全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 16 期 2014 年 8 月

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红花查尔酮合成酶基因的克隆、生物信息学分析及表达
康亚兰，裴 瑾*，刘 薇，罗 静，刘 维，陈翠平
成都中医药大学药学院，中药资源系统研究与开发利用国家重点实验室培育基地，四川 成都 610075
摘 要：目的 克隆红花查尔酮合成酶基因（chalcone synthase，CHS），运用生物信息学分析 CHS，比较花期中每天 CHS 的表达，
为红花有效成分合成及调控机制研究提供基础。方法 从新鲜红花花冠中提取 RNA，反转录为 cDNA，设计特异性引物，克隆获
得 CHS。通过生物信息学对该基因蛋白的特征进行分析，使用 MEGA5.1 构建 CHS 与相关物种 CHS 的系统进化树，利用 real-time
PCR 分析花期中每天红花 CHS 的表达量，并进行分析和比较。结果 克隆获得的红花 CHS，序列全长为 1 149 bp，具有 1 041 bp
的完整开放阅读框，编码 346 个氨基酸。将该蛋白通过 NCBI 上的 Blastp 比对发现，该蛋白属于 CHS 家族，比对结果显示红花
CHS 与 100 余种 NCBI 上登录的植物有相似性，其中与水飞蓟、翠菊、菊花、红凤菜的相似性分别达 95%、95%、94%、94%。
将相似性在 90%以上的物种用 MEGA5.1 构建进化树，结果显示红花 CHS 与水飞蓟 CHS 亲缘关系最近。通过 ProtParam 预测红花
CHS 蛋白分子式为 C1678H2693N451O493S20，相对分子质量为 37 700，等电点为 6.10，负电荷的氨基酸残基数（Asp＋Glu）为 42，正
电荷的氨基酸残基数（Arg＋Lys）为 38。基因表达分析结果表明红花 CHS 在花期第 3 天的相对表达量最高，远远高于花期其余
时间。结论 成功克隆、分析并表达了红花 CHS，为红花有效成分合成及调控机制研究提供基础。
关键词：红花；查尔酮合成酶基因；基因克隆；生物信息学分析；基因表达
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)16 - 2385 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.16.020
Cloning, bioinformatic analysis, and expression of chalcone synthase gene in
Carthamus tinctorius
KANG Ya-lan, PEI Jin, LIU Wei, LUO Jing, LIU Wei, CHEN Cui-ping
State Key Laboratory Breeding Base of the Research and Development for Traditional Chinese Medicine Resources, School of
Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610075, China
Abstract: Objective To clone the chalcone synthase (CHS) gene in Carthamus tinctorius, to analyze the bioinformation of CHS, to compare the
expression of CHS during the florescence, and to provide the foundation for composition and regulation mechanism of the active ingredients in C.
tinctorius. Methods RNA was obtained from fresh safflower corolla, cDNA was reversely transcriped, specific primers were designed, and then
CHS was cloned. The protein characteristics was analyzed using bioinformatics, the phylogenetic tree of CHS was constructed using MEGA5.1,
the expression of CHS during the florescence was analyzed using real time-PCR. Results The 1 149 bp CHS sequence in C. tinctorius was
obtained, which has a 1 041 bp ORF, encoding 346 amino acids. This protein belongs to the CHS family according to Blastp in NCBI. The CHS in
safflower was similar to that in above 100 plants, and the similarities to Silybum marianum, Callistephus chinensis, Chrysanthemum x morifolium,
and Gynura bicolor were respectively reaching 95%, 95%, 94%, and 94%. It has the closest relationship to S. marianum according to the
phylogenetic tree using MEGA5.1. The CHS formula was C1678H2693N451O493S20 and the molecular weight was 37 700, with the isoelectric point
of 6.10. The number of negatively charged amino acid residues (Asp + Glu) was 42, and the number of positively charged amino acid residues
(Arg + Lys) was 38. The gene expression analysis showed that the highest expression of CHS in safflower was on day 3 of florescence, much
higher than that on the other days. Conclusion The CHS in safflower is successfully cloned, analyzed, and expressed, which provides the
foundation for composite and regulation mechanism of the active ingredients in C. tinctorius.
Key words: Carthamus tinctorius L.; chalcone synthase gene; gene cloning; bioinformation analysis; gene expression

