全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 10 期 2016 年 5 月

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• 化学成分 •
热毒宁注射液化学成分研究（III）
李海波 1, 2，于 洋 3，王振中 1, 2，孟兆青 1, 2，房 卉 1, 2，丁 岗 1, 2，黄文哲 1, 2，萧 伟 1, 2*，姚新生 3*
1. 江苏康缘药业股份有限公司，江苏 连云港 222001
2. 中药制药过程新技术国家重点实验室，江苏 连云港 222001
3. 暨南大学中药及天然药物研究所，广东 广州 510632
摘 要：目的 研究热毒宁注射液抗病毒活性部位的化学成分。方法 采用流感病毒致应激负荷小鼠模型进行抗病毒活性部
位的筛选，综合应用硅胶、ODS、Sephadex LH-20 和 Toyopearl HW-40 柱色谱以及反相 MPLC、HPLC 等现代色谱技术对抗
病毒活性部位进行分离和纯化，根据化合物的光谱数据和理化性质鉴定化合物结构。通过采用检测海肾荧光素酶（Rluc）报
告基因的表达水平来反映病毒感染水平的方法，对分离得到的化合物进行了体外抗登革热病毒的活性测试。结果 热毒宁注
射液经 HP-20 大孔吸附树脂，95%乙醇洗脱部位为抗病毒活性部位，从中分离得到 14 个化合物，分别鉴定为 (2E,6S)-8-[α-L-
arabinopyranosyl-(1″-6′)-β-D-glucopyranosyloxy]-2,6-dimethylct-2-eno-1,2″-lactone（1）、落叶脂素（2）、5′-甲氧基异落叶松树
脂醇（3）、异落叶松脂素（4）、(7R,8R)-4,7,9,9′-tetrahydroxy-3,3′-dimethoxy-8-O-4′-neolignan（5）、(7S,8R)-4,7,9,9′-tetrahydroxy-3,3′-
dimethoxy-8-O-4′-neolignan（6）、肥牛木素（7）、5′-甲氧基肥牛木素（8）、(−)-二氢脱氢二松柏醇（9）、(7S,8R)-3,3′,5-trimethoxy-
4′,7-epoxy-8,5′-neolignan-4,9,9′-triol（10）、2-顺式-4-反式-脱落酸（11）、2-反式-4-反式-脱落酸（12）、(1S,3R,4R,5S,7R,9R)-
decane-6-carboxylic acid（13）、(1S,3R,4S,5S,7R,9R)-decane-6-carboxylic acid（14）；其中化合物 1 对登革热病毒的 EC50值为
74.76 μmol/L，选择指数（SI）值大于 1.07，具有体外抗登革热病毒的活性。结论 化合物 8 为新化合物，其他化合物均为
首次从中药复方热毒宁注射液中分离得到，化合物 1 具有体外抗登革热病毒的活性。
关键词：热毒宁注射液；5′-甲氧基肥牛木素；木脂素；落叶脂素；2-顺式-4-反式-脱落酸；抗登革热病毒活性
中图分类号：R284.1 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2016)10 - 1643 - 07
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.10.002
Research on chemical constituents from Re-Du-Ning Injection (III)
LI Hai-bo1, 2, YU Yang3, WANG Zhen-zhong1, 2, MENG Zhao-qing1, 2, FANG Hui1, 2, DING Gang1, 2,
HUANG Wen-zhe1, 2, XIAO Wei1, 2, YAO Xin-sheng3
1. Kanion Pharmaceutical Co., Ltd., Lianyungang 222001, China
2. State Key Laboratory of New-tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process, Lianyungang 222001, China
3. Institute of Traditional Chinese Medicine and Natural Products, Jinan University, Guangzhou 510632, China
Abstract: Objective To study the antiviral constituents from the active fraction of Re-Du-Ning (RDN) Injection. Methods In this
study, the active fraction of RDN Injection was screened by the mice model loaded with restraint stress infected with influenza virus.
The chemical constituents were isolated by chromatography on silica gel, ODS, Sephadex LH-20 & Toyopearl HW-40 columns, and
reverse phase MPLC & HPLC repeatedly. Their structures were identified by spectral data and physicochemical property. Results
The 95% ethanol eluate of RDN Injection on the macroporous adsorption resin column was proved to be the antivirus active fraction of
RDN Injection. Fourteen compounds were isolated and identified as (2E,6S)-8-[α-L-arabinopyranosyl-(1″-6′)-β-D-glucopyranosyloxy]-
2,6-dimethylct-2-eno-1,2″-lactone (1), lyoniresinol (2), 5′-methoxyisolariciresinol (3), ent-isolariciresinol (4), (7R,8R)-4,7,9,9′-
tetrahydroxy-3,3′-dimethoxy-8-O-4′-neolignan (5), (7S,8R)-4,7,9,9′-tetrahydroxy-3,3′-dimethoxy-8-O-4′-neolignan (6), ceplignan (7),

收稿日期：2015-11-16
基金项目：江苏省自然科学青年基金：基于活性成分追踪分离及快速检识分析新策略的中药复方药效物质基础研究（BK20140441）；江苏省博
士后科研资助计划（1401171C）
作者简介：李海波（1985—），女，福建宁德人，博士，研究方向为中药及天然药物的活性成分研究。E-mail: lihaibo1985124@sina.com
*通信作者 萧 伟，教授，博士生导师，研究方向为中药新剂型的研究与开发。Tel: (0518)85521956 E-mail: xw_kanion@163.com
姚新生，中国工程院院士，博士生导师，研究方向为中药及天然药物活性成分研究。Tel: (020)85225849 E-mail: tyaoxs@jnu.edu.cn
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5′-methoxyceplignan (8), (−)-dihydrodehydrodiconiferyl alcohol (9), (7S,8R)-3,3′,5-trimethoxy-4′,7-epoxy-8,5′-neolignan-4,9,9′-triol
(10), (2-cis, 4-trans)-abscisic acid (11), (2-trans, 4-trans)-abscisic acid (12), (1S,3R,4R,5S,7R,9R)-decane-6-carboxylic acid (13), and
(1S,3R,4S,5S,7R,9R)-decane-6-carboxylic acid (14); Among them, compound 1 exhibited the antivirus activity against Dengue virus.
