全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 16期 2016年 8月

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健脾消癌方对结直肠癌转移模型裸鼠血管内皮生长因子与血管内皮抑素表
达的影响
李勇敏，谭小宁，徐琳本，吕 元，奚剑敏，蒋益兰*
湖南省中医药研究院附属医院，湖南 长沙 410006
摘 要：目的 观察健脾消癌方对结直肠癌裸鼠转移模型组织中血管内皮生长因子（VEGF）及血管内皮抑素（ES）表达的
影响，探讨健脾消癌方拮抗结直肠癌转移的作用机制。方法 将 BALB/c-nu 裸鼠按随机数字表随机抽取 8 只作为对照组，
其余裸鼠采用盲肠内注射 50 μL 人结肠癌 HCT116细胞造模，3 d后取存活裸鼠 32只，随机分为健脾消癌方低、高剂量（10、
40 g/kg）组，5-氟尿嘧啶（5-FU，0.13 g/kg）组，模型组，分别 ig 或 ip相应药物及生理盐水 4周后，采用 qRT-PCR法测定
裸鼠结直肠癌转移后结肠、肝、肺及盲肠肿瘤组织中 VGEF、ES mRNA表达量。结果 在 VEGF mRNA表达量方面，各组
均较对照组升高，模型组与 5-FU组最高（P＜0.01）；健脾消癌方 2组较模型组显著降低（P＜0.05、0.01）。在 ES mRNA表
达量方面，各组均较对照组降低，模型组与 5-FU组最低（P＜0.01）；健脾消癌方 2组较模型组显著升高（P＜0.05、0.01）。
4个部位以盲肠组织 VEGF水平最低，ES水平基本相当。结论 健脾消癌方可能通过使结肠、肝、肺等组织 VEGF的降低
与 ES的升高来达到拮抗结直肠癌转移的目的。
关键词：健脾消癌方；结直肠癌；转移；血管内皮生长因子；血管内皮抑素
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2016)16 - 2883 - 04
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.16.018
Effect of Jianpi Xiaoai Recipe on expression of VEGF and endostation in nude
mice with colorectal cancer metastasis
LI Yong-min, TAN Xiao-ning, XU Lin-ben, LV Yuan, XI Jian-min, JIANG Yi-lan
The Hospital Attached to Hunan Academy of Chinese Medicine, Changsha 410006, China
Abstract: Objective This article is aimed at investigating the effect of Jianpi Xiaoai Recipe (JXR) on the mRNA expression of vascular
endothelial growth factor (VEGF) and endostation (ES) in the tissue in nude mice with colorectal cancer metastasis. Methods Eight
BALB/c-nu nude mice were randomly selected as the control group. The remaining mice, after establishing the metastatic tumor by injecting
in the appendix of 50 μL human colon carcinoma HCT116 cells, then 32 survival nude mice were taken after 3 d, and divided into JXR (low-
and high-dose, 10 and 40 g/kg), 5-FU (0.13 g/kg), and model groups. After the mice were ig or ip given corresponding medicine and
physiological saline for 4 weeks, the mRNA expression levels of VGEF and ES in the metastatic tumor tissue of colon, liver, lung, and cecum
were evaluated by qRT-PCR method. Results The mRNA expression of VEGF was higher in all groups except the control group, and the
highest was in the model and 5-FU groups (P < 0.01). Compared with the model group, the mRNA expression level in two JXR groups were
significantly lower (P < 0.05, 0.01). ES transcription expression was lower in each group than that in the control group, the lowest was in the
model and 5-FU groups (P < 0.01). Compared with the model group, the mRNA expression levels in the two JXR groups were significantly
higher (P < 0.05, 0.01). Among these four organs, the expression level of VEGF in cecum was lowest, while the mRNA expression levels of
ES are nearly the same. Conclusion JXR is possible to make the mRNA expression level of VEGF decreased, but the mRNA expression
level of ES increased in the metastatic tumor tissue of colon, liver, lung, and cecum, so as to resist the metastasis of colorectal cancer.
