全 文 :中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 9期 2016年 5月 ·1520·
茯苓补料液体发酵工艺优化及不同来源茯苓所含成分量比较
李 羿,李 晨,杨万清,杨 胜*
成都医学院药学院,四川 成都 610083
摘 要:目的 优化茯苓发酵罐补料液体发酵的发酵工艺,比较天然茯苓、发酵茯苓、药性发酵茯苓和复合药性发酵茯苓等
不同茯苓样品化学成分的差异。方法 分别以营养培养基、药性培养基和复合药性培养基为初始发酵培养基,开展茯苓发酵
罐补料液体发酵的研究,筛选出最适初始发酵培养基和确定最佳发酵时间。利用茯苓化学成分的理化性质进行提取分离和定
量测定。结果 添加薏苡仁和枸杞子的复合药性培养基为最适初始发酵培养基,最佳发酵时间为 120 h。测定了不同来源茯
苓中总糖、多糖、氨基酸、微量元素和灰分的量。结论 不同初始发酵培养基对茯苓液体发酵有较大影响,不同来源茯苓间
的化学成分有较大差异。
关键词:茯苓;补料液体发酵;初始发酵培养基;化学成分;菌丝体
中图分类号:Q949.32;R931.71 文献标志码:A 文章编号:0253 - 2670(2016)09 - 1520 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.09.012
Optimization of technique for additional liquid fermentation of Poria cocos and
comparison on chemical constituents from different sources of Poria
LI Yi, LI Chen, YANG Wan-qing, YANG Sheng
School of Pharmacy, Chengdu Medical College, Chengdu 610083, China
Abstract: Objective To optimize the technique for additional liquid fermentation of Poria cocos in fermentor and to compare the
chemical constituents in natural Poria, fermented Poria, medicinal fermented Poria, and compound medicinal fermented Poria.
Methods The additional liquid fermentations of Poria cocos in fermentor had been carried out among different initial fermentation
media, such as nutrition medium, medicinal medium, and compound medicinal medium. An optimum initial fermentation medium had
been screened and an optimum time of additional liquid fermentation had been determined. The chemical constituents from the
different sources of Poria had been isolated and detected according to their physicochemical properties. Results The compound
medicinal medium with Coicis Semen and Lycii Fructus was an optimum initial fermentation medium, and 120 h was an optimum time
of additional liquid fermentation. The total saccharides, polysaccharides, amino acids, trace elements, and ashes in the different sources