Conclusion Compound 8 is a new compound and the other isolated compounds are reported from RDN Injection for the first time,
and compound 1 shows the anti-virus activity against Dengue virus.
Key words: Re-Du-Ning Injection; 5′-methoxyceplignan; lignans; lyoniresinol; (2-cis, 4-trans)-abscisic acid; anti-Dengue virus activity

中药复方热毒宁注射液是江苏康缘药业股份有
限公司独家产品，处方由栀子、青蒿和金银花 3 味
中药精制而成，具有清热、疏风、解毒的功效，临
床上主要用于治疗外感风热所致的感冒、咳嗽；上
呼吸道感染、急性支气管炎等症[1-4]。其临床疗效确
切，效果显著，本课题组前期已从热毒宁注射液抗
病毒活性部位中分离鉴定了 20 个化合物[5]，在上述
研究的基础上，继续对抗病毒活性部位进行系统的
化学成分研究，从中分离得到 14 个化合物，分别鉴
定 为 (2E,6S)-8-[α-L-arabinopyranosyl-(1″-6′)-β-D-
glucopyranosyloxy]-2,6-dimethylct-2-eno-1,2″-lactone
（1）、落叶脂素（lyoniresinol，2）、5′-甲氧基异落叶
松树脂醇（5′-methoxyisolariciresinol，3）、异落叶松
脂素（5′-methoxyisolariciresinol，4）、(7R,8R)-4,7,9,9′-
tetrahydroxy-3,3′-dimethoxy-8-O-4′-neolignan（5）、
(7S,8R)-4,7,9,9′-tetrahydroxy-3,3′-dimethoxy-8-O-4′-
neolignan（6）、肥牛木素（ceplignan，7）、5′-甲氧
基肥牛木素（5′-methoxyceplignan，8）、(−)-二氢脱
氢二松柏醇 [(−)-dihydrodehydrodiconiferyl alcohol，
9]、(7S,8R)-3,3′,5-trimethoxy-4′,7-epoxy-8,5′-neolignan-
4,9,9′-triol（10）、2-顺式-4-反式-脱落酸 [(2-cis,
4-trans)-abscisic acid，11]、2-反式-4-反式-脱落酸
[(2-trans, 4-trans)-abscisic，12]、(1S,3R,4R,5S,7R,9R)-
decane-6-carboxylic acid（13）、(1S,3R,4S,5S,7R,9R)-
decane-6-carboxylic acid（14）。其中，化合物 8 为
新化合物，其他化合物均为首次从中药复方热毒宁
注射液中分离得到。对分离所得到的化合物进行体
外抗登革热病毒的活性测试，结果显示化合物 1 对
登革热病毒的 EC50 值为 74.76 μmol/L，选择指数
（SI）值大于 1.07，具有体外抗登革热病毒的活性。
1 仪器与材料
Brucker AVANCE400 型核磁共振仪（瑞士
Brucker 公司），Finnigan LCQ Advantage MAX 质谱
仪（美国 Thermo Fisher Scientific 公司），Waters
Snapt G2 mass spectrometer 高分辨质谱仪（美国
Waters 公司），JASCO J-810 CD 光谱仪（日本分光
株式会社），Shimadzu 分析高效液相色谱（日本
Shimadzu 公司，Shimadzu LC-6AD 泵，紫外检测
器），Shimadzu 制备型高效液相色谱（日本 Shimadzu
公司）。分析高效液相色谱柱为 C18 柱（250 mm×
4.6 mm，5 μm，Nacalai Tesque Inc.，日本），制备高
效液相色谱柱为 C18 柱（250 mm×20 mm，5 μm，
Nacalai Tesque Inc.，日本）。薄层硅胶 GF254 和柱色
谱硅胶（青岛海洋化工厂），HP-20 大孔树脂
（Mitsubishi-Chemical，日本），反相 ODS 填料（Merck
公司），Sephadex LH-20 填料（Amersham Biosciences
公司），Toyo-pearl HW-40 填料（Toyo Soda MFG）；
热毒宁注射液（江苏康缘药业股份有限公司生产，
批号 100906）；乳仓鼠肾细胞（BHK 细胞，中国科
学院武汉病毒所），登革热报告病毒（中国科学院武
汉病毒所）。
2 提取与分离
热毒宁注射液成品浓缩液 840 g，用适量水溶解
后经 HP-20 大孔吸附柱色谱，乙醇-水（水及 30%、
95%乙醇）梯度洗脱，得到水洗脱部位 RDN-1（410
g），30%乙醇洗脱部位 RDN-2（318 g），95%乙醇
洗脱部位 RDN-3（84 g）。取 RDN-3（65 g）进行硅
胶柱色谱分离，氯仿-甲醇（98︰2、95︰5、90︰10、
80︰20、70︰30、50︰50、30︰70、0︰100）梯度
洗脱共得到 9 个流分 Fr. 1～9。Fr. 1 经反复硅胶、
ODS 和 Sephadex LH-20 柱色谱以及反相 HPLC 分
离，得到化合物 12（11.6 mg）、13（8.6 mg）、14
（5.2 mg）。Fr. 2 经反复硅胶、ODS 和 Sephadex LH-20
柱色谱以及反相 HPLC 分离，得到化合物 2（15.6
mg）、3（5.6 mg）、4（6.2 mg）、5（4.7 mg）、6（11.9
mg）、7（6.3 mg）、8（7.1 mg）、9（3.3 mg）、10（8.8
mg）和 11（12.5 mg）。Fr. 4 经过 ODS 中低压柱色
