 69. 5 67.9 5.25(m) H-1, H-3 1-H , 3-H
3 36. 5 36.2 1.58(m)** H-19, H-1, H-18 2-H
2.00(m)** 2-H , 1-H
4 37. 3 35.7 H-3, H-18
5 59. 4 56.8 1.91(m) H-20, H-1, H-9, H-3, H-18, H-7 6-H
6 63. 0 64.7 4.10(m) H-20, H-19, H-7, H-5 20-H , 5-H , 7-H
7 31. 5 29.8 1.56(m)** H-9, H-5 6-H
2.60(dd, J =14. 6, 2. 6) 6-H
8 44. 9 44.9 H-11, H-17, H-20, H-12, H-1, H-9, H-15, H-7, H-13
9 51. 6 51.6 2.39(d, J =9.0) H-11, H-13, H-20, H-12, H-1, H-15, H-5, H-7 11-H
10 45. 8 46.6 H-11, H-13, H-1, H-9, H-3, H-20
11 75. 3 74.7 5.11(d, J =9.0 H z) H-13, H-12, H-9, H-2″ 12-H , 9-H
12 46. 1 45.5 2.72(m) H-11, H-13, H-17, H-20, H-9 11-H , 13-H
13 80. 5 81.7 5.09(b r s) H-11, H-20, H-12, H-2 12-H
14 78. 5 78.6 H-11, H-13, H-20, H-12, H-9, H-15, H-7
15 30. 7 29.9 2.18(d, J =17. 9) H-17, H-12, H-9, H-7 17-H
2.34(d, J =17. 9) 17-H
16 142. 2 140.8 H-11, H-13, H-12, H-15
17 110. 1 111.1 4.86(b r s) H-12, H-15 15-H
5.04(b r s) 15-H
18 29. 4 29.2 1.19(3H , s) H-19, H-5, H-3
19 62. 6 59.4 3.41(d, J =12. 1) H-20, H-5, H-3, H-18
3.59(d, J =12. 1)
20 69. 5 69.2 4.75(s) H-19, H-13, H-9, H-5, H-7, H-1 6-H
1′ 176. 0 173.8 H-2′, H-3′
2′ 34. 2 28.1 2.51(2H , q, J =7. 5) H-3′ 3′-H
3′ 19. 2 8.9 1.16(3H , t, J =7. 5) H-2′ 2′-H
4′ 18. 5
1″ 170. 4 170.5 H-11, H-2″
2″ 21. 1 21.3 2.03(3H , s)
1 169. 4 169.2 H-13, H-2
2 21. 3 21.0 2.04(3H , s)
* 13C NM R chem ica l shift of compound II;**Ob tained from 2D-NMR experim ent
130 药学学报 Ac ta Pharm aceu tica S in ica 2006, 41(2):128 - 131
2　结构鉴定
化合物 I　无色方晶 (CHC l3 ), mp 156 ～
157℃,碘化铋钾反应呈阳性。 UV (λmax nm ):205
(末端 ), IR cm -1:3 433, 1 737, 1 650, 910。 HRES I-
MS[M +H ] +:486.245 3(理论值为 486.248 6),提
示其分子式为 C27H35NO7。1H NMR和 13C NMR数据
见表 1。
化合物 II ～VIII　理化常数 、MS、1H NMR等数
据分别与文献 [ 6 ～ 11]报道的关附巳素 、关附庚素 、
关附己素 、关附 Z素 、关附辰素 、关附甲素 、关附壬
素的数据相符 ,故鉴定化合物 II ～VIII分别为关附
巳素 、关附庚素 、关附己素 、关附 Z素 、关附辰素 、关
附甲素和关附壬素。
3　讨论
在高速逆流色谱中 ,溶剂系统的选择至为关键 。
溶剂系统在静止时要求能明显地分成两相 ,样品在
两相中要有合适的分配系数 ,并且固定相能实现较
高的保留。为了确保所选系统的合理性 ,本文用薄
层色谱先对各种溶剂分离系统进行初选 ,然后在高
速逆流色谱上进一步对初选的各种溶剂系统进行实
验 ,得到较满意的溶剂分离系统:氯仿-甲醇-0.2
mo l L -1 HC l(10∶3∶3)。最后还需选合适的上机条
件 ,使之在运动的螺旋管内达到最佳稳态分布 ,使固
定相保留适宜并且稳定 、不流失 ,否则 ,就得不到最
佳分离效果 。通过试验 ,考察了一定综合参数条件
下 ,两相溶剂分布与转速的关系 ,同时还考虑了流动
相流速及样品进样量对分离的影响 ,选择了流动相