红花来源于菊科植物红花 Carthamus tinctorius
L. 的干燥花，为活血化瘀要药，红花作为一种多用
途的综合资源植物，红花色素是天然食用色素，红
花种子所含的油可作食用油，年用量一直保持在

收稿日期：2014-01-13
基金项目：四川省教育厅重点项目“红花有效成分累积与其合成途径中相关功能基因的关联性分析”（14ZA0074）
作者简介：康亚兰（1989—），女，在读硕士研究生，研究方向为药用植物资源。Tel: 15982120550 E-mail: wonderingkk@sina.com
*通信作者 裴 瑾（1970—），女，教授，研究方向为中药品质与资源开发。Tel: 13880369322 E-mail: peixjin@163.com
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5 000 吨以上[1]。红花花冠含黄酮、生物碱等成分，
其中黄酮类成分红花黄色素（safflower yellow，SY）
是红花中研究最多、最主要的有效成分。黄酮类化
合物是广泛存在于药用植物中的一类化合物，大都
与糖类结合为苷结构存在，多具有调血脂、扩张冠
脉、止血、镇咳、祛痰、减低血管脆性等作用。此
外，黄酮类化合物具有多种多样的生物学功能，如
调节植物生长、保护植物免受紫外线的损伤，以及
作为植物抗毒素（phytoalexin）和活性氧清除剂等[2]。
黄酮类成分多种多样的药理功能和生物活性备受研
究者的关注。
查尔酮合成酶（chalcone synthase，CHS）是黄
酮类化合物合成途径中的第 1 个关键酶，也就是红
花有效成分红花黄色素合成途径中的第 1 个关键
酶。它催化该途径的第 1 步，即将 3 分子的丙二酰
辅酶 A（malonyl-CoA）和 1 分子的 4-香豆酰辅酶 A
（4-coumaroyl-CoA）结合形成第 1 个具有 C13 架的
黄酮类化合物——查尔酮，该产物进一步衍生转化
构成了各类黄酮类化合物[3]。CHS 在植物中广泛存
在，第 1 个植物 CHS 基因序列是 1983 年在荷兰芹
中发现的。到目前为止，GenBank 数据库中已经有
4 000 多条植物 CHS 的核苷酸序列。
红花花冠为红花的药用部位，红花黄色素主要
存在于红花花冠中，其量远远大于根、茎、叶等其
他部位[4]。因此，本研究设计特异性引物，从红花
新鲜花冠中克隆获得 CHS。通过生物信息学对该基
因蛋白的特征进行分析，使用 MEGA5.1 构建 CHS
与相关物种 CHS 的系统进化树，利用 real time-PCR
分析花期中每天红花 CHS 基因的表达量，并进行分
析和比较。
1 材料
新鲜红花花冠采于成都中医药大学药用植物
园，由裴瑾教授鉴定为菊科植物红花 Carthamus
tinctorius L.，花期每天早上 8 点采摘，清洁后吸干
水分直接用于 RNA 提取。
cDNA 反转录试剂盒、Thunderbird Sybr qPCR
Mix 购于 TOYOBO 公司，植物总 RNA 提取试剂盒
购于 Omega 公司，Trizol 总 RNA 提取试剂购于天
根公司，2×Taq PCR MasterMix 购于 Biomed 公司，
多功能 DNA 纯化回收试剂盒购于 BioTeke 公司。
2 方法
2.1 RNA 提取和 cDNA 合成
使用 Trizol 总 RNA 提取试剂和植物总 RNA 提
取试剂盒提取样品总 RNA，筛选 RNA 提取方法。
利用紫外分光光度仪测定总 RNA 的 A260 和 A280。选
择 A260/A280为 1.8～2.0，凝胶电泳检测为 3 条带的
总 RNA 进行反转录，反转录反应按 cDNA 合成试
剂盒说明书进行。
2.2 CHS 克隆与测序
根据文献报道[5]红花 CHS 序列使用软件 Primer
Primer 5.0、在线软件 http://bioinfo. ut.ee/primer 3-0.4.0/、
http://www.yeastgenome.org/cgi-bin/web-primer 设计
引物，见表 1。以 cDNA 为模板，使用 2×Taq PCR
MasterMix 分别进行 PCR 扩增，扩增体系 20 μL：
2×Taq PCR MasterMix 10 μL；正向引物 1 μL，反向
引物 1 μL，cDNA 模板 5 μL，dd H2O 3 μL。考察扩
增条件（退火温度以 50～65 ℃梯度考察）：94 ℃，
3 min；30 循环（94 ℃，30 s；50～65 ℃，30 s；
72 ℃，10 min）；72 ℃，5 min。PCR 结果凝胶电
泳检测，多功能 DNA 纯化回收试剂盒（BioTeke）
纯化回收 PCR 产物，由北京梓熙生物科技有限公司
测序。
表 1 引物设计
Table 1 Primers design
编号 引物序列(3’—5’)
引物 1 正向：CTTCACCAACATCCATCG
反向：CGGGTTTGAGTAGTAATTATGA
引物 2 正向：ATGGCATCCTTAACCGATATT
反向：TTAAGCGGCAATGGGGGT
引物 3 正向：ACCAACATCCATCGGTGT
反向：CGGGTTTGAGTAGTAATTATGA
引物 4 正向：GTGTCCTCGTGGTTTGCT
反向：CTGACTTCCTCCTCTTCTACT