谱分离，甲醇-水（10%甲醇-水、30%甲醇-水、50%
甲醇-水、70%甲醇-水和 100%甲醇）梯度洗脱，50%
甲醇-水洗脱部分经 HPLC 制备（25%乙腈）得到化
合物 1（69.5 mg）。
3 结构鉴定
化合物 8：黄色无定形粉末，ESI-MS m/z: 377
[M＋H]+, 375 [M－H]−，提示相对分子质量为 376。
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HR-ESI-Q-TOF-MS 给出 m/z 377.123 3 [M＋H]+（计
算值为 377.123 6），确定化合物分子式为 C19H20O8，
不饱和度为 10。1H-NMR (400 MHz, CD3OD) 谱中
显示了 20个氢信号，其中 4个芳香质子信号 [δ 6.69
(2H, s, H-2′, 6′), 7.59 (1H, brs, H-6), 7.63 (1H, brs,
H-4)]，推测结构中可能存在 2 个四取代苯环；3 个
甲氧基质子信号 [δ 3.83 (6H, s, 3′, 5′-OCH3), 3.92
(3H, s, 7-OCH3)]；13C-NMR (100 MHz, CD3OD) 结
合 DEPT 图谱显示了 19 个碳信号，9 个季碳信号 [δ
170.0 (C-8), 133.3 (C-1′), 145.9 (C-3′, 5′), 136.6
(C-4′), 125.3 (C-5), 145.1 (C-7), 153.3 (C-7a), 130.2
(C-3a)]；4 个芳香次甲基碳信号 [δ 104.3 (C-2′, 6′),
115.5 (C-6), 120.7 (C-4)]；1 个亚甲基碳信号 [δ 64.7
(C-9)]；2 个亚甲基碳信号 [90.3 (C-2), 54.8 (C-3)]
以及 3 个甲氧基碳信号 [δ 56.8 (3′, 5′-OCH3), 56.7
(7-OCH3)]。以上数据通过与文献报道[6]的已知木脂
素类化合物的核磁数据进行比对，揭示化合物 8 为
C-3′，C-5′和 C-7 三甲氧基取代和 C-8 位氧化的苯并
二氢呋喃型木脂素。进一步通过 HMBC 谱进行验
证，在 HMBC 谱中可见 δH 3.83 (6H, s, 3′, 5′-OCH3)
与 δC 145.9 (C-3′, 5′) 相关，δH 3.92 (3H, s, 7-OCH3)
与 δC 145.1 (C-7) 相关，δH 7.63 (1H, brs, H-4) 与 δC
170.7 (C-8)/115.5 (C-6)/153.3 (C-7a) 相关，通过主要
的 HMBC 相关（图 1）确定了化合物的平面结构与
文 献 报 道 中 的 2,3-dihydro-2-(4-hydroxy-3,5-
dimethoxyphenyl)-3-(hydroxymethyl)-7-methoxy-5-
benzofurancarboxylic acid 相一致[7]。通过偶合常数
(J2,3 = 6.3 Hz) 判断化合物8的H-2与H-3处于反式[8]。
化合物 8 的 CD 谱中，220 (Δ−6.21) 显示负的 Cotton
效应，与文献进行对比[9]，确定化合物 8 的绝对
构型为 7S,8R。对所有的碳氢信号进行了归属（表
1），最终确定化合物的结构，命名为 5′-甲氧基肥
牛木素。
化合物 1：淡黄色无定型粉末，ESI-MS m/z: 485
[M＋Na]+, 507 [M＋HCOO−]−，HR-ESI-Q-TOF-MS
给出 m/z 463.217 0 [M＋H]+（计算值为 463.217 9），
O
HO
OCH3
O
OH
OCH3
OH
OCH3
1
35
7
4
3a
1′
3′
5′7a
8
9

图 1 化合物 8 的主要 HMBC 相关
Fig. 1 Key HMBC correlations of compound 8
表 1 化合物 8 的 NMR 数据
Table 1 NMR data of compound 8
碳位 δC δH DEPT
1 — —
2 90.3 5.64 (d, J = 6.3 Hz) CH
3 54.8 3.58 (m) CH
4 120.7 7.63 (brs) CH
5 125.3 —
6 115.5 7.59 (brs) CH
7 145.1 —
8 170.0 —
9 64.7 3.86 (m) CH2
3a 130.2 —
7a 153.6 —
1′ 133.3
2′ 104.3 6.69 (s) CH
3′ 149.5
4′ 136.6
5′ 149.5
6′ 104.3 6.69 (s) CH
3′-OCH3 56.8 3.83 (s) CH3
5′-OCH3 56.8 3.83 (s) CH3
7-OCH3 56.7 3.92 (s) CH3

确定化合物分子式为 C21H34O11，不饱和度为 5。
1H-NMR (300 MHz, CD3OD) δ: 0.93 (3H, d, J = 6.6
Hz, 10-OCH3), 1.13 (1H, m, H-7), 1.56 (1H, m, H-7),
1.37 (1H, m, H-5), 1.66 (1H, m, H-5), 1.64 (1H,m,
H-6), 1.81 (3H, brs, 9-OCH3), 2.39 (1H, m, H-4), 2.01
(1H, m, H-4), 1.60 (1H, m, H-7)，1.14 (1H, m, H-7),
6.92 (1H, ddd, J = 8.1, 6.0, 4.8 Hz, H-3)；13C-NMR
(75 MHz, CD3OD) δ: 169.6 (C-1), 128.1 (C-2), 145.5
(C-3), 26.9 (C-4), 37.2 (C-5), 30.7 (C-6), 34.6 (C-7),
67.6 (C-8), 12.1 (C-9), 20.7 (C-10), 103.2 (C-1′), 75.1