of Poria had been detected. Conclusion There are considerable influences on liquid fermentation of Poria cocos in different initial
fermentation media. There are rather big differences of chemical constituents from the different sources of Poria.
Key words: Poria cocos; additional liquid fermentation; initial fermentation medium; chemical constituents; mycelium
现代发酵工程技术已广泛应用于茯苓等药用真
菌的液体发酵,茯苓高密度液体发酵有望推动其工
业化生产的进程,确保其产品质量,对于其资源和
生态环境的保护有重要意义。茯苓发酵罐补料液体
发酵是实现其高密度液体发酵的有效方式。补料液
中碳氮源浓度将显著地影响茯苓胞外多糖和菌丝体
的产量。与营养培养基相比,添加适量中药材的药
性培养基中的化学成分可有效调控药用真菌的生长
代谢,从而影响其液体发酵水平的高低[1-3]。本实验
分别以营养培养基、添加薏苡仁的药性培养基、添
加薏苡仁和枸杞子的复合药性培养基为初始发酵培
养基,开展茯苓发酵罐补料液体发酵的研究,优化
其发酵工艺。同时,比较了天然茯苓(野生采收)、
发酵茯苓(营养培养基中液体发酵)、药性发酵茯苓
收稿日期:2015-12-30
基金项目:四川省人力资源和社会保障厅四川省学术和技术带头人培养资金项目(13Z004);四川省教育厅科研项目(12ZB023)
作者简介:李 羿(1969—),男,四川成都人,教授,博士,从事发酵中药及中药品种、品质的研究。
Tel: (028)62308636 E-mail: lychengdu@aliyun.com
*通信作者 杨 胜 Tel: (028)62308610 E-mail: 3474322@qq.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 9期 2016年 5月 ·1521·
(药性培养基中液体发酵)和复合药性发酵茯苓(复
合药性培养基中液体发酵)等不同茯苓的总糖、多
糖、灰分、氨基酸和微量元素的差异,为茯苓等药
用真菌资源的科学开发与利用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
Bioflo III型发酵罐,NBS公司;全温振荡器,
哈尔滨东联电子技术开发有限公司;超净工作台,
苏净集团安泰公司;GGX-9火焰原子吸收光谱仪,
北京地质仪器厂;J2-HS型离心机,Beckman公司;
WOS-20 型无油空气压缩机,天津天伟医疗器械有
限公司; SX2-4-10箱式电阻炉,沈阳市节能炉厂;
L-8800全自动氨基酸分析仪,Hitachi公司;BP121S
型电子天平,Sartorius公司。
蛋白胨、酵母浸膏购自 Oxoid;葡萄糖对照品
购自中国食品药品检定研究院(质量分数>99.9%,
批号 111648-200406);苯酚(重蒸);18.3 MΩ高纯
水,微量元素定量测定用;实验用其他试剂均采用
国产分析纯。实验所用中药材均购自成都杏林大药
房,样品经成都医学院游元元博士鉴定为薏苡仁
Coix lacryma-jobi L. var. mayuen (Roman.) Stapf和
枸杞子 Lycium barbarum L.。
1.2 发酵培养基
1.2.1 种子培养基 葡萄糖 20 g,蛋白胨 5 g,酵
母浸膏 4 g,K2HPO4 1 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,初始
pH值 5.5,蒸馏水 1 L。1.05 kg/cm2,121.3 ℃灭菌
20 min。
1.2.2 营养培养基 葡萄糖 100 g,蛋白胨 11.25 g,
酵母浸膏 8.75 g,K2HPO4 5 g,MgSO4·7H2O 2.5 g,