2.3 CHS 生物信息学分析
使用在线软件 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/
gorf.html，找出 CHS 的开放阅读框（open reading
frame，ORF），并获得其编码蛋白质序列；使用在
线软件 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi，将预测
结果与 NCBI 中已登录的物种进行对比分析；使用
软件 MEGA5.1 将预测结果与相似性达 90%以上的
物种 CHS 构建进化树；使用在线软件 http://web.
expasy.org/protparam/，分析其编码蛋白质序列的一
级结构。
2.4 红花花期 CHS 的表达
查阅文献报道[5]，得到红花 CHS 的 real-time
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PCR 引物序列和内参基因 25s 的 real-time PCR 引物
序列。扩增体系 10 μL：Thunderbird SYBR qPCR
Mix5 μL，正向引物 0.5 μL，反向引物 0.5 μL；cDNA
模板 1 μL，dd H2O 3 μL。考察引物扩增曲线、溶解
曲线及标准曲线，考察 real-time PCR 条件（退火温
度以 50～65 ℃梯度考察）：94 ℃，3 min；30 循环
（94 ℃，30 s；50～65 ℃，30 s；72 ℃，10 min）；
72 ℃，5 min。确定条件后测试花期 7 d 的红花 CHS
和 25s 的表达量，并在 Bio-Rad CFX Manager 中分
析得到相对表达量。
3 结果与分析
3.1 RNA 提取结果
Trizol 法提取所得 RNA 紫外分光光度法测定
A260 和 A280，A260/A280 为 2.0，凝胶电泳检测可见清
晰 3 条带，可用于后续实验，见图 1。由于红花花
冠富含红花黄色素等黄酮类物质，干扰 RNA 提取，
加大了 RNA 提取的难度。试剂盒的方法不能将红
花 RNA 提取出来，在使用 Trizol 法的过程中应注
意以下几点：离心 15 min，保证漂浮于 Trizol 提取
液中的红花花冠粉末沉淀；分层后，在吸取上清液
时，吸取 50%水相，尽可能避免吸取到中间层的蛋
白，以保证 RNA 的纯度；异丙醇沉淀 RNA 过程中，
增加至 2 h，尽可能多的使 RNA 沉淀；RNA 清洗过
程中，3 次用 300 μL 75%乙醇清洗，保证色素被清
洗干净。