(C-2′), 78.1 (C-3′), 71.1 (C-4′), 76.0 (C-5′), 63.8
(C-6′), 104.4 (C-1″), 73.3 (C-2″), 72.5 (C-3″), 72.4
(C-4″), 68.6 (C-5″)。以上数据与文献报道一致[10]，
故鉴定化合物 1 为 (2E,6S)-8-[α-L-arabinopyranosyl-
(1″-6′)-β-D-glucopyranosyloxy]-2,6-dimethylct-2-eno-
1,2″-lactone。
化合物 2：白色固体粉末，ESI-MS m/z: 443 [M＋
Na]+, 419 [M－H]−，相对分子质量为 420。结合
1H-NMR 和 13C-NMR 数据确定分子式为 C22H28O8，
不饱和度为 9。1H-NMR (300 MHz, CD3OD) δ: 6.38
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(2H, s, H-2, 6), 6.58 (1H, brs, H-2′), 4.31 (1H, d, J =
5.7 Hz, H-7), 3.86 (3H, s, 3′-OCH3), 3.74 (6H, s, 3,
5-OCH3), 3.37 (3H, s, 5′-OCH3), 3.59 (1H, m, H-9′),
3.51 (1H, o, H-9′), 3.49 (1H, m, H-9), 3.46 (1H, m,
H-9), 2.71 (1H, dd, J = 15.3, 5.1 Hz, H-7′), 2.52 (1H,
dd, J = 15.7, 11.4 Hz, H-7′), 1.97 (1H, m, H-8′), 1.63
(1H, m, H-8)；13C-NMR (75 MHz, CD3OD) δ: 138.9
(C-1), 106.8 (C-2, 6), 149.0 (C-3, 5), 134.5 (C-4), 48.9
(C-7), 42.3 (C-8), 64.1 (C-9), 130.1 (C-1′), 107.7
(C-2′), 148.6 (C-3′), 138.9 (C-4′), 147.7 (C-5′), 126.2
(C-6′), 33.8 (C-7′), 40.9 (C-8′), 66.2 (C-9′), 56.7 (3,
5-OCH3), 56.6 (3′-OCH3), 60.1 (5′-OCH3)。以上数据
与文献报道一致[11]，故鉴定化合物 2 为落叶脂素。
化合物 3：白色固体粉末，ESI-MS m/z: 413 [M＋
Na]+, 389 [M－H]−，相对分子质量为 390。结合
1H-NMR 和 13C-NMR 数据确定分子式为 C21H26O7，
不饱和度为 9。1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 6.42
(2H, s, H-2, 6), 6.65 (1H, s, H-2′), 6.20 (1H, s, H-5′),
3.81 (1H, m, H-7), 3.80 (3H, s, 3′-OCH3), 3.77 (6H, s,
3, 5-OCH3), 3.63 (2H, d, J = 3.5 Hz, H-9′), 3.40 (1H,
dd, J = 11.3, 4.0 Hz, H-9), 3.67 (1H, m, H-9), 2.78
(2H, d, J = 7.7 Hz, H-7′), 1.99 (1H, m, H-8′), 1.79
(1H, m, H-8)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD) δ: 137.8
(C-1), 107.8 (C-2, 6), 149.3 (C-3, 5), 135.0 (C-4), 48.6
(C-7), 47.9 (C-8), 62.3 (C-9), 129.0 (C-1′), 112.4
(C-2′), 147.3 (C-3′), 145.3 (C-4′), 117.3 (C-5′), 134.0
(C-6′), 33.6 (C-7′), 39.9 (C-8′), 65.9 (C-9′), 56.8 (3,
5-OCH3), 56.4 (3′-OCH3)。以上数据与文献报道一
致[12]，故鉴定化合物 3 为 5′-甲氧基异落叶脂素。
化合物 4：白色固体粉末，ESI-MS m/z: 383 [M＋
Na]+, 359 [M－H]−，相对分子质量为 360。结合
1H-NMR 和 13C-NMR 数据确定分子式为 C20H24O6，
不饱和度为 9。1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 6.67
(1H, d, J = 1.8 Hz, H-2), 6.73 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5),
6.60 (1H, dd, J = 8.0, 1.8 Hz, H-6), 6.65 (1H, s, H-2′),
6.17 (1H, s, H-5′), 3.80 (1H, m, H-7), 3.80 (3H, s,
3′-OCH3), 3.77 (3H, s, 3-OCH3), 3.66 (2H, m, H-9′),
3.39 (1H, dd, J = 11.3, 4.0 Hz, H-9), 3.68 (1H, m,
H-9), 2.77 (2H, d, J = 7.8 Hz, H-7′), 1.99 (1H, m,
H-8′), 1.75 (1H, m, H-8)； 13C-NMR (100 MHz,
CD3OD) δ: 138.6 (C-1), 113.8 (C-2), 149.0 (C-3),
145.9 (C-4), 116.0 (C-5), 123.2 (C-6), 48.0 (C-7), 48.1
