全 文 ：基金项目:广东省自然科学基金项目(No． S2012010008163);湛江市财政资金科技专项竞争性分配项目(No． 2013A01008) ;广东医学院创新
实验项目(No． ZYZF006)
作者简介:高小胜，男，研究方向:中草药抗肿瘤的研究，E － mail:335094909@ qq． com
通信作者:李立，男，博士研究生，研究员，硕士生导师，研究方向:天然药物及肿瘤的研究，Tel:0759 － 2388405，E － mail:gy0661@ 163． com
半边旗提取物 5F诱发结直肠癌细胞生长抑制及细胞凋亡
高小胜1，吕应年2，吴科锋2，刘义2，符伟玉3，陈若泰1，李立2
(1．广东医科大学第一临床医学院，广东 湛江 524023;2．广东医科大学广东天然药物研究与开发重点实验室，
广东 湛江 524023;3．广东医科大学生物化学与分子生物学教研室，广东 湛江 524023)
摘要:目的 检测半边旗(PsL)提取物 5F(ent － 11α － hydroxy － 15 － oxo － kaur － 16 － en － 19 － oic － acid)对
HCT － 116 结直肠癌(CＲC)细胞的抗增殖及促细胞凋亡效果。方法 采用噻唑蓝(MTT)法检测细胞毒性。通过有
代表性的细胞凋亡相关蛋白表达及 Annexin V /PI染色确定细胞凋亡。采用标准实验方案测量活性氧(ＲOS)水平。
结果 5F以剂量依赖及时间依赖方式抑制 HCT － 116 细胞增殖。免疫印迹分析表明 5F提高了 HCT － 116 细胞中
的 Bax /Bcl － 2 比值。5F能既够增强顺铂(cisplatin)对 HCT － 116 细胞生长的抑制效果又能够提高顺铂诱导的 HCT
－ 116 细胞凋亡水平。5F不仅没有提高活性氧水平，反而降低了顺铂诱导的活性氧生成。结论 5F能够诱导结直
肠癌细胞凋亡并因此表现出癌症治疗潜力。
关键词:半边旗;结直肠癌;细胞凋亡;活性氧
中图分类号:Ｒ285 文献标识码:A 文章编号:2095 －5375(2016)04 －0193 －005
doi:10． 13506 / j． cnki． jpr． 2016． 04． 002
Growth inhibition and apoptosis in human colorectal cancer cells induced by
5F － extracted from Pteris semipinnata L．
GAO Xiaosheng1，LYU Yingnian2，WU Kefeng2，LIU Yi2，FU Weiyu3，CHEN Ｒuotai1，LI Li2
(1． The First Clinical Medical School，Guangdong Medical University，Zhanjiang 524023，China;2． Guangdong
Key Laboratory for Ｒesearch and Development of Natural Drugs，Guangdong Medical University，Zhanjiang
524023，China;3． Department of Biochemistry，Guangdong Medical University，Zhanjiang 524023，China)
Abstract:Objective To examine the antiproliferative and proapoptotic effects of 5F (ent － 11α － hydroxy － 15 － oxo
－ kaur － 16 － en － 19 － oic － acid)，a compound isolated from Pteris semipinnata L．(PsL)，on HCT － 116 colorectal cancer
(CＲC)cells．Methods Cytotoxicity was examined using a MTT method． Cell apoptosis was determined through expression
of representative apoptosis － related proteins and Annexin V /PI staining． Ｒeactive oxygen species (ＲOS)level was meas-
