全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 4 期 2015 年 2 月

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北细辛愈伤组织诱导及其解剖结构观察
张劲松，于婷婷，何 朋，尚 坤，吴秀菊*
东北农业大学生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150030
摘 要：目的 筛选北细辛 Asarum heterotropoides var. mandshuricum 愈伤组织诱导适宜条件，确定愈伤组织类型。方法 以
北细辛叶柄和叶片为材料，研究外植体状态、培养基类型及植物生长调节剂种类和浓度配比对愈伤组织诱导发生的影响，同
时利用石蜡切片法探讨不同时期愈伤组织的形态结构特点。结果 以幼期叶柄和叶片为外植体，高效的愈伤组织诱导培养基
为 1/2 MS＋0.6 mg/L 6-BA＋0.15 mg/L NAA；但幼期叶片愈伤组织发生所需时间较长。切片观察发现诱导形成的愈伤组织结
构紧密，细胞小且排列无规则，为胚性愈伤组织。结论 幼期叶柄是北细辛愈伤组织诱导的最佳外植体材料，获得的高效愈
伤组织诱导条件将为后续再生体系的成功建立奠定基础。
关键词：北细辛；叶柄；叶片；愈伤组织诱导；组织切片
中图分类号：R282.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2015)04 - 0566 - 06
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2015.04.020
Induction and anatomical observation of callus of Asarum heterotropoides
ZHANG Jin-song, YU Ting-ting, HE Peng, SHANG Kun, WU Xiu-ju
College of Life Sciences, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China
Abstract: Objective To optimize the proper condition for callus induction of Asarum heterotropoides var. mandshuricum. Methods
The effects of different explants, medium types, and plant growth regulators on the callus induction of A. heterotropoides var.
mandshuricum were studied by using the petioles and leaves as explants. Also we aimed to discover the morphology characteristics of
callus in different periods through paraffin method. Results The efficient callus induction medium was 1/2 MS + 0.6 mg/L 6-BA +
0.15 mg/L NAA while using petioles and leaves during young period as explants. Callus induction from young leaves lasted so long
time. Furthermore it was found that the induced calli were embryogenic for they were composed of compact, small and irregular
arrangement cells. Subsequently these calli could be differentiated to develop the regeneration plantlet. Conclusion Young petiole is
the optimal explant for callus induction of A. heterotropoides var. mandshuricum, and the efficient callus induction condition we
optimized would provide a basis for establishing the subsequent regeneration system.
Key words: Asarum heterotropoides Fr. Schmidt var. mandshuricum (Maxim) Kitag.; petioles; leaves; callus induction; histological section

北细辛 Asarum heterotropoides Fr. Schmidt var.