图 1 Trizol 法提取红花 RNA 凝胶电泳图
Fig. 1 Gel electrophoresis of safflower RNA
extracted by Trizol
3.2 CHS 克隆及测序结果
引物 2 在扩增条件：94 ℃，3 min；30 个循环（94
℃，30 s；64.2 ℃，30 s；72 ℃，10 min）；72 ℃，5
min 下，可以得到 1 000 bp 左右的产物，见图 2。
3.3 CHS 生物信息学分析结果
测序分析表明，红花 CHS 全长 1 149 bp，包含
一段 1 041 bp 的 ORF，编码 346 个氨基酸组成的蛋

图 2 PCR 产物凝胶电泳图
Fig. 2 Gel electrophoresis of PCR products
白，见图 3。将该蛋白通过 NCBI 上的 Blastp 比对
发现，该蛋白属于 CHS 家族。比对结果显示，红花
CHS 与 100 余种 NCBI 上登录的植物有相似性，其
中与菊科植物水飞蓟 Silybum marianum (L.)
Gaertn.、翠菊 Callistephus chinensis (L.) Nees、菊花
Chrysanthemum x morifolium Ramat.、红凤菜 Gynura
bicolor (Willd.) DC.、黑心菊 Rudbeckia hirta L.、大
丽花 Dahlia pinnata Cav. 的相似性分别达 95%、
95%、94%、94%、93%、92%。将相似性达 90%以
上的比对结果用 MEGA5.1 构建进化树，见图 4。通
过 ProtParam 预 测 CHS 蛋 白 分 子 式 为
C1678H2693N451O493S20，相对分子质量为 37 700，等
电点为 6.10，负电荷的氨基酸残基数（Asp＋Glu）
为 42，正电荷的氨基酸残基数（Arg＋Lys）为 38。

图 3 红花 CHS 编码的氨基酸序列
Fig. 3 Amino acid sequence encoded by safflower CHS



2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp

250 bp
100 bp
目的基因 Marker




28 S
18 S

5 S
108
153
198
243
288
333
378
423
468
513
558
603
648
693
738
783
828
873
918
963
1 008
1 053
1 098
1 143
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图 4 红花 CHS 与相关物种 CHS 的系统进化树
Fig. 4 Phylogenetic tree of CHS in C. tinctorius
and other relative related species
3.4 红花花期 CHS 表达结果
引物序列可用于 real-time PCR，条件考察结果是
CHS 扩增条件：95 ℃，2 min；30 循环（95 ℃，15
s；61.4 ℃，20 s；72 ℃，20 s），内参基因（25s）扩
增条件：95 ℃，2 min；30 循环（95 ℃，5 s；55 ℃，
20 s；72 ℃，20 s），引物特异性良好。花期 7 dCHS
相对于 25s 的表达量分析结果见表 2 和图 5，结果表
明红花开花第 3 天表达量最高，高达 2.8，远远高于
其余几天，表达量第 2 的是开花第 6 天，也仅仅 1.2。
花期 7 d 中，红花花色从淡黄色逐渐变成红色，花冠
数量逐渐增多，大多在第 3、4 天持平。有文献报道[5]，
红花在花开第3天黄酮类成分羟基红花黄色素A量最
高，与基因表达结果相吻合。
4 讨论
研究克隆获得的红花 CHS，序列全长为 1 149
bp，具有 1 041 bp 的完整 ORF，编码 346 个氨基酸。
表 2 25s 和 CHS 的 Cq值及表达量
Table 2 Cq value and relative expression of 25s and CHS
目的基因 花期 相对表达量 相对表达量标准误差 平均 Cq值 Cq值标准误差
25s 第 1 天 25.55 0.098 68
25s 第 2 天 25.71 0.050 30
25s 第 3 天 28.34 0.038 63
25s 第 4 天 26.01 0.057 42
25s 第 5 天 27.62 0.078 96
25s 第 6 天 28.24 0.010 46
25s 第 7 天 29.11 0.079 35
CHS 第 1 天 0.278 17 0.015 20 25.61 0.038 26
CHS 第 2 天 1.098 70 0.091 33 23.44 0.130 44
CHS 第 3 天 2.801 89 0.138 37 24.61 0.073 15
CHS 第 4 天 0.125 01 0.009 29 27.44 0.110 53
CHS 第 5 天 0.823 35 0.073 97 25.93 0.113 57
CHS 第 6 天 1.123 37 0.026 80 26.05 0.039 37
CHS 第 7 天 0.852 23 0.060 98 27.42 0.100 37