初始 pH值 5.5,蒸馏水 4.05 L。1.05 kg/cm2,121.3 ℃
灭菌 20 min。
1.2.3 药性培养基 薏苡仁 37.5 g,其余同“1.2.2”
项营养培养基。
1.2.4 复合药性培养基 薏苡仁 18.75 g,枸杞子
18.75 g,其余同“1.2.2”项营养培养基。
1.2.5 补料培养基 A 液:葡萄糖 100 g,蒸馏水
300 mL。B液:蛋白胨 11.25 g,酵母浸膏 8.75 g,
蒸馏水 300 mL。将 A 液和 B 液于 0.56 kg/cm2,
112.6 ℃分别灭菌 30 min,冷却至室温后,将 A液
和 B液无菌混和均匀。
1.3 种子液制备
将 1.75 mL冷冻甘油菌 P6(成都医学院生药学
教研室筛选保存)接种于 350 mL种子培养基中,
25 ℃摇瓶振荡培养 2 d。
1.4 发酵罐补料液体发酵
1.4.1 以营养培养基为初始培养基的发酵罐补料液
体发酵 在火焰保护下,将 350 mL种子液接种于
发酵培养基中。设定发酵参数:温度 26 ℃,pH值
5.5,搅拌转速和通气量根据溶氧高低而动态调整。
在茯苓发酵罐液体发酵的第 48、60、72、84小时,
蠕动泵分 4次将补料培养基 100、200、200、100 mL
滴加于发酵液中。第 120小时终止茯苓液体发酵。
1.4.2 以药性培养基为初始培养基的发酵罐补料液
体发酵 在火焰保护下,将 350 mL种子液接种于
发酵罐药性培养基中,其余同“1.4.1”项,以营养
培养基为初始培养基的发酵罐补料液体发酵。
1.4.3 以复合药性培养基为初始培养基的发酵罐
补料液体发酵 在火焰保护下,将 350 mL种子液
接种于发酵罐复合药性培养基中,其余同“1.4.1”
项,以营养培养基为初始培养基的发酵罐补料液体
发酵。
1.4.4 发酵时间对发酵罐复合药性补料液体发酵的
影响 在茯苓液体发酵 108~130 h,每隔 2 h取样,
测定发酵液中胞外多糖和菌丝体干质量。综合考虑
胞外多糖和菌丝体产量以确定发酵终点。
1.5 胞外多糖纯化与称量
胞外多糖纯化与称量参照文献方法[4]。
1.6 菌丝体干质量的称量
用离心机 6 000 r/min离心发酵液 15 min,收集
菌丝体沉淀,60 ℃烘干至恒定质量,用电子天平精
确称量。
1.7 不同来源茯苓所含成分量的比较
1.7.1 总糖测定 参照文献方法[5]测定茯苓样品中
总糖。
1.7.2 水溶性多糖和碱溶性多糖测定 参照文献方
法[6]进行茯苓水溶性多糖和碱溶性多糖的的提取分
离及测定。
1.7.3 氨基酸测定 按中华人民共和国国家标准
GB/T 5009.124-2003测定样品氨基酸。
1.7.4 微量元素测定 参照文献方法[7]测定样品微
量元素。
1.7.5 灰分测定 按中华人民共和国国家标准
GB/T 8306-2002测定样品总灰分,按中华人民共和
国国家标准 GB/T 8307-2002测定样品水溶性灰分,
按中华人民共和国国家标准 GB/T 8308-2002 测定
样品酸不溶性灰分。
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 9期 2016年 5月 ·1522·
1.8 统计学分析
实验数据分析均采用统计学软件 SPSS 13.0。实
验数据以 x±s表示,P<0.05为统计学意义上具有
显著差异性。
2 结果与分析
2.1 不同初始发酵培养基对茯苓发酵罐补料液体
发酵的影响
不同初始发酵培养基对茯苓发酵罐补料液体发
酵的影响见表 1。以复合药性培养基为初始发酵培
养基的发酵罐复合药性补料液体发酵的胞外多糖产
量最高,达 8.33 g/L;以药性培养基为初始发酵培
养基的发酵罐药性补料液体发酵的菌丝体干质量最
高,达 15.03 g/L。综合考虑胞外多糖和菌丝体产量,
认为以复合药性培养基为初始发酵培养基的发酵罐
补料液体发酵是一种较优的发酵方式。
表 1 不同初始发酵培养基对茯苓发酵罐补料液体发酵的影
响 ( x ±s, n = 3)
Table 1 Effects of different initial fermentation media on
additional liquid fermentation of P. cocos in fermentor
( x ±s, n = 3)
