全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 10 期 2012 年 10 月

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• 药剂与工艺 •
正交试验设计优选九节龙皂苷 I 聚乳酸微球的制备工艺
程江雪 1, 2，王 荣 1，王晓娟 1*，严筱楠 1，唐志书 2
1. 第四军医大学口腔医院 药剂科，陕西 西安 710032
2. 陕西中医学院，陕西 咸阳 712046
摘 要：目的 筛选溶剂蒸发法制备九节龙皂苷 I 聚乳酸微球（ADS-I-PLA-MS）最佳工艺。方法 采用 HPLC-ELSD 测定
方法，以包封率和载药量为评价指标，W/O/W 溶剂蒸发法制备微球；通过单因素和正交试验设计，考察内水相九节龙皂苷
I（ADS-I）甲醇溶液的质量浓度、ADS-I 甲醇溶液与聚乳酸（PLA）二氯甲烷溶液体积比、PLA 二氯甲烷溶液质量浓度和聚
乙烯醇（PVA）体积等因素对 ADS-I-PLA-MS 包封率及载药量的影响。结果 溶剂蒸发法制备 ADS-I-PLA-MS 的最佳工艺
条件为 ADS-I 甲醇溶液质量浓度为 8 mg/mL、ADS-I 甲醇溶液与 PLA 二氯甲烷溶液体积比为 1∶13、PLA 二氯甲烷溶液质
量浓度为 90 mg/mL、PVA 体积为 500 mL。结论 优选出的 ADS-I-PLA-MS 制备工艺合理可行。
关键词：九节龙皂苷 I；聚乳酸；微球；HPLC-ELSD；正交设计
中图分类号：R283.6 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2012)10 - 1923 - 05
Optimization on preparation technology of ardipusilloside-I polylactic acid
microspheres by orthogonal design
CHENG Jiang-xue1, 2, WANG Rong1, WANG Xiao-juan1, YAN Xiao-nan1, TANG Zhi-shu2
1. Department of Pharmacy, Stomatology Hospital, the Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, China
2. Shaanxi College of Traditional Chinese Medicine, Xianyang 712046, China
Abstract: Objective To select the optimum conditions for the preparation of ardipusilloside-I polylactic acid microspheres (ADS-I-
PLA-MS) by solvent evaporation method. Methods HPLC-ELSD was used for the evaluation with encapsulation efficiency (EE)
and drug loading as indexes. Microspheres were prepared using W/O/W evaporation method. Through single factor and orthogonal
tests, the effects of the concentration of inner-water ADS-I methanol solution, volume ratio of ADS-I methanol solution-PLA
methylene chloride solution, concentration of PLA methylene chloride solution, and the volume of polyvinyl alcohol (PVA) on EE
and drug loading were investigated. Results The optimum conditions for the preparation of ADS-I-PLA-MS were as follows: the
concentration of ADS-I methanol solution 8 mg/mL, the volume ratio of ADS-I methanol solution-PLA methylene chloride solution
1∶13, the concentration of PLA methylene chloride solution 90 mg/mL, and the volume of PVA 500 mL. Conclusion This
optimized ADS-I-PLA-MS preparation technology is reasonable and feasible.
Key words: ardipusilloside-I (ADS-I); polylactic acid (PLA); microsphere; HPLC-ELSD; orthogonal design

九节龙 Ardisia pusilla A. DC. 为紫金牛科紫金
牛属植物，药用全草，主要含三萜皂苷，九节龙皂
苷 I（ardipusilloside I，ADS-I）可作为其标识性成
分。ADS-I 对人脑胶质瘤细胞 U87[1]和 SHG-44[2]具
有明显的抑制作用，可引起胶质瘤细胞凋亡，且不
影响脑内正常胶质细胞，具有广阔的开发前景。
ADS-I 的动物实验表明，po 给药后肠内仅能检测到
2 种代谢产物，却无原形药物；静脉给药后肠内既
检测不到任何代谢产物，也检测不到原形药物[3]。
而原位给药方式可使药物直接作用于病灶部位，减
少系统化疗引起的不良反应，提高药物疗效[4]。若
将 ADS-I 制备成可植入缓释剂型，绕过血脑屏障，