流速为 2 mL m in- 1 ,转速 880 r m in- 1的分离条
件 ,一次进样 1 g。
利用高速逆流色谱对传统中药黄花乌头中的生
物碱类活性成分进行制备分离 ,通过一次分离得到
了 8种单一的生物碱 ,且包括一个新化合物 。在不
到 12 h的时间内 ,能分离如此复杂的样品 ,足见该
方法比传统的柱色谱分离方法有较大的优势。高速
逆流色谱法在植物化学领域的推广应用 ,将加快植
物活性成分的开发和传统中草药的现代化研究的步
伐。
References
[ 1] Dai DS, W ang YM , Luo GA. Recent deve lopm ent in
high-speed counte rcurrent chrom atography [ J] . Chin J
Ana l Chem (分析化学), 2001, 29:586 - 591.
[ 2] H ou DH , W u LY, XuW R, et a.l Comparative studies
on the anti-a rrhy thm ic e ffec ts o f Guan Fu B ase G w ith
Guan Fu BaseA and I [ J] . J China Pha rm Un iv (中国
药科大学学报), 1987, 18:268 - 270.
[ 3] H an Y, L iu JH , W ang M S, e t a .l Studies on the
chem ical constituen t o f Aconitum corennum [ J] . Chin
T rad it He rb D rugs(中草药 ), 1994, 25:619 -621, 624.
[ 4] Ba law an t S J, Chen DH , Zhang XL, e t a .l T angutisine, a
new dite rpenoid a lka lo id from Aconitum tanguticum
(M ax im) S tapf, WT W ang [ J] . H e terocyc le s, 1991,
32:1793 -1804.
[ 5] Bessonova IA, Saidkhodzhaeva SA. He tisane-type
dite rpeno id alka lo id [ J] . Chem Na t Com pd, 2000, 36:
419 - 477.
[ 6] Yang CH , ZhangH J, L iu JH. A lkaloid constituen ts from
root o fAconitum corennum [ J] . Chin T radit H e rb D rugs
(中草药), 2004, 12:1328 -1330.
[ 7] Liu JH , W ang HC, Gao YL, e t a.l Stud ie s on aconitum
SPP-XVI. New alka loid from guanba ifu [ J] . Chin T radit
H e rb D rug s(中草药), 1981, 12:1 -2.
[ 8] Liu JH , H ao ZG, Zhao SX. Iden tifica tion o f the struc ture
of Guan Fu Base F [ J] . J Ch ina Pharm Un iv (中国药科
大学学报), 1988, 19:238 - 239.
[ 9] Reinecke MG, W atson WH , Chen DC, e t a.l A 2D-
NMR structure de te rm ina tion of Guan Fu Base Z, a new
dite rpene alka loid from the Chinese he rb GUAN-BA I-FU-
TZU (Aconitum koreanum) [ J] . H e te rocyc les, 1986,
24:49 -61.
[ 10] L iu JH, Hao ZG, Zhou HM , e t a.l A d iterpene alka loid
from Aconitum corennum [ J] . J China Pha rm Univ (中
国药科大学学报), 1993, 24:63 -64.
[ 11] Zhou LH , W ang NL, Yao XS, e t a.l A study on p la tele t
agg rega tion inhibito rs from the roo t of Aconitum corennum
[ J] . J Shenyang Co ll Pharm (沈阳药学院学报 ),
1992, 9:280 -285.
131 蒋　凯等:黄花乌头中 H etisine型生物碱的高速逆流色谱分离与结构鉴定