种类 胞外多糖/(g·L−1) 菌丝体干质量/(g·L−1)
营养培养基 5.56±0.08 12.53±0.11
药性培养基 7.45±0.08* 15.03±0.16*
复合药性培养基 8.33±0.12* 14.75±0.08*
与营养培养基组比较:*P<0.05
*P < 0.05 vs nutrition medium group
2.2 发酵时间对发酵罐复合药性补料液体发酵的
影响
发酵时间对发酵罐复合药性补料液体发酵的影
响见表 2。发酵第 124 小时,胞外多糖产量最高,
达 8.47 g/L;发酵第 116小时,菌丝体干质量最高,
达 14.85 g/L。以胞外多糖和菌丝体产量为评价指
标,综合考虑发酵成本,认为 120 h是发酵罐复合
药性补料液体发酵的最佳发酵终点,胞外多糖产量
表 2 发酵时间对茯苓发酵罐复合药性补料液体发酵的影响
( x ±s, n = 3)
Table 2 Effects of different fermentation time on compound
medicinal additional liquid fermentation of P. cocos in
fermentor ( x ±s, n = 3)
发酵时间/h 胞外多糖/(g·L−1) 菌丝体干质量/(g·L−1)
108 5.37±0.06 13.62±0.14
110 5.74±0.07 14.11±0.11
112 6.22±0.08 14.40±0.12
114 6.77±0.08 14.64±0.10
116 7.34±0.09 14.85±0.11
118 7.83±0.05 14.75±0.11
120 8.37±0.07 14.70±0.11
122 8.43±0.08 14.66±0.06
124 8.47±0.10 14.49±0.10
126 8.38±0.06 14.29±0.08
128 8.28±0.08 13.99±0.15
130 8.23±0.10 13.59±0.14
达 8.37 g/L,菌丝体干质量达 14.70 g/L。
2.3 总糖和多糖测定
不同来源茯苓中总糖和多糖测定结果见表 3。
天然茯苓总糖质量分数 85.76%和总多糖质量分数
82.25%均远高于发酵茯苓、药性发酵茯苓和复合药
性发酵茯苓,而茯苓总糖和总多糖质量分数在发酵
茯苓、药性发酵茯苓和复合药性发酵茯苓之间的差
别却不大。另外,虽然发酵茯苓、药性发酵茯苓和
复合药性发酵茯苓中碱溶性茯苓多糖的比例远低于
天然茯苓,但其水溶性茯苓多糖的比例却远高于天
然茯苓。
2.4 氨基酸测定
不同来源茯苓中氨基酸测定结果见表 4。发酵
茯苓、药性发酵茯苓和复合药性发酵茯苓中所含有
的蛋氨酸、组氨酸和精氨酸在天然茯苓中未检测出。
天然茯苓总氨基酸较低,仅为 1.48%;而发酵茯苓、
表 3 不同来源茯苓样品中总糖和总多糖测定结果 ( x ±s, n = 3)
Table 3 Determination of polysaccharides and total saccharides in different sources of Poria ( x ±s, n = 3)
样品 总糖/% 水溶性茯苓多糖/% 碱溶性茯苓多糖/% 总多糖/%
天然茯苓 85.76±0.54 2.41±0.09 79.79±0.36 82.25±0.50
发酵茯苓 44.83±0.36* 6.86±0.10* 17.68±0.18* 24.55±0.13*
药性发酵茯苓 45.66±0.48* 7.25±0.07* 18.73±0.19* 25.94±0.20*
复合药性发酵茯苓 45.95±0.36* 7.11±0.07* 18.76±0.13* 25.88±0.20*
与天然茯苓组比较:*P<0.05
*P < 0.05 vs natural Poria guoup
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表 4 不同来源茯苓样品中氨基酸测定结果 ( x ±s, n = 3)
Table 4 Determination of amino acids in different sources of Poria ( x ±s, n = 3)