(C-8), 62.2 (C-9), 129.0 (C-1′), 112.4 (C-2′), 147.2
(C-3′), 145.3 (C-4′), 117.4 (C-5′), 134.2 (C-6′), 33.6
(C-7′), 40.0 (C-8′), 65.9 (C-9′), 56.4 (3-OCH3), 56.3
(3′-OCH3)。以上数据与文献报道一致[13]，故鉴定化
合物 4 为异落叶脂素。
化合物 5：白色固体粉末，ESI-MS m/z: 401 [M＋
Na]+, 377 [M－H]−，提示相对分子质量为 378。结合
1H-NMR 和 13C-NMR 数据确定分子式为 C20H26O7，
不饱和度为 8。1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 7.01
(1H, d, J = 2.0 Hz, H-2), 6.75 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5),
6.85 (1H, dd, J = 2.0, 8.0 Hz, H-6), 6.84 (1H, d, J = 2.0
Hz, H-2′), 6.96 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5′), 6.70 (1H, dd,
J = 2.0, 8.0 Hz, H-6′), 4.86 (1H, d, J = 4.0 Hz, H-7), 4.52
(1H, brs, H-8), 3.70 (1H, dd, J = 12.0, 4.2 Hz, H-9), 3.45
(1H, dd, J = 12.0, 5.6 Hz, H-9), 2.62 (2H, t, J = 7.8 Hz,
H-7′), 1.80 (2H, m, H-8′), 3.55 (2H, t, J = 6.4 Hz, H-9′),
3.81 (3H, s, 3-OCH3), 3.85 (3H, s, 3′-OCH3)；13C-NMR
(100 MHz, CD3OD) δ: 133.8 (C-1), 111.8 (C-2), 148.9
(C-3), 147.6 (C-4), 115.9 (C-5), 120.8 (C-6), 74.2 (C-7),
87.8 (C-8), 61.9 (C-9), 138.3 (C-1′), 114.0 (C-2′), 151.7
(C-3′), 147.2 (C-4′), 119.2 (C-5′), 122.1 (C-6′), 32.7
(C-7′), 35.5 (C-8′), 62.2 (C-9′), 56.4 (3-OCH3), 56.6
(3′-OCH3)。以上数据与文献报道一致[14]，故鉴定化合
物 5 为 (7R,8R)-4,7,9,9′-tetrahydroxy-3,3′-dimethoxy-8-
O-4′-neolignan。
化合物 6：白色固体粉末，ESI-MS m/z: 401 [M＋
Na]+, 377 [M－H]−，提示相对分子质量为 378。结
合 1H-NMR 和 13C-NMR 数据确定分子式为
C20H26O7，不饱和度为 8。1H-NMR (300 MHz, CD3OD)
δ: 7.00 (1H, d, J = 1.8 Hz, H-2), 6.73 (1H, d, J = 8.1
Hz, H-5), 6.83 (1H, dd, J = 1.8, 8.1 Hz, H-6), 6.70
(1H, d, J = 2.0 Hz, H-2′), 6.81 (1H, d, J = 8.4 Hz
H-5′), 6.66 (1H, dd, J = 2.0, 8.4 Hz, H-6′), 4.82 (1H, d,
J = 8.0 Hz, H-7), 4.28 (1H, m, H-8), 3.84 (1H, dd, J =
12.0, 6.0 Hz, H-9), 3.74 (1H, dd, J = 12.0, 3.6 Hz,
H-9), 2.60 (2H, m, H-7′), 1.79 (2H, m, H-8′), 3.55
(2H, t, J = 6.5 Hz, H-9′), 3.78 (3H, s, 3-OCH3), 3.80
(3H, s, 3′-OCH3)；13C-NMR (75 MHz, CD3OD) δ:
134.2 (C-1), 111.8 (C-2), 148.7 (C-3), 147.0 (C-4),
115.7 (C-5), 121.0 (C-6), 74.1 (C-7), 86.7 (C-8), 62.2
(C-9), 138.1 (C-1′), 114.0 (C-2′), 151.9 (C-3′), 147.2
(C-4′), 119.7 (C-5′), 121.9 (C-6′), 32.7 (C-7′), 35.6
(C-8′), 62.2 (C-9′), 56.3 (3-OCH3), 56.5 (3′-OCH3)。以
上数据与文献报道一致 [14]，故鉴定化合物 6 为
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 10 期 2016 年 5 月

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(7S,8R)-4,7,9,9′-tetrahydroxy-3,3′-dimethoxy-8-O-4′-
neolignan。
化合物 7：黄色无定形粉末，ESI-MS m/z: 347
[M＋H]+, 345 [M－H]−，提示相对分子质量为 346。
结合 1H-NMR 和 13C-NMR 数据确定分子式为
C18H18O7，不饱和度为 10。1H-NMR (400 MHz,
CD3OD) δ: 7.62 (1H, s, H-6′), 7.59 (1H, brs, H-2′),