ured using standard protocols． Ｒesults 5F inhibited the proliferation of HCT － 116 cells in a concentration － and time － de-
pendent manner． 5F increased the ratio of Bax /Bcl － 2 in HCT － 116 cells was identified by western blotting analysis． 5F
could enhance both the inhibitory effect of cisplatin on growth of HCT － 116 cells and the level of apoptosis induced by cis-
platin in HCT － 116 cells． 5F did not increase ＲOS，but reduced ＲOS production induced by cisplatin． Conclusion 5F can
induce CＲC cell apoptosis and therefore represents therapeutic potential for cancer treatment．
Key words:Pteris semipinnata L．;Colorectal cancer;Apoptosis;Ｒeactive oxygen species
结直肠癌(CＲC)为世界第三常发癌、第四致死
癌［1］。尽管早期诊治均取得显著进步，但 CＲC 预后
仍然较差。因此，急需发展有效、安全的 CＲC 治疗
方法。5F (ent － 11α － hydroxy － 15 － oxo － kaur － 16
－ en － 19 － oic － acid)为中草药半边旗(Pteris semip-
innata L．，PsL)提取物，在体内外均显示出较佳的抑
·391·药学研究·Journal of Pharmaceutical Ｒesearch 2016 Vol． 35，No． 4
癌效果且毒副作用轻微［2 － 8］。虽有报道称 5F 能够
通过诱导细胞凋亡抑制人结肠癌细胞 HT － 29 增
殖，但其机制仍不明了［9］。本研究检测了 5F 对体
外培养的人结直肠癌细胞 HCT － 116 的杀灭效果，
并探讨了相关机制。
1 材料
1． 1 细胞系 CＲC 细胞 HCT － 116，由本实验室冷
冻保存。
1． 2 药品 5F 干粉由本实验室提供，丙二醇溶解
后蒸馏水稀释，制成丙二醇体积分数为 0． 15，5F 质
量浓度为 1 000 mg·L －1的储备液，除菌过滤后冷
藏，实验时再以培养基稀释至所需浓度(丙二醇最
终浓度≤0． 012)。
1． 3 试剂 ＲPMI － 1640 培养基干粉(Sigma 公
司);新生牛血清(Hyclone 公司);胰蛋白酶(Amres-
co公司);噻唑蓝(MTT，Sigma 公司);顺铂(cispla-
tin，齐鲁制药有限公司);Annexin V － FITC 凋亡检
测试剂盒(Dojindo 公司);活性氧(ＲOS)检测试剂
盒、辣根过氧化物酶标记二抗、GAPDH单克隆抗体、
细胞裂解液、BCA 蛋白浓度测定试剂、SDS － PAGE
配制试剂盒、SDS － PAGE 蛋白上样缓冲液、PVDF
膜、免疫印迹转膜液、显影定影试剂、发光液(碧云
天);Bax及 Bcl － 2 抗体(中杉金桥)。
1． 4 主要仪器 YJ － 875 医用净化工作台(苏州净
化设备公司);CO2 恒温培养箱(Thermo 公司);
ELx800 酶标仪(Bio － Tek 公司);普通光学倒置显
微镜(Nikon公司);流式细胞仪(Beckman Coulter 公
司);垂直电泳仪(Bio － rad公司)。
2 方法
2． 1 细胞培养 HCT － 116 细胞株于含 10%新生
牛血清的 ＲMPI － 1640 培养液中，在 37 ℃、含 5%
CO2 的饱和湿度空气中培养。
2． 2 MTT法检测肿瘤细胞存活率 当 HCT － 116
细胞处于对数生长期时，以胰酶剥离细胞，细胞计数
后调整细胞浓度，接种细胞于 96 孔培养板，确定每
孔含细胞 2 000 个。24 h 后，单独以 5F (0 ～ 80