Key words: Jianpi Xiaoai Recipe; colorectal cancer; metastasis; vascular endothelial growth factor; endostation

血管内皮生长因子（vascular endothelial growth
factor，VEGF）是一种能特异作用于血管内皮细胞
的生长因子，是一种促血管生成活性的功能性蛋白。
有研究表明，实体瘤的进展取决于血管生成，而

收稿日期：2016-01-26
基金项目：国家自然科学基金面上项目（81373602）；湖南省科技计划科研条件创新专项（2013TT1004）；湖南省自然科学基金项目（14J504I）
作者简介：李勇敏，男，硕士生导师。Tel/Fax: (0731)88719079 E-mail: lym0937@126.com
*通信作者 蒋益兰，女，主任医师，博士研究生导师，从事中医药防治恶性肿瘤的临床及实验研究。E-mail: tianshangren624@163.com
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VEGF 为关键的促血管生成因子，其基因包括 8 个
外显子、7个内含子和若干单核苷酸多态性，这些因
子使 VEGF 在肿瘤细胞的诱导分化中起重要作用；
阻断VEGF可使血管网恢复，并抑制肿瘤生长[1-2]。
血管内皮抑素（endostatin，ES）采自胶原蛋白的非
胶原域，是一种内源性血管生成抑制因子，可特异
性地作用于新生微血管的内皮细胞，具有抗肿瘤作
用[3-4]。健脾消癌方是湖南省名中医蒋益兰教授的经
验方，本项目组前期临床研究表明[5]，健脾消癌方
可有效拮抗大肠癌术后复发，提高生存质量，有效
延长生存期；实验研究[6]表明健脾消癌方可有效延
长裸鼠生存期，增加其体质量，降低 VEGF、VEGF
受体（VEGFR-2）蛋白表达量。本研究在前期研究
基础上，进一步观察健脾消癌方对结直肠癌转移模
型裸鼠各组织中 VEGF和 ES mRNA表达的影响，
探讨健脾消癌方抗结直肠癌癌转移的血管生成调
节作用。
1 材料
1.1 动物及细胞株
SPF级 BALB/c-nu裸鼠 60只，雌性，4～6周
龄，购自湖南斯莱克实验动物有限公司，合格证号
43004700012242，许可证号 SCXK（湘）2011-0003。
人结肠癌细胞株 HCT116 购买于中国科学院细胞
库，编号 TCHu 99。
1.2 药物
健脾消癌方由党参、白术、茯苓、法半夏、黄
芪、灵芝、炒枳壳、薏苡仁、仙灵脾、郁金、莪术、
白花蛇舌草、半枝莲、重楼、甘草组成。上述药物
按《中国药典》2010年版标准规格采购，购自湖南
省中医药研究院附属医院中药房。取以上 15 味中
药，5倍量处方，提取 2次，第 1次加 8倍量水浸
泡 0.5 h，加热煎煮 1 h，滤过；第 2次加 6倍水，
煎煮 1 h，滤过；合并滤液，静置 24 h，离心，上
清液减压浓缩至约 850 mL，冰箱内冷藏 48 h。将冷
藏液离心，上清液滤过，得药液约 800 mL，灭菌。
制成每毫升含 2.1 g 生药的水煎液，密封后，4 ℃
保存备用。5-氟尿嘧啶（5-FU），上海旭东海普药
业有限公司生产，批号 FA130908。
1.3 试剂
逆转录试剂盒，Fermentas；Trizol，Invitrogen；
Taq 酶，Genstar；引物，上海生工生物工程有限
公司；DEPC，Sigma；DL2000 DNA Marker，
Genstar；dNTP，Genstar；EB，Sigma；SYBGREEN
PCR Mix，ABI。
1.4 仪器
荧光定量 RCP 仪，Thermo；恒温水浴箱，
Thermo；J-MAX 旋涡混合器，其林贝尔仪器制造
有限公司；电泳仪，北京六一生物科技有限公司；
电动匀浆器，宁波新芝生物科技股份有限公司。
2 方法
2.1 模型制备
按文献方法[7]，于无菌环境下用 2.5%戊巴比妥
钠 ip麻醉裸鼠，左下腹切开约 2.5 cm切口，暴露
盲肠。用微量注射器将 50 μL HCT116细胞（浓度
约 4×107/mL）注入盲肠浆膜和肌层之间，用 3%碘