样品 总氨基酸/% 丙氨酸/% 缬氨酸/% 亮氨酸/% 异亮氨酸/% 蛋氨酸/% 天冬氨酸/% 谷氨酸/% 赖氨酸/%
天然茯苓 1.48±0.03 0.05±0.00 0.54±0.03 0.13±0.00 0.10±0.00 0.00±0.00 0.07±0.00 0.07±0.00 0.00±0.00
发酵茯苓 25.54±0.59 1.77±0.09* 2.52±0.19* 1.64±0.14* 1.07±0.06* 0.63±0.02 2.17±0.12 2.80±0.17* 1.91±0.23*
药性发酵茯苓 21.34±0.78 1.40±0.14* 2.13±0.10* 1.27±0.12* 1.01±0.04* 0.58±0.02 1.78±0.14* 2.31±0.16* 1.32±0.08*
复合药性发酵茯苓 21.32±0.19 1.49±0.07* 2.14±0.16* 1.32±0.10* 0.92±0.05* 0.59±0.04 1.83±0.14* 2.27±0.16* 1.29±0.12*
样品 精氨酸/% 甘氨酸/% 丝氨酸/% 苏氨酸/% 脯氨酸/% 苯丙氨酸/% 酪氨酸/% 组氨酸/% 脯氨酸/%
天然茯苓 0.00±0.00 0.03±0.00 0.06±0.01 0.04±0.00 0.04±0.00 0.10±0.00 0.09±0.00 0.00±0.00 0.04±0.00
发酵茯苓 1.47±0.09* 1.39±0.09* 0.95±0.04 1.13±0.08* 2.54±0.22* 1.19±0.11* 0.83±0.06* 0.81±0.02 2.54±0.22*
药性发酵茯苓 1.22±0.04 0.96±0.06* 0.80±0.05 1.11±0.08* 2.27±0.16* 1.13±0.05* 0.71±0.04* 0.62±0.02* 2.27±0.16*
复合药性发酵茯苓 1.14±0.06* 1.00±0.04* 0.83±0.03 1.17±0.08* 2.13±0.18* 1.14±0.05* 0.67±0.02* 0.63±0.02* 2.13±0.18
与天然茯苓组比较:*P<0.05;天然茯苓中赖氨酸的量为 0.002 3%
*P < 0.05 vs natural Poria guoup; lysine in natural Poria was 0.002 3%
药性发酵茯苓和复合药性发酵茯苓总氨基酸却分别
高达 25.54%、21.34%和 21.32%。认为这可能与发
酵茯苓、药性发酵茯苓和复合药性发酵茯苓的培养
基中氮源浓度远高于天然茯苓的培养基中氮源浓度
及发酵方式的差异有关。
2.5 茯苓微量元素测定
不同来源茯苓中微量元素测定结果见表 5。除
Cr和 Cd外,天然茯苓中其他微量元素的量均高于
发酵茯苓、药性发酵茯苓和复合药性发酵茯苓,但
不同来源茯苓间微量元素的量差异不大,且不同来
源茯苓间元素的量从高到低的次序(K>Mg>Ca>
Fe>Mn>Cu>Zn>Pb>Cr>Cd)也一致。不同来
源茯苓中 K的量最高,天然茯苓、发酵茯苓、药性
发酵茯苓和复合药性发酵茯苓间微量元素的量分别
为 660.5、572.4、634.3、621.9 μg/g;不同来源茯苓
中 Cr的量较低,均为 0.2 μg/g。
2.6 灰分测定
不同来源茯苓中灰分测定结果见表 6。不同茯
苓间水溶性灰分差异较小,而酸不溶性灰分差异却
较大。天然茯苓的总灰分远低于发酵茯苓、药性发
表 5 不同来源茯苓样品中微量元素测定结果 ( x ±s, n = 3)
Table 5 Determination of trace elements in different sources of Poria ( x ±s, n = 3)
样品
质量分数/(μg·g−1)
K Mg Ca Fe Mn Cu Zn Pb Cr Cd
天然茯苓 660.5±18.2 104.5±3.8 58.3±1.1 41.9±0.6 12.7±0.2 5.7±0.0 2.8±0.0 0.6±0.0 0.2±0.0 0.0±0.0
发酵茯苓 572.4±13.6 98.1±1.8 51.8±0.8 38.7±0.6 10.2±0.2 5.4±0.0 1.7±0.0 0.5±0.0 0.2±0.0 0.0±0.0