图 5 红花花期 CHS 相对表达量
Fig. 5 Relative expression of CHS in safflower
during florescence
将该蛋白通过 NCBI 上的 Blastp 比对发现，该蛋白
属于 CHS 家族。比对结果显示红花 CHS 与 100 余
种 NCBI 上登录的植物有相似性，其中与菊科植物
水飞蓟、翠菊、菊花、红凤菜、黑心菊、大丽花的
相似性分别达 95%、95%、94%、94%、93%、92%。
将相似性在 90%以上的物种用 MEGA5.1 构建进化
树，结果显示红花 CHS 与水飞蓟 CHS 亲缘关系最
近，经典植物分类学中红花和水飞蓟同属于菊科
（Compositae）管状花亚科（Carduoideae）菜蓟族
（Cynareae）。通过 ProtParam 预测 CHS 蛋白分子式
为 C1678H2693N451O493S20，相对分子质量为 37 700，
等电点为 6.10，负电荷的氨基酸残基数（Asp＋Glu）
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0

甜橙
柚子
蜜柑
白鲜
陆地棉
浙江红山茶
野茶树
山茶花
芹菜
水飞蓟
红花
大丽花
紫茎泽兰
非洲菊
红凤菜
翠菊
菊花
刺槐
黑心菊
芸香
第 1 天 第 2 天 第 3 天 第 4 天 第 5 天 第 6 天 第 7 天
相
对
表
达
量

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为 42，正电荷的氨基酸残基数（Arg＋Lys）为 38。
花期 7 d 中，红花花色从淡黄色逐渐变成红色，花
冠数量逐渐增多，大多在第 3、4 天持平。基因表达
分析结果表明红花 CHS 在花期第 3 天表达量最高，
远远高于其余几天。该研究成功设计了 PCR 引物并
考察得到了相应的 PCR 扩增条件及 real-time PCR
条件，克隆得到了 1 149 bp 的红花 CHS 基因，并对
该基因进行了生物信息学分析，为红花 CHS 基因提
供了更多更详尽的信息。在今后研究中，可以同时
结合化学成分研究，找出基因表达与化学成分的关
联性，为有效成分合成及调控机制研究提供更多的
信息。
随着分子生物学的迅速发展，药用植物也开始
涉及到分子生物学领域，中药有效成分研究越来越
趋向于有效成分的合成及调控机制的研究。在这些
研究中，最为活跃的研究领域是与活性成分形成关
系最密切的生物合成相关基因克隆研究。由于临床
上对天然药物的实际需求不断增加，以及基因克隆
与表达技术的进步，近年来药用植物功能基因的克
隆呈现快速增长的趋势[7]。在药用植物中，黄酮类
化合物代谢合成途径及相关基因的研究处于起步阶
段，但也取得了较大的成果，为药用植物黄酮类化
合物合成途径及相关功能基因的深入研究奠定了基
础。通过生物合成途径的研究，推动药用植物次生
代谢工程的发展，提高中药材的品质，为中药的良
种选育、规范化种植和质量控制提供技术支撑，将
是中药材品质研究的前沿和热点课题。
参考文献
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