酒清洁注射区域，缝合腹壁。接种细胞 15～20 d，
可见裸鼠腹部有小肿块，表明肿瘤形成，开始向淋
巴、肝、肺转移。
2.2 分组及给药
裸鼠购进后，适应性饲养 3 d后随机抽取 8只
作为对照组。取 32 只造模成功且存活的裸鼠按照
随机数字表随机分为 4组，即健脾消癌方高、低剂
量组，5-FU阳性对照组及模型组。按照人体体表面
积与小鼠体表面积比例换算，健脾消癌方低、高剂
量组裸鼠分别 ig 10、40 g/kg（相当于临床等效剂量
的 1、4 倍）健脾消癌方水煎液，每天 1 次；5-FU
组 ip 0.13 g/kg 5-FU，隔 3 d给药 1次；模型组及对
照组 ig生理盐水，连续给药 4周。末次给药 2 h后
处死动物，即刻打开腹腔，取肝、肺（有转移结节
者以结节为中心取材）、结肠及盲肠肿瘤组织约 0.5
g，液氮冷冻。
2.3 指标检测
采用 qRT-PCR 测定组织中 WEGF 和 ES 的
mRNA表达。取约 0.1 g组织在液氮下研磨碎，用 1
mL Trizol提取组织总 RNA，紫外分光光度计测定
浓度。用 1%变性琼脂糖凝胶，0.2 g琼脂糖，0.5 μL
EB（10 mg/mL），混匀制胶；取 2 μL提取的 RNA，
按 1∶5的比例与 loading buffer premix混匀，170 V
恒压电泳，溴酚蓝前沿迁移至凝胶总长 2/3 处停止
电泳；凝胶成像系统下观察。以组织总 mRNA为模
板 ， 逆 转 录 cDNA。 β-actin 引 物 序 列 F：
5’-CATCCTGCGTCTGGACCTGG-3’，R：5’-TAAT-
GTCACGCACGATTTCC-3’；VEGF引物序列 F：5’-
TCGGAGAGCAACGTCACTATG-3’，R：5’-TTTAA-
ACCGGGATTTCTTG-3’；ES引物序列 F：5’-GCA-
TCAAGGCCGAACATC-3’，R：5’-TCCAGTGCG-
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GGACCAAG-3’。实时定量 PCR，SYBR法，定量
PCR 扩增程序：预变性，95 ℃、10 min；变性，
95 ℃、10 s；40 个循环。退火/延伸：VEGF，58 ℃、
50 s；ES，60 ℃、50 s。
2.4 统计学处理
采用 2−ΔCt法计算目的基因 mRNA 转录水平，
实验结果采用 SPSS 17.0统计软件进行统计分析。
实验结果以 ±x s形式表示，两组间比较符合方差齐
性者用 t检验，不符合方差齐性者用 t′检验。
3 结果
3.1 各组裸鼠不同组织中VEGF mRNA表达的比较
与对照组比较，模型组裸鼠结肠、肝、肺和盲
肠肿瘤组织的 VEGF mRNA表达量明显升高（P＜
0.05、0.01）。与模型组比较，健脾消癌方 2组裸鼠
结肠、肝、肺和盲肠肿瘤组织的 VEGF mRNA表达
量明显降低（P＜0.05、0.01）。4个部位以盲肠肿瘤
组织中 VEGF mRNA水平最低，结果见表 1。
3.2 各组裸鼠不同组织中 ES mRNA表达的比较
与对照组比较，模型组裸鼠结肠、肝、肺及盲
肠肿瘤组织的ES mRNA表达量显著降低（P＜0.05、
0.01）；与模型组比较，健脾消癌方 2组裸鼠结肠、
肝、肺和盲肠肿瘤组织的 ES mRNA表达量显著升
高（P＜0.01）；4个组织中 ES mRNA表达水平基本
相当，结果见表 2。
表 1 各组裸鼠不同组织中 VEGF mRNA表达量的比较 ( ±x s )
Tabel 1 Comparison on mRNA expression level of VEGF in different tissues of nude mice in each group ( ±x s )
组别 剂量/(g·kg−1) 动物数/只
VEGF mRNA相对表达量 (×10−3)
结肠 肝 肺 盲肠肿瘤
对照 — 8 1.66±0.74 1.93±0.97 1.75±0.82 0.97±0.49
模型 — 8 5.38±1.80** 4.80±1.42** 5.08±1.30** 4.96±1.43**