药性发酵茯苓 634.3±11.4 103.6±2.2 53.7±0.3 40.9±0.6 11.4±0.2 5.6±0.1 2.3±0.0 0.5±0.0 0.2±0.0 0.0±0.0
复合药性发酵茯苓 621.9±16.3 102.4±2.2 55.4±0.8 40.6±0.4 11.3±0.2 5.5±0.0 2.3±0.0 0.5±0.0 0.2±0.0 0.0±0.0
不同茯苓中 Cd元素为 0.01 mg/g
The contents of Cd in different sources of Poria were 0.01 mg/g
表 6 不同来源茯苓样品中灰分测定结果 ( x ±s, n = 3)
Table 6 Determination of ashes in different sources of Poria ( x ±s, n = 3)
样品 总灰分/% 水溶性灰分/% 酸不溶性灰分/%
天然茯苓 0.233±0.008 0.089±0.006 0.101±0.008
发酵茯苓 5.900±0.181* 0.041±0.006* 0.823±0.014*
药性发酵茯苓 4.833±0.185* 0.059±0.005* 0.622±0.008*
复合药性发酵茯苓 4.720±0.015* 0.063±0.005* 0.615±0.007*
与天然茯苓组比较:*P<0.05
*P < 0.05 vs natural Poria group
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酵茯苓和复合药性发酵的总灰分。导致天然茯苓和
发酵茯苓、药性发酵茯苓和复合药性发酵间酸不溶
性灰分和总灰分测量值间偏差较大原因可能是发酵
方式的不同。
3 讨论
3.1 茯苓液体发酵的讨论
茯苓液体发酵中碳氮源浓度过高或过低都将抑
制茯苓的生长,根据液体发酵中碳氮源消耗速率来
动态补充碳氮源是一个好的策略。不同中药材所含
化学成分不同,对茯苓生长代谢有促进或抑制作用。
筛选适宜的中药材添加到营养培养基组成药性培养
基,所添加中药材中的化学成分可提高茯苓液体发
酵的水平。研究发现薏苡仁、枸杞子薏苡仁、枸杞
子、灵芝、甘草、桑叶和淡竹叶等 6味中药材对茯
苓生长有促进作用[8]。复合药性培养基较药性培养
基的化学成分更加复杂,在将发酵培养基高温灭菌
的过程中还可能产生新的化学成分,通过其多种化
学成分间协同作用来提高茯苓液体发酵水平的作用
机理尚难以阐明。笔者研究发现,将薏苡仁和枸杞
子粉末(薏苡仁-枸杞子 1∶1)按 0.75%比例加入营
养培养基中组成复合药性培养基,可较大地提高胞
外多糖和菌丝体的产量[9]。
3.2 茯苓所含成分量的比较
由于生产天然茯苓、发酵茯苓、药性发酵茯苓
和复合药性发酵茯苓的培养基所含营养成分的差
异,特别是碳氮源种类和浓度的差异,加之培养基
中所含药性成分的不同和发酵方式的差异,使不同
茯苓中的化学成分(如茯苓胞外多糖多糖、胞内多
糖、氨基酸、微量元素)有较大差异性。天然茯苓
中总糖和总多糖远高于发酵茯苓、药性发酵茯苓和
复合药性发酵茯苓中总糖和总多糖,而天然茯苓中
总氨基酸却远高低于发酵茯苓、药性发酵茯苓和复
合药性发酵茯苓中总氨基酸。茯苓多糖和三萜类化
合物是茯苓的主要活性化合物,具有显著的抗肿瘤、
提高免疫功能等药理作用[10-12]。
另外,茯苓中氨基酸、微量元素对于发挥其健
脾宁心、利水渗湿的功效可能起着重要作用。例如,
K对调节人体组织及细胞中的酸碱平衡,降低人体
血压有益;Mg 对调节神经肌肉的兴奋,维持人体
骨骼和牙齿的正常生长和体温调节都有重要作用;
Mn 是人体内多种酶的组成成分和激活物,有抗衰
老和预防癌症作用;锌对部分细菌和病毒有抑制作
用,能增强人体免疫力。今后,应加强茯苓液体发
酵的发酵动力学研究[13-14],有效实现茯苓补料高密
度液体发酵的动态调控,从而大幅度地提高其液体
发酵水平和质量。另外,积极开展茯苓多糖和三萜
类化合物等活性成分的结构鉴定和药效学评价的研
究,以进一步揭示其药效的物质作用基础,并不断
完善茯苓的质量评价标准,实现茯苓资源的高效开
发与有效利用。
参考文献
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