mandshuricum (Maxim.) Kitag. 为 马 兜 铃 科
（Aristolochiaceae）细辛属 Asarum L. 多年生草本植
物，又名辽细辛、烟袋锅花、东北细辛、细参等，
它与汉城细辛 Asarum sieboldii Miq. var. seoulense
Nakai.、华细辛 Asarum sieboldii Miq. 的地下根及根
茎一同被列为正品生药细辛，具有抗菌抗炎、解热
镇痛、平喘祛痰等药理作用[1]。北细辛主要生长在
东北三省地区，近年来由于过度采挖和生境破坏，
导致野生资源急剧减少[2]。通过人工栽培北细辛在
一定程度上缓解了临床用药的紧张局面[3]；但北细
辛种子繁殖所需时间长，通常播种当年只长根不长
苗，成苗需 5～6 年[4]。而组织培养具有繁殖速度快、
繁殖系数高等特点，已成为种苗规模化生产的有效
途径。愈伤组织的诱导和形态发生是组织培养成败
的关键环节，为此，本研究以北细辛地上部分叶片
和叶柄为外植体，探讨不同状态的外植体对愈伤组
织诱导发生的影响，筛选最佳的基本培养基及植物
生长调节剂种类及配比，为获得大量高质量的愈伤
组织提供参考资料。同时，对不同时期愈伤组织进

收稿日期：2014-09-15
基金项目：黑龙江省教育厅科学技术研究项目计划（12531030）
作者简介：张劲松（1988—），女，黑龙江人，硕士研究生。E-mail: song19880218@163.com
*通信作者 吴秀菊（1972—），女，黑龙江人，教授。E-mail: xiujuwu@neau.edu.cn
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行组织学观察，了解其形态、类型及发生过程，为
后续的扩大培养及再生体系、悬浮体系的建立提供
依据。
1 材料与方法
1.1 材料
北细辛植株取自黑龙江中医药大学药用植物园
和黑龙江省森林植物园药物园，经黑龙江中医药大
学王振月教授鉴定为马兜铃科细辛属北细辛 Asarum
heterotropoides Fr. Schmidt var. mandshuricum
(Maxim.) Kitag.。以叶柄和叶片作为外植体，分为
幼期、生长期和成熟期 3 个时期，其中休眠芽萌发
破土后 2 d 叶片未完全展开，叶柄长 2～3 cm，此时
定为幼期；生长 15 d 叶片刚展开，叶柄长 8～10 cm，
此时定为生长期；生长 30 d 叶片完全展开，叶柄长
15～20 cm，此时定为成熟期。
取幼期叶柄接种后培养 5、7、10、15、20、25、
30、40、60 d 长势一致且无染菌现象的愈伤组织，
置于福尔马林-乙酸-酒精（F.A.A）固定液中，用于
愈伤组织形态结构观察。
1.2 方法
1.2.1 外植体前处理 流水冲洗叶柄及叶片 3 h，再
置于蒸馏水中浸泡 1 h。然后用 70%乙醇、0.1%升
汞溶液灭菌消毒，灭菌后将与溶液相接触的叶柄两
端和叶片边缘部分切掉。
1.2.2 愈伤组织诱导培养基 将幼期叶柄分别接种
到含 30 g/L 蔗糖的 MS、1/2 MS、B5 培养基中，均
添加 0.6 mg/L 6-苄基腺嘌呤（6-BA）和 0.15 mg/L
萘乙酸（NAA），培养 20 d 后统计出愈率（出愈率=
出愈块数/接种块数）。
以 1/2 MS 为基本培养基，加入 30 g/L 蔗糖，
并添加不同质量浓度的 2,4-二氯苯氧基乙酸（2,
4-D）、激动素（KT）、6-BA 和 NAA。培养基采用
高压湿热灭菌，121 ℃，灭菌 20 min；植物生长调
节剂采用过滤法灭菌。
1.2.3 愈伤组织形态结构观察 采用石蜡切片法，
将固定后的愈伤组织经过冲洗、脱水、透明、浸蜡
和包埋、切片、贴片及番红-固绿双重染色、中性树
胶封藏等过程，制成永久切片，OLYMPUS-BH 显
微镜下观察并拍照。
2 结果与分析
2.1 不同基本培养基对愈伤组织诱导的影响
以幼期叶柄或叶片为外植体，分别接入到 3 种
愈伤组织诱导培养基，培养 20 d 后观察并统计愈伤
组织诱导情况（表 1）。结果显示（图 1），在 MS
表 1 不同基本培养基对愈伤组织诱导的影响
Table 1 Effects of different basic media on callus induction
培养基类型 接种块数 出愈块数 出愈率/% 出愈时间/d 愈伤组织状态 褐化率/%
MS 50 37 74 25 深绿色，结构非常致密 32
1/2 MS 50 50 100 20 淡绿色，颗粒状 8
B5 50 2 4 35 黄褐色，量少 92

A～C-分别以 MS（A）、B5（B）和 1/2 MS（C）为基本培养基幼
期叶柄诱导的愈伤组织 D-以 1/2 MS 为基本培养基幼期叶片诱
导的愈伤组织
A—C-callus induction from young petioles with MS medium (A), B5 medium (B), and
1/2MS medium (C) D-callus induction from young leaves with 1/2MS medium
图 1 北细辛愈伤组织的诱导
Fig. 1 Callus induction from A. heterotropoides var.