6.94 (1H, d, J = 1.2 Hz, H-2), 6.77 (1H, d, J = 8.2 Hz,
H-5), 6.82 (1H, dd, J = 8.2, 1.2 Hz, H-5′), 5.61 (1H, d,
J = 6.4 Hz, H-7), 3.55 (1H, m, H-8), 3.83 (2H, m,
H-9), 3.81 (3H, s, 3-OCH3), 3.88 (3H, s, 3′-OCH3)；
13C-NMR (100 MHz, CD3OD) δ: 134.0 (C-1), 110.7
(C-2), 149.2 (C-3), 147.8 (C-4), 116.3 (C-5), 119.8
(C-6), 90.2 (C-7), 54.6 (C-8), 64.6 (C-9), 125.7 (C-1′),
115.4 (C-2′), 145.2 (C-3′), 153.8 (C-4′), 130.4 (C-5′),
120.8 (C-6′), 170.6 (C-7′), 56.4 (3-OCH3), 56.7
(3′-OCH3)。以上数据与文献报道一致[15]，故鉴定化
合物 7 为肥牛木素。
化合物 9：白色固体粉末，ESI-MS m/z: 383 [M＋
Na]+, 359 [M－H]−，提示相对分子质量为 360。结
合 1H-NMR 和 13C-NMR 数据确定分子式为
C20H24O6，不饱和度为 9。 1H-NMR (300 MHz,
CD3OD) δ: 6.95 (2H, d, J = 1.8 Hz, H-2), 6.76 (1H, d,
J = 8.1 Hz, H-5), 6.83 (1H, dd, J = 8.1, 1.8 Hz, H-6),
6.73 (2H, brs, H-2′, 6′), 5.49 (1H, d, J = 6.3 Hz, H-7),
3.48 (1H, dd, J = 12.3, 6.2 Hz, H-8), 3.82 (1H, o,
H-9), 3.75 (1H, dd, J = 7.1, 11.1 Hz, H-9), 2.63 (2H, t,
J = 7.8 Hz, H-7′), 1.82 (2H, m, H-8′), 3.57 (2H, t, J =
6.5 Hz, H-9′), 3.81 (3H, s, 3-OCH3), 3.85 (3H, s,
3′-OCH3)；13C-NMR (75 MHz, CD3OD) δ: 134.2
(C-1), 110.5 (C-2), 149.1 (C-3), 147.5 (C-4), 116.1
(C-5), 119.7 (C-6), 89.0 (C-7), 55.5 (C-8), 65.0 (C-9),
129.9 (C-1′), 114.0 (C-2′), 145.2 (C-3′), 147.5 (C-4′),
130.9 (C-5′), 117.9 (C-6′), 32.9 (C-7′), 35.8 (C-8′),
62.2 (C-9′) 56.3 (3-OCH3), 56.7 (3′-OCH3)。以上数据
与文献报道一致[16]，故鉴定化合物 9 为 (−)-二氢脱
氢二松柏醇。
化合物 10：白色固体粉末，ESI-MS m/z: 413 [M＋
Na]+, 389 [M－H]−，提示相对分子质量为 390。结
合 1H-NMR 和 13C-NMR 数据确定分子式为
C21H26O7，不饱和度为 9。 1H-NMR (400 MHz,
CD3OD) δ: 6.68 (2H, brs, H-2, 6), 6.73 (2H, s, H-2′,
6′), 5.50 (1H, d, J = 6.3 Hz, H-7), 3.57 (1H, overlap,
H-8), 3.84 (2H, m, H-9), 2.63 (2H, t, J = 7.8 Hz, H-7′),
1.82 (2H, m, H-8′), 3.57 (2H, t, J = 6.5 Hz, H-9′), 3.81
(6H, s, 3, 5-OCH3), 3.86 (3H, s, 3′-OCH3)；13C-NMR
(75 MHz, CD3OD) δ: 134.1 (C-1), 104.2 (C-2, 6),
149.3 (C-3, 5), 137.0 (C-4), 89.1 (C-7), 55.6 (C-8),
65.0 (C-9), 136.4 (C-1′), 114.1 (C-2′), 145.2 (C-3′),
147.5 (C-4′), 129.8 (C-5′), 117.9 (C-6′), 32.9 (C-7′),
35.8 (C-8′), 62.2 (C-9′) 56.7 (3, 5-OCH3), 56.8
(3′-OCH3)。以上数据与文献报道一致[17]，故鉴定化
合物 10 为 (7S,8R)-3,3′,5-trimethoxy-4′,7-epoxy-8,5′-
neolignan-4,9,9′-triol。
化合物 11：黄色无定形粉末，ESI-MS m/z: 265
[M＋H]+, 263 [M－H]−，提示相对分子质量为 264。
HR-ESI-Q-TOF-MS给出m/z 287.127 2 [M＋Na]+（计
算值为 287.125 9），确定化合物分子式为 C15H20O4，
不饱和度为 6。1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 5.90
(1H, s, H-3′), 2.53 (1H, d, J = 15.7 Hz, H-5′), 2.16
(1H, d, J = 15.7 Hz, H-5′), 1.00 (3H, s, 6′-CH3), 1.05
(3H, s, 6′-CH3), 2.25 (3H, s, 2′-CH3), 6.24 (1H, d, J =
16.0 Hz, H-5), 6.46 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-4), 5.83