健脾消癌方 40 7 2.71±0.96## 2.30±0.91## 3.23±1.01## 1.73±0.90##
10 8 3.11±1.19 2.86±1.15## 3.26±1.15# 2.11±0.97##
5-FU 0.13 8 6.14±2.04 5.02±1.23 4.62±1.24 3.85±1.34
与对照组比较：*P＜0.05 **P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05 ##P＜0.01，下同
*P < 0.05 **P < 0.01 vs control group; #P < 0.05 ##P < 0.01 vs model group, same as below
表 2 各组裸鼠不同组织中 ES mRNA表达量的比较 ( ±x s )
Tabel 2 Comparison on mRNA expression level of ES in different tissues of nude mice in each group ( ±x s )
组别 剂量/(g·kg−1) 动物数/只
ES mRNA相对表达量 (×10−3)
结肠 肝 肺 盲肠肿瘤
对照 — 8 6.31±1.40 6.25±1.35 6.90±1.34 5.75±1.16
模型 — 8 4.32±1.30* 4.04±1.23** 3.78±1.22** 2.64±0.89**
健脾消癌方 40 7 6.63±1.48## 7.59±1.40## 7.48±1.36## 5.98±1.50##
10 8 5.56±1.35 7.46±1.36## 7.21±1.37## 6.75±1.41##
5-FU 0.13 8 2.42±0.86 2.73±0.78 2.77±0.81 2.11±0.71

4 讨论
血管形成受血管生成因子与抗血管生成因子
所调控。在肿瘤的形成或伤口愈合时，血管生成因
子占主导，血管内皮细胞被激活，血管扩张和通透
性增加，血管内皮细胞增殖、迁移和成管[3]。研究
表明，结直肠癌转移患者采用 VEGF抑制剂靶向治
疗取得良好的临床疗效，然而，但有些患者很快耐
药或无效，其原因是患者处于高脂肪合成高氧化磷
酸化状态和存在丝氨酸合成信号[8]。
来源于胶原蛋白的 ES 具有血管生成和血管内
皮细胞自噬调节剂双重活性，可能成为治疗癌症的
新靶点，人工重组 ES（恩度）已取得较好的治疗效
果[9]。然而，一些癌症包括结直肠癌，其血液中 ES
浓度升高，尽管有研究证明，ES水平升高可能是由
于结直肠癌浸润肠道壁致使肌层胶原蛋白 XVIII降
解增加，但肿瘤组织中 ES 未见升高[10]。但这种情
况往往使临床治疗非常困难。
中医认为，大肠癌发病的根本原因是先天不
足，正气亏虚；六淫邪毒、情志郁结、饮食内伤等。
本课题组认为结直肠癌术后转移患者以脾胃亏虚、
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气血不足、瘀毒未尽，“虚、瘀、毒”并存为其病
机特点，须健脾益气，化瘀解毒，方为良策[11]。健
脾消癌方是蒋益兰教授治疗结直肠癌临床经验的
总结，以健脾益气、化瘀解毒为治法，由人参、茯
苓、薏苡仁、仙灵脾、白花蛇舌草、石见穿、莪术、
郁金等组成。前期研究证实本方能缓解结直肠癌术
后肝转移，临床配合化疗，结果表明其可有效延长
患者生存期，降低复发转移率[5]。
虽然癌症靶向药物针对性很强，但治疗面有
限。中医药从整体出发，全面治疗，但作用机制复
杂。本实验研究发现，健脾消癌方能降低结直肠癌
转移裸鼠肠、肝、肺组织中 VEGF 表达，升高 ES
表达，提示可能通过调节二者 mRNA表达水平，达
到拮抗结直肠癌转移的作用。但转录水平的改变与
蛋白表达有一定的差距，另外，血管生成的影响因
子较多，需进行更深入的研究。值得注意的是本研
究采用 5-FU为阳性对照药，因其为细胞毒性药物，
对血管生成影响甚微。故在以后的研究中宜选用更
合适的阳性对照药物进行深入探讨。
参考文献
[1] Chekhonin V P, Shein S A, Korchagina A A, et al. VEGF