mandshuricum
培养基中诱导形成的愈伤组织结构致密，褐化程度较
高（图 1-A）；B5 培养基愈伤组织诱导率低至 4%，生
长缓慢，且褐化现象严重，愈伤组织结构致密，表面
有结晶物质产生（图 1-B）；而以 1/2 MS 作为基本培
养基，愈伤组织诱导率高，呈淡绿色颗粒状，结构较
松散，褐化程度低（图 1-C，D）。根据愈伤组织生长
状况和褐化程度可以得出，以幼期叶柄或叶片为外植
体，1/2 MS 为愈伤组织诱导的最佳培养基。
2.2 不同类型外植体对愈伤组织诱导的影响
将不同生长时期的叶柄和叶片，接种到 1/2 MS
培养基中，培养 20 d 后对愈伤组织形态进行观察统
计（表 2）。结果显示，外植体越成熟，出愈率越低，
褐化现象越严重。以幼期的叶柄及叶片为外植体，
褐化程度较低，且生长状态良好，并在切口处膨大
A B
C D
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长出愈伤组织（图 1-C、1-D）。若以幼期叶柄为外
植体，可全部诱导出愈伤组织，接种 7 d 后切口处
膨大，12 d 左右可见嫩绿色愈伤组织形成，并能继
续生长。而将幼期叶片接种后，呈现进一步长大的
趋势，以此无菌培养的叶片为外植体再次接种，培
养15 d左右叶片边缘卷曲膨大并在切口处长出淡黄
绿色愈伤组织，生长较为缓慢。因此，幼期叶片和
叶柄均可用于北细辛愈伤组织诱导，比较而言幼期
叶柄是最适外植体材料。
2.3 不同植物生长调节剂对愈伤组织诱导的影响
植物生长调节剂对北细辛幼嫩叶柄愈伤组织诱
导的影响见表 3～5，单独添加 2,4-D、2,4-D＋KT
和 6-BA＋NAA 均能诱导形成愈伤组织。表 3 可以
看出添加 1.5 mg/L 2, 4-D 时出愈率最高，2,4-D 在
0.2～1.5 mg/L 愈伤组织的诱导率随着浓度升高而增
加；培养 10 d 左右，外植体切口两端膨大，愈伤组
织致密，呈深绿色颗粒，生长缓慢，褐化率高，40 d
左右外植体及愈伤组织全部褐化死亡。2,4-D＋KT
组合仅在比例为 4∶1 时诱导形成愈伤组织，但生长
缓慢，呈致密状，且外植体褐化严重（表 4）。由表
5 可见 6-BA 和 NAA 在多种浓度配比下均能诱导愈
伤组织发生，但愈伤组织诱导情况随浓度配比有很
大变化，其中 0.6 mg/L 6-BA 和 0.15 mg/L NAA 即质
量浓度配比为 4∶1 条件下愈伤组织诱导率达到
100%，且愈伤组织状态良好，呈淡绿色颗粒状，褐
化率低，适合扩大培养。因此，以幼期北细辛叶柄
为外植体，最适的愈伤组织诱导条件为 1/2 MS＋30
g/L 蔗糖＋0.6 mg/L 6-BA＋0.15 mg/L NAA。
表 2 不同类型外植体对愈伤组织诱导的影响
Table 2 Effects of different explants on callus induction
外植体类型 接种块数 出愈块数 出愈率/% 出愈时间/d 愈伤组织状态 褐化率/%
幼期叶柄 50 50 100 20 淡绿色颗粒状 8
生长期叶柄 50 25 50 35 绿色颗粒状，致密 42
成熟期叶柄 50 3 6 45 墨绿色，结构致密 92
幼期叶片 50 42 84 55 淡黄绿色颗粒状 6
生长期叶片 50 9 18 60 黄绿色颗粒状 36
成熟期叶片 50 0 0 — — 98

表 3 不同质量浓度 2,4-D 对愈伤组织诱导的影响
Table 3 Effects of different concentration of 2,4-D on callus induction
编号 2,4-D/(mg·L−1) 接种块数 出愈块数 出愈率/% 愈伤组织状况
1 0.2 30 0 0 无
2 0.5 30 2 6.7 深绿色，致密，出愈时间长，褐化多
3 1.0 30 8 26.7 绿色，较致密，褐化多
4 1.5 30 19 63.3 绿色，较致密，表面褐化
5 2.0 30 7 23.3 深绿色，致密，出愈时间长，褐化较多
表 4 不同质量浓度 2,4-D＋KT 组合对愈伤组织诱导的影响
Table 4 Effects of different 2,4-D + KT concentration on callus induction