收稿日期：2012-03-16
基金项目：国家自然科学基金面上项目（30973952）；陕西省资源主导型产业关键技术（链）项目（2011KTCL03-01）
作者简介：程江雪，女，在读研究生，研究方向为中药新剂型新工艺的应用研究。Tel: (029)84773998 E-mail: xueling_jiaojiao@126.com
*通讯作者 王晓娟 Tel: (029)84776189 E-mail: WXJYH231@fmmu.edu.cn
网络出版时间：2012-07-18 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/12.1108.R.20120718.1658.001.html
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直接作用于颅脑肿瘤部位，则可大大提高其生物利
用率。本实验首先通过 ADS-I 与辅料的相互作用试
验，单因素和正交试验设计，优选 ADS-I 聚乳酸微
球（ADS-I-PLA-MS）[5]的制备工艺，为将 ADS-I 制
备成可植入缓释剂型奠定基础。
1 仪器与材料
Waters 2695 色谱仪、Alltech ELSD 2000ES 型
蒸发光散射检测器（美国 Alltech 公司），DL—720
超声仪（浙江石浦海天电子仪器厂），BT125D 十万
分之一电子天平（Sartorius 公司），FJ—200 高速分
散均质机（上海标本模型厂），LD5—10 型低速离
心机（北京医用离心机厂），101—2 型电热鼓风干
燥箱（北京科伟永兴仪器有限公司），WD—A 药物
稳定仪（天津市药典标准仪器厂）。
ADS-I（药粉，批号 111028，质量分数大于 99%，
实验室自制），聚乳酸（PLA，济南岱罡生物科技有
限公司），聚乙烯醇（PVA，17-88，中国医药集团
上海化学试剂公司），氯化钠（NaCl，分析纯，郑
州派尼化学试剂厂），二氯甲烷（分析纯，天津市福
晨化学试剂厂）；甲醇（色谱纯，美国 Fisher 公司）；
水蒸水（实验室自制）。
2 方法与结果
2.1 ADS-I-PLA-MS 的制备
采用传统复乳化溶剂蒸发法（也称液中干燥法）
制备。精密称取一定量 PLA 溶于适量二氯甲烷中，
超声使之充分溶解成一定质量浓度。精密移取一定
量的 ADS-I 甲醇溶液，使 ADS-I 甲醇溶液与 PLA
二氯甲烷溶液形成一定比例，且二者体积之和约 4.5
mL，超声分散 60 s。快速磁力搅拌下加入高速分散
均质机搅拌中的含有 0.5% PVA 的 1% NaCl 水溶液
中，分散 15 min 后，将混悬液在 60 ℃下快速磁力
搅拌蒸发有机溶剂。将挥干有机溶剂的混悬液在
2 500 r/min 转速下离心 10 min 后抽滤，水洗 3 次，
真空干燥 3 d，即得 ADS-I-PLA-MS。
2.2 ADS-I 定量测定方法的建立
2.2.1 色谱条件 色谱柱为 Welch materials INC
C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇-
水（75∶25），体积流量 1.0 mL/min，检测器漂移管
温度 82 ℃，载气（压缩空气）体积流量 2.0 L/min。
2.2.2 ADS-I 对照品溶液的配制 称取 ADS-I 对照
品 12.53 mg 置 50 mL 量瓶中，甲醇超声溶解，定容
至 50 mL，即得 250.6 μg/mL ADS-I 对照品溶液。
2.2.3 样品的处理 精密称取约 100 mg ADS-I-
PLA-MS，溶于 3 mL 二氯甲烷中，超声 15 min，使
PLA 充分溶解后，加 5 mL 甲醇，混合均匀，使 PLA
沉淀，2 500 r/min 转速下离心 10 min，滤过，甲醇
洗涤，完全蒸发续滤液中溶剂，向其中加入甲醇，
定容至 5 mL 量瓶中；过 0.45 μm 微孔滤膜，取续滤
液，即得。按照“2.2.1”项下色谱条件进行 HPLC-
ELSD 测定。
2.2.4 线性关系考察 分别用 0.45 μm 微孔滤膜滤
过“2.2.2”项下所配对照品溶液，按照“2.2.1”项
下色谱条件，将对照品溶液进行 HPLC-ELSD 测定，
进样量分别为 4、6、8、10、20 μL，以峰面积积分
值的自然对数为纵坐标（Y），其对应进样质量的自
然对数为横坐标（X），进行线性回归，得回归方程
Y＝1.311 6 X＋5.897 2，r＝0.999 9，结果表明 ADS-I
在 1.00～5.01 μg 线性关系良好。
2.2.5 专属性试验 按照“2.2.1”项下色谱条件，
将 ADS-I 空白对照溶液、ADS-I 对照品溶液和 ADS-
I-PLA-MS 样品进行测定，考察色谱情况。结果在
本色谱条件下，ADS-I 具有良好的吸收，对照无干
扰，基线噪音小，色谱图见图 1。
2.2.6 精密度试验 精密吸取 250.6 μg/mL 对照品
溶液 8 μL 重复进样 6 次，按上述色谱条件测定，计
算得 ADS-I 峰面积的 RSD 为 1.1%。
2.2.7 稳定性试验 按照“2.1”项下制备方法制备
1 批载药微球，按照“2.2.3”项下样品处理方法处