(1H, brs, H-2), 1.90 (3H, d, J = 1.2 Hz, 3-CH3)；
13C-NMR (100 MHz, CD3OD) δ: 200.9 (C-4′), 127.4
(C-3′), 166.3 (C-2′), 80.3 (C-1′), 42.8 (C-6′), 50.7
(C-5′), 24.7 (5′-CH3), 23.6 (5′-CH3), 14.2 (2′-CH3),
136.6 (C-5), 135.3 (C-4), 151.7 (C-3), 122.0 (C-2), 169.0
(C-1), 19.4 (3-CH3)。以上数据与文献报道一致[18]，故
鉴定化合物 11 为 2-顺式-4-反式-脱落酸。
化合物 12：黄色无定形粉末，ESI-MS m/z: 265
[M＋H]+, 263 [M－H]−，提示相对分子质量为 264。
HR-ESI-Q-TOF-MS给出m/z 287.127 2 [M＋Na]+（计
算值为 287.125 9），确定化合物分子式为 C15H20O4，
不饱和度为 6。1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 5.92
(1H, brs, H-3′), 2.53 (1H, d, J = 16.9 Hz, H-5′), 2.18
(1H, d, J = 16.9 Hz, H-5′), 1.03 (3H, s, 6′-CH3), 1.06
(3H, s, 6′-CH3), 1.92 (3H, d, J = 0.8 Hz, 3-CH3), 6.22
(1H, d, J = 16.3 Hz, H-5), 7.76 (1H, d, J = 16.0 Hz,
H-4), 5.74 (1H, brs, H-2), 2.04 (3H, s, 3-CH3)；
13C-NMR (100 MHz, CD3OD) δ: 201.0 (C-4′), 127.5
(C-3′), 166.5 (C-2′), 80.6 (C-1′), 42.8 (C-6′), 50.6
(C-5′), 24.6 (5′-CH3), 23.6 (5′-CH3), 19.6 (2′-CH3),
137.8 (C-5), 129.4 (C-4), 150.8 (C-3), 119.8 (C-2), 168.0
(C-1), 21.2 (3-CH3)。以上数据与文献报道一致[18]，故
鉴定化合物 12 为 2-反式-4-反式-脱落酸。
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 10 期 2016 年 5 月

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化合物 13：白色无定形粉末，ESI-MS m/z: 227
[M＋H]+, 225 [M－H]−，提示相对分子质量为 226。
HR-ESI-Q-TOF-MS给出m/z 249.073 7 [M＋Na]+（计
算值为 249.073 9），确定化合物分子式为 C11H14O5，
不饱和度为 5。1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 5.04
(1H, overlap, H-1), 5.48 (1H, t, J = 1.8 Hz, H-3), 3.60
(1H, m, H-4), 2.68 (1H, m, H-5), 2.19 (1H, d, J = 13.4
Hz, H-6), 2.04 (1H, d, J = 13.4 Hz, H-6), 5.04 (1H, t,
J = 1.6 Hz, H-7), 6.07 (1H, ddd, J = 7.1, 10.6, 17.6
Hz, H-8), 2.81 (1H, brd, J = 7.0 Hz, H-9), 5.29 (1H,
m, H-10), 3.73 (3H, s, 11-OCH3)；13C-NMR (100
MHz, CD3OD) δ: 96.3 (C-1), 94.0 (C-3), 48.9 (C-4),
31.5 (C-5), 26.8 (C-6), 94.7 (C-7), 137.2 (C-8), 47.0
(C-9), 118.3 (C-10), 171.8 (C-11), 52.5 (11-OCH3)。以
上数据与文献报道一致[19]，故鉴定化合物 13 为
(1S,3R,4R,5S,7R,9R)-decane-6-carboxylic acid。
化合物 14：白色无定形粉末，ESI-MS m/z: 227
[M＋H]+, 225 [M－H]−，提示相对分子质量为 226。
HR-ESI-Q-TOF-MS给出m/z 249.073 7 [M＋Na]+（计
算值为 249.073 9），确定化合物分子式为 C11H14O5，
不饱和度为 5。1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 4.97
(1H, brs, H-1), 5.13 (1H, m, H-3), 3.23 (1H, t, J = 2.1
Hz, H-4), 2.70 (1H, brs, H-5), 1.95 (1H, brd, J = 15.0
Hz, H-6), 2.44 (1H, m, H-6), 5.50 (1H, t, J = 1.8 Hz,
H-7), 6.02 (1H, ddd, J = 7.0, 10.7, 17.6 Hz, H-8), 2.83
(1H, d, J = 7.3 Hz, H-9), 5.25 (1H, m, H-10), 3.75
(3H, s, 11-OCH3)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD) δ:
96.8 (C-1), 94.1 (C-3), 48.7 (C-4), 31.7 (C-5), 30.6