μg·mL －1)、顺铂 (10 μg · mL －1)或 5F (10
μg·mL －1)、顺铂(10 μg·mL －1)联用处理细胞。
经 24、48 或 72 h培养后，加 MTT染液(MTT终浓度
为 0． 5 mg·mL －1)并继续培养 4 h，弃上清，每孔加
DMSO 100 μL，振荡后以酶标仪检测波长 570 nm处
吸光度，计算肿瘤细胞存活率。在 5F 处理 24 h 的
时间点处，进行形态学研究。
2． 3 流式细胞仪检测细胞凋亡 当 HCT － 116 细
胞处于对数生长期时，胰酶剥离细胞，接种细胞于 6
孔培养板，确定每孔含细胞 105 个。24 h后，单独以
5F (10 μg·mL －1)、顺铂(10 μg·mL －1)或 5F (10
μg·mL －1)、顺铂(10 μg·mL －1)联用处理细胞。
24 h 培养后，按试剂盒所附说明书检测细胞凋亡
水平。
2． 4 流式细胞仪检测细胞 ＲOS 生成 细胞处理方
法同上。24 h培养后，按试剂盒所附说明书检测细
胞内 ＲOS水平。
2． 5 免疫印迹检测 Bax 及 Bcl － 2 蛋白表达 取对
数生长期 HCT － 116 细胞接种于 6 孔细胞培养板。
24 h后，以 5F (0 ～ 80 μg·mL －1)处理细胞，培养 24
h后收集细胞。按试剂盒所附说明书提取蛋白并测
定浓度。SDS － PAGE 电泳，转膜，脱脂奶封闭 2 h，
加 Bax (1∶200)或 Bcl － 2(1∶200)抗体，4 ℃孵育过
夜;洗膜后加二抗，室温孵育 2 h;洗膜、曝光显影，
Quantity One软件分析目标蛋白表达水平。
2． 6 统计学处理 采用 SPSS 12． 0 软件系统单因
素方差分析对实验数据进行统计学处理，P ＜ 0． 05
认为差异有统计学意义。
3 结果
3． 1 5F 对 HCT － 116 细胞增殖活性的影响 MTT
结果显示 5F 可显著抑制 HCT － 116 增殖，并呈剂
量、时间依赖关系(见图 1)。
图 1 5F对 CＲC细胞 HCT － 116 增殖活性的影响
3． 2 5F诱导肿瘤细胞发生形态学变化 5F 处理
后，HCT －116 细胞体积变小、变圆、彼此脱落，呈凋
亡细胞特有形态(见图 2)。
3． 3 5F对 HCT －116 细胞内 Bax /Bcl － 2 比例的影
响 5F处理导致 HCT － 116 细胞内 Bax /Bcl － 2 比
例显著提高，并随剂量的提高呈上升趋势(P ＜
0. 001)(见图 3、4)。
3． 4 5F与顺铂联用对肿瘤细胞的影响 5F 显著
提高了顺铂对肿瘤细胞的杀灭效果(见图 5)，并同
时提高了肿瘤细胞凋亡的发生水平(见图 6)。顺铂
·491· 药学研究·Journal of Pharmaceutical Ｒesearch 2016 Vol． 35，No． 4
图 2 5F处理 24 h对 CＲC细胞形态学影响(× 200)
图3 5F处理24 h对 CＲC细胞内 Bax及 Bcl －2蛋白表达的影响
图 4 5F处理 24 h对 CＲC细胞内 Bax /Bcl － 2 比例的影响
处理使 HCT －116 细胞内 ＲOS生成显著提高，而 5F
处理则能够降低顺铂诱导的 ＲOS生成(见图 7)。
图 5 5F与顺铂联用对 CＲC细胞增殖活性的影响
4 讨论
在本研究中，MTT 结果显示 5F 可显著抑制结
直肠癌细胞 HCT －116 的增殖活性，并呈剂量、时间
依赖关系，提示 5F具有较强的抗癌活性。
图 6 5F与顺铂联用对 CＲC细胞凋亡的影响
图 7 5F与顺铂联用对 CＲC细胞 ＲOS生成的影响
·591·药学研究·Journal of Pharmaceutical Ｒesearch 2016 Vol． 35，No． 4
细胞凋亡(apoptosis)是一种严格程序化的细胞
死亡，在组织发育及稳态维持中发挥了关键作用。
在多细胞生物体，细胞凋亡有助于清除无用及有害
细胞，在细胞存活与死亡之间保持健康平衡。该平
衡一旦瓦解，细胞增殖失控并导致癌症发生。因此，
通过细胞凋亡杀灭癌细胞被认为是治疗癌症的最佳
策略。Bcl － 2 蛋白家族在细胞凋亡过程中扮演了
重要角色，其成员包括 Bcl － 2、Bcl － xL、Bcl － xS、
Mcl － 1、Bax及 Bad等。Bcl － 2、Bcl － xL 及 Mcl － 1
蛋白可抑制细胞凋亡，而 Bax、Bad 及 Bcl － xS 蛋白