编号 2,4-D/(mg·L−1) KT/(mg·L−1) 接种块数 出愈块数 出愈率/% 愈伤组织状况
1 0.5 0.5 30 0 0 无
2 1.0 0.5 30 0 0 无
3 2.0 0.5 30 3 10 绿色，致密，出愈时间很长，褐化严重
4 0.5 1.0 30 0 0 无
5 1.0 1.0 30 0 0 无
6 2.0 1.0 30 0 0 无
7 0.5 1.5 30 0 0 无
8 1.0 1.5 30 0 0 无
9 2.0 1.5 30 0 0 无
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表 5 不同质量浓度 6-BA＋NAA 组合对愈伤组织诱导的影响
Table 5 Effects of different 6-BA + NAA concentration on callus induction
编号 6-BA/(mg·L−1) NAA/(mg·L−1) 接种块数 出愈块数 出愈率/% 愈伤组织状况
1 0.3 0.05 30 0 0 无
2 0.6 0.05 30 22 73.3 淡绿色颗粒状，表面褐化
3 1.0 0.05 30 5 16.7 深绿色，致密，出愈时间长，褐化多
4 1.5 0.05 30 0 0 无
5 2.0 0.05 30 0 0 无
6 0.3 0.15 30 7 23.3 深绿色，致密，出愈时间长，褐化多
7 0.6 0.15 30 30 100.0 淡绿色颗粒状，褐化少
8 1.0 0.15 30 16 53.3 绿色，较致密，褐化较多
9 1.5 0.15 30 10 33.3 绿色，较致密，褐化多
10 2.0 0.15 30 0 0 无
11 0.3 0.50 30 0 0 无
12 0.6 0.50 30 6 20.0 深绿色，致密，出愈时间长，褐化多
13 1.0 0.50 30 0 0 无
14 1.5 0.50 30 0 0 无
15 2.0 0.50 30 2 6.7 深绿色，致密，出愈时间长，褐化多
16 0.3 1.00 30 0 0 无
17 0.6 1.00 30 11 36.7 深绿色，较致密，褐化多
18 1.0 1.00 30 0 0 无
19 1.5 1.00 30 4 13.3 深绿色，致密，出愈时间长，褐化多
20 2.0 1.00 30 14 46.7 绿色，出愈时间长，褐化较多
21 0.3 1.50 30 0 0 无
22 0.6 1.50 30 0 0 无
23 1.0 1.50 30 0 0 无
24 1.5 1.50 30 1 3.3 深绿色，致密，出愈时间长，褐化多
25 2.0 1.50 30 3 10.0 深绿色，致密，出愈时间长，褐化多

2.4 不同发育阶段愈伤组织的解剖学观察
将幼期叶柄接种于培养基 5 d 后，可观察到叶
柄切口边缘膨大，通过组织切片观察发现此时的细
胞明显增大，细胞核显著（图 2-A）；培养 12～15 d
后，切口处进一步膨大，并形成少量的愈伤组织，
图 2-B 显示出在叶柄切口处已形成分裂活跃的细胞
团；培养 20～25 d，则有较多愈伤组织的出现，图
2-C 显示愈伤组织的细胞核明显，细胞体积变小，
且细胞排列紧密。观察发现愈伤组织主要存在于叶
柄维管束附近，因此认为分化初期叶柄维管束附近
部分薄壁细胞恢复分裂能力形成分生细胞团，成为
新的生长中心，继而产生了愈伤组织。部分分生细
胞团分化为维管细胞，呈鸟巢状结构排列（图 2-D）。
图 2-E 可以看出这些维管细胞已与外植体的维管束
相连接，作为愈伤组织与外植体之间物质传输的通
道。有的外植体切口处会出现褐化物质（图 2-F），
导致切口处不能产生愈伤组织，外植体进一步褐化
而死亡。
3 讨论
褐化、污染和玻璃化被称为组织培养的三大难
题，能否有效控制褐化则成为组培成功与否的关键，
而引起外植体褐化的因素包括外植体自身（外植体
的遗传特性、生长状态等）及所处的培养环境（培
养基成分、培养条件）2 方面[5]。愈伤组织诱导时
出现褐化主要是伤口处的酚类物质被多酚氧化酶氧
化为褐色的醌类物质[6]，这种物质外流深入培养基