in tumor progression and targeted therapy [J]. Curr
Cancer Drug Targets, 2013, 13(4): 423-443.
[2] Paré-Brunet L, Glubb D, Evans P, et al. Discovery and
functional assessment of gene variants in the vascular
endothelial growth factor pathway [J]. Hum Mutat, 2014,
35(2): 227-235.
[3] Chung, S, Dwabe S, Elshimali Y, et al. Identification of
novel biomarkers for metastatic colorectal cancer using
angiogenesis-antibody array and intracellular signaling
array [J]. PLoS One, 2015, 10(8): e0134948.
[4] Alahuhta I, Aikio M, Väyrynen O, et al. Endostatin
induces proliferation of oral carcinoma cells but its effect
on invasion is modified by the tumor microenvironment
[J]. Exp Cell Res, 2015, 336(1): 130-140.
[5] 蒋益兰, 潘敏求, 蔡 美. 健脾消癌饮配合化疗拮抗大
肠癌术后复发转移 62 例总结 [J]. 湖南中医杂志 ,
2007, 23(1): 1-3.
[6] 蒋益兰, 罗 星, 李勇敏, 等. 健脾消癌方对裸鼠大肠
癌肝转移模型VEGF以及VEGFR-2表达的影响 [A] //
第十四届全国中西医结合肿瘤学术大会论文集 [C].
长沙: 湖南中医药大学, 2014.
[7] Céspedes M V, Espina C, García-Cabezas M A, et al.
Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in
nude mice induces tumor foci in all clinically relevant
metastatic sites [J]. Am J Pathol, 2007, 170(3):
1077-1085.
[8] Pommier A J, Farren M, Patel B, et al. Leptin, BMI, and a
Metabolic Gene Expression Signature Associated with
Clinical Outcome to VEGF Inhibition in Colorectal
Cancer [J]. Cell Metab, 2016, 23(1): 77-93.
[9] Poluzzi C, Iozzo R V, Schaefer L. Endostatin and
endorepellin,a common route of action for similar
angiostatic cancer avengers [J]. Adv Drug Deliv Rev,
2016, 97: 156-173.
[10] Kantola T, Väyrynen J P, Klintrup K, et al. Serum
endostatin levels are elevated in colorectal cancer and
correlate with invasion and systemic inflammatory
markers [J]. Br J Cancer, 2014, 111(8): 1605-1613.
[11] 蒋益兰, 荆 珍. 中医药防止大肠癌转移作用与机制
的研究概况 [J]. 湖南中医杂志, 2009, 25(1): 103-104.