则可促进细胞凋亡。Bcl － 2 家族成员间可形成同
源或异源二聚体，而这些二聚体的相对比例能够决
定细胞是否会发生细胞凋亡，Bcl － 2 过表达可保护
癌细胞免于凋亡，而 Bax 表达提高则能够促进细胞
凋亡［10 － 13］，研究表明，Bax /Bcl － 2 比例的提高必然
伴随细胞凋亡的发生［14 － 18］。在本研究中，5F 处理
导致 HCT － 116 细胞内 Bax /Bcl － 2 比例显著提高，
提示 5F杀灭肿瘤细胞涉及细胞凋亡。
顺铂是抗癌效果最佳的化疗药物之一，但其具
有明显的毒副作用，如肾毒性。其毒副作用被认为
与顺铂诱导的 ＲOS 生成有关［19 － 20］。在本研究中，
5F显著提高了顺铂对肿瘤细胞的杀灭效果，同时，
5F与顺铂联用也显著提高了肿瘤细胞凋亡的发生
水平，提示 5F促进顺铂对肿瘤细胞的杀灭效果与细
胞凋亡有关。在本研究中，我们还发现顺铂能够显
著提高肿瘤细胞内的 ＲOS 生成，而 5F 则降低了顺
铂所诱导的 ＲOS 生成，提示 5F 具有较佳的 ＲOS 清
除能力。鉴于此，5F与顺铂联用不仅可以提高顺铂
的抗癌效果，还可能降低顺铂的毒性。
综上所述，5F抑制 HCT － 116 细胞增殖活性涉
及细胞凋亡，该凋亡与 Bax /Bcl － 2 比例提高有关;
5F能够提高顺铂对 HCT － 116 细胞的杀灭效果，并
能够降低顺铂诱导的 ＲOS 生成。5F 在体外具有较
佳的抗 CＲC效果，其是否能够成为抗 CＲC 新药的
有力候选者还需体内实验进一步验证。
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(下转第 211 页)
·691· 药学研究·Journal of Pharmaceutical Ｒesearch 2016 Vol． 35，No． 4
表 1 盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱回收率试验
序号 取样量(mL) 样品中含量(μg) 加入量(μg) 测得量(μg) 回收率(%) 平均值(%) ＲSD(%)
盐酸麻黄碱
1 199． 28 216． 24 413． 94 99． 3
99． 4 0． 47
1 199． 28 216． 24 416． 04 100． 2
1 199． 28 216． 24 414． 26 99． 4
1 199． 28 216． 24 414． 07 99． 3
1 199． 28 216． 24 412． 90 98． 8
1 199． 28 216． 24 414． 25 99． 4
盐酸伪麻黄碱
1 58． 32 53． 55 111． 47 99． 3
100． 7 1． 09
1 58． 32 53． 55 113． 12 102． 3
1 58． 32 53． 55 112． 32 100． 8
1 58． 32 53． 55 112． 30 100． 8
1 58． 32 53． 55 111． 71 99． 7
1 58． 32 53． 55 112． 49 101． 2
表 2 样品测定结果
批号
盐酸麻黄碱
(μg·mL －1)
盐酸伪麻黄碱
(μg·mL －1)
总含量
(μg·mL －1)
总含量
(mg·mL －1)
20141217 199． 28 58． 32 257． 60 0． 258
20141218 198． 44 58． 14 256． 58 0． 257
20141219 196． 53 57． 58 254． 11 0． 254
3 小结与讨论
3． 1 由于本制剂剂型为合剂，曾将药液直接过滤膜
后进样，发现杂质干扰大，影响所测成分的分离，后
采用萃取法，制备的供试品溶液杂质少，有利于色谱
分离测定。
3． 2 《中国药典》2010 年版(一部)麻黄项下对盐
酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的测定中，采用极性乙醚
连接苯基键合硅胶为填充剂，由于条件所限，本试验
采用常用的十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，仍然
获得了较好的分离度，可达 2． 4，但随着进样量的增
加，分离度会下降，同时峰不对称度会增大。
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