抑制其他酶的活性，从而导致外植体死亡。通过对
愈伤组织切片观察也发现在外植体切口表面出现褐
化物质。本研究以 3 个生长阶段的叶片和叶柄为外
植体，发现随着植株生长进程的推进，叶片和叶柄
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A-愈伤组织形成初期叶柄横切 B-切口处分裂活跃的细胞团（箭头所示） C-愈伤组织横切 D-分生细胞团分化形成的维管细胞排列呈鸟巢
状结构（箭头所示） E-形成的维管细胞与外植体维管束相连接（箭头所示） F-切口处褐化（箭头所示），导致细胞死亡
A-crosssection of petiole while forming the initial callus B-cell masses (shown by arrows) actively divided near the cut end C-crosssection of callus
D-meristematic cells were differentiated into vascular cells arranged with the bird’s nest-like structure (shown by arrows) E-vascular cells were connected
with the vascular bundle of the explant (shown by arrows) F-browning of the cut end (shown by arrows) led to cell death
图 2 北细辛愈伤组织的组织学观察
Fig. 2 Histological observation on callus formation of A. heterotropoides var. mandshuricum
愈伤组织诱导率降低，褐化越严重，说明成熟期叶
片和叶柄中导致褐化的多酚类化合物增加。王南等[7]
以叶片为外植体诱导的愈伤组织生长缓慢，与本研
究结果一致。而与同一生长时期的叶片相比，叶柄
愈伤组织诱导具有出愈时间短、愈伤组织状态良好
等特点，因此幼期叶柄是北细辛愈伤组织诱导的最
佳材料，保障了后续再生体系的成功建立。
段曼姣[8]、萧洪东等[9]、南桂仙等[10]先后进行
了北细辛地下部分根及根茎愈伤组织诱导，得出
MS 为最适诱导培养基，而本研究以幼期叶柄为外
植体，发现 1/2 MS 诱导形成的愈伤组织较优，诱导
率有的可达 100%。推测 1/2 MS 培养基中盐离子浓
度降低、减小了渗透压，因而更适合叶柄愈伤组织
的诱导。植物生长调节剂在愈伤组织诱导过程中发
挥重要作用，细胞分裂素与生长素浓度配比适宜才
能更好的诱导愈伤组织[11]，常用的细胞分裂素有
6-BA、KT，生长素有 2, 4-D、NAA 等[12-14]。本研
究通过正交试验，结果表明以 0.6 mg/L 6-BA 和 0.15
mg/L NAA 即 4∶1 的浓度配比，最适合叶柄愈伤组
织的诱导。
研究表明北细辛叶柄维管束具有 3-5-3 的分布
规律，即上部和下部为 3 束，中间为 5 束[15]，本研
究在进行北细辛叶柄愈伤组织诱导过程中发现愈伤
组织基本发生在 3 束维管束处，进一步通过组织切
片观察发现愈伤组织形成初期外植体维管组织薄壁
细胞及周围少量薄壁细胞脱分化，分裂活跃，这与
刘克斌等[16]、Ouyang 等[17]和岳鑫等[18]对番茄、肉
苁蓉和锁阳愈伤组织发生形态学观察结果类似。因
此推断北细辛愈伤组织的发生位点为维管组织，脱
分化分裂活跃的细胞形成分生细胞团，Shen 等[19]
称其为愈伤组织的生长中心。有的分生细胞团逐渐
分化，形成鸟巢状结构排列的维管细胞，并与外植
体的维管束连接以进行物质运输，该结构与许智宏
等[20]对烟草愈伤组织诱导研究相吻合。分生细胞团
经过不断的分裂，在外植体切口处形成大量愈伤组
织，细胞小且排列紧密，为胚性愈伤组织[21]。获得
的胚性愈伤组织，将进一步诱导分化为再生植株，
从而保证了北细辛种质资源的可持续开发与利用。
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