(C-6), 94.0 (C-7), 137.4 (C-8), 43.0 (C-9), 118.1
(C-10), 172.0 (C-11), 52.5 (11-OCH3)。以上数据与文
献报道一致[19]，故鉴定化合物 14 为 (1S,3R,4S,5S,
7R,9R)-decane-6-carboxylic acid。
4 化合物体外抗登革热病毒的活性评价
4.1 化合物的细胞毒性检测
实验采用 AlamarBlue®（Invitrogen）试剂盒检
测化合物对细胞的毒性作用。单体化合物的最高毒
性测试浓度均为 500 μmol/mL。
AlamarBlue®是一种氧化还原指示剂，能根据代
谢活性产生吸光度变化和荧光信号。AlamarBlue®
易溶于水，其氧化形式进入细胞后经线粒体酶还原
产生可测量的荧光及颜色变化，用于细胞活性和细
胞增殖的定量分析以及体外细胞毒性研究。这种测
定是基于具有代谢活性的细胞将试剂转换成荧光和
比色指示剂的能力，受损和无活性细胞具有较低的
天然代谢活性，对应的信号较低。因此荧光信号强
弱可以反映细胞活性的高低。
细胞活性＝(样品孔荧光值－空白对照孔荧光值)/(细胞
对照孔荧光值－空白对照孔荧光值)
将单体化合物从起始浓度 80 μmol/L 连续 3 倍
稀释 6 个梯度。加药培养后，光镜下观察药物引起
的 BHK 细胞病变效应（CPE），加入 AlamarBlue®，
37 ℃孵育 2 h，荧光检测 AlamarBlue®的还原情况，
激发光 570 nm，发射光 595 nm。实验结果见表 1。
表 1 化合物体外抗登革热病毒活性
Table 1 Anti-Dengue virus activity of isolated compounds
in vitro
化合物 CC50/(μmol·L−1) EC50/(μmol·L−1) SI
1 ＞80 74.76 ＞1.07
2 ＞80 ＞80 —
3 ＞80 ＞80 —
4 ＞80 ＞80 —
5 ＞80 ＞80 —
6 ＞80 ＞80 —
7 ＞80 ＞80 —
8 ＞80 ＞80 —
9 ＞80 ＞80 —
10 ＞80 ＞80 —
11 ＞80 ＞80 —
12 ＞80 ＞80 —
13 ＞80 ＞80 —
14 ＞80 ＞80 —
CC50：使 50%细胞发生病变时的药物浓度；EC50：指能够有效抑
制 50%细胞感染病毒的药物浓度；SI：选择指数，SI = CC50/EC50；
“—”：无 SI
CC50: the median lethal dose of a substance, or the amount required
to kill 50% of a given test population; EC50: the molar concentration
of an agonist, which produces 50% of the maximum possible response for
that agonist; SI (selected index) = CC50/EC50; “—”: no selected index
4.2 用报告病毒评估化合物抗登革热病毒的活性
实验原理：含 Rluc（海肾荧光素酶）报告基因
的登革热病毒感染细胞后，Rluc 随着病毒的复制得
以表达，Rluc 报告基因的表达水平可以反映登革热
病毒感染水平[20]。实验步骤：（1）细胞铺板：BHK
细胞接种于 96 孔细胞培养板中，待细胞贴壁后备
用；（2）加药处理：将单体化合物从起始浓度 80
μmol/L 连续 3 倍梯度稀释 6 个梯度。待细胞长成单
层后加入 100 μL 含 2 倍药物的 DMEM 培养液，然
后加入 100 μL DMEM 稀释的登革热报告病毒，37
℃培养；（3）活性检测：病毒感染后继续培养 48 h
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47 卷 第 10 期 2016 年 5 月

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后，用 Luciferase Assay Kit 检测 Rluc 读值。实验设
药物组、病毒对照组（病毒感染后未加药物）、细胞
对照组（无病毒感染）。
抑制率＝1－(药物组－细胞对照组)/(病毒对照组－细
胞对照组)
实验结果在检测浓度下，这些化合物对 BHK
细胞没有明显的细胞毒性，所测试的 CC50 值大于被
测试的最高浓度，且在光学显微镜下看不到明显的
细胞病变，其中化合物 1 具有抗登革热病毒的活性，
其 EC50 值为 74.76 μmol/L，SI 值大于 1.07，其余化
合物均未检测到抗登革热病毒的活性。
5 讨论
在前期研究的基础上，本研究继续采用活性成
分追踪分离的研究思路，从热毒宁注射液抗病毒活
性部位（经 HP-20 大孔吸附树脂，95%乙醇洗脱部
位）中分离并鉴定了 14 个化合物，其中化合物 8
为新化合物，于洋等[11]从中药栀子中分离得到结构
类似的木脂素类化合物，推测化合物 8 可能来源于
栀子，而非生产工艺过程中产生，其余 13 个化合物
均为首次从热毒宁注射液中分离得到。通过采用检
测 Rluc 报告基因的表达水平来反映病毒感染水平
的方法，对分离得到的化合物进行了体外抗登革热
病毒的活性测试，发现化合物 1 对登革热病毒的
EC50 值为 74.76 μmol/L，SI 值大于 1.07，具有体外
抗登革热病毒的活性。本研究丰富了热毒宁注射液
的化学成分，为全面揭示热毒宁注射液抗病毒临床
功效的科学内涵提供一定依据，以期使热毒宁注射
液的物质组成谱与功效谱相关联，建立与功效相关
联的质量控制方法。
志谢：中国科学院武汉病毒所陈绪林教授课题
组帮助测试单体化合物的体外活性评价工作；暨南
大学药学院中药及天然药物研究所帮助完成核磁和
质谱的测试工作。
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