*ADS-I

图 1 ADS-I 空白 (A)、ADS-I 对照品 (B) 和 ADS-I-PLA-MS 样品 (C) 的 HPLC-ELSD 色谱图
FIg. 1 HPLC-ELSD chromatograms of ADS-I blank (A), ADS-I reference substance (B), and ADS-I-PLA-MS sample (C)
0 4 8 0 4 8 0 4 8
t / min
A B C
* *
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理样品后，精密吸取此样品溶液，分别在 0、2、4、
6、8、10 h 进样测定，进样量为 30 μL，计算得 ADS-I
峰面积的 RSD 为 1.2%，结果表明供试品溶液在 10
h 内稳定性良好。
2.2.8 重复性试验 精密称取同 1 批 ADS-I-PLA-
MS 6 份，每份约 50 mg，按照“2.2.3”项下样品处
理方法处理后，进样 30 μL 进行测定，以外标两点
法计算样品中 ADS-I 质量分数的 RSD 为 3.5%。
2.2.9 回收率试验 称取已测定载药量的 ADS-I-
PLA-MS（ADS-I 为 0.62%）6 份，每份 50 mg，分
别加入 ADS-I 对照品 2.00 mg，按照“2.2.3”项下
样品处理方法处理后，进样 10 μL 进行测定，根据
回归方程计算 ADS-I 的回收率，结果平均回收率为
99.20%，RSD 为 1.9%。
2.3 ADS-I 与 PLA、PVA 及 NaCl 的相互作用试验
2.3.1 高温加速试验 取 ADS-I 粉末分别与 PLA、
PVA 按一定比例混合均匀；取 ADS-I 甲醇溶液与
PLA 二氯甲烷溶液、PVA 水溶液、NaCl 水溶液按
一定质量比混合均匀；置恒温烘箱内 60 ℃下放置
10 d，于第 10 天取样，观察样品外观、质量的变化。
结果见表 1。
2.3.2 高湿加速试验 取 ADS-I 粉末分别与 PLA、
PVA 按一定比例混合均匀，置称量瓶内摊成厚度≤
10 mm，敞口；取 ADS-I 甲醇溶液与 PLA 二氯甲烷
溶液、PVA 水溶液、NaCl 水溶液按一定质量比混合
均匀；置相对湿度为 92.5%的恒湿干燥器内，室温
（25 ℃）下放置 10 d，于第 10 天取样，观察样品外
观、质量的变化。结果见表 1。
2.3.3 强光照射加速试验 取 ADS-I 粉末分别与
PLA、PVA 按一定比例混合均匀，置称量瓶内摊成
厚度≤10 mm，敞口；取 ADS-I 甲醇溶液与 PLA 二
氯甲烷溶液、PVA 水溶液、NaCl 水溶液按一定质量
比混合均匀；置光照箱内（4 500±500）lx 照射 10
d，于第 10 天取样，观察样品外观、质量的变化。
结果见表 1。试验结果表明 ADS-I 与 PLA、PVA、
NaCl 之间无相互作用。

表 1 高温、高湿及光照加速试验结果
Table 1 Acceleration tests of high temperature, humidity, and light
外观变化 质量 / mg 试验类型 原辅料混合比例
0 d 10 d 0 d 10 d
ADS-I 淡黄色 淡黄色 4.26 4.23
ADS-I-PLA（1∶10） 透明 透明 4.01 3.99
ADS-I-PVA（1∶50） 白色 白色 4.37 4.40
高温加速
ADS-I-PLA-PVA-NaCl（1∶10∶50∶100） 浑浊 浑浊 4.08 4.10
ADS-I 淡黄色 淡黄色 4.19 4.16
ADS-I-PLA（1∶10） 透明 透明颗粒变小 4.13 4.14
ADS-I-PVA（1∶50） 白色 白色 4.43 4.40
高湿加速
ADS-I-PLA-PVA-NaCl（1∶10∶50∶100） 浑浊 浑浊 4.28 4.26
ADS-I 淡黄色 淡黄色 4.50 4.49
ADS-I-PLA（1∶10） 透明 透明颗粒变小 4.38 4.37
ADS-I-PVA（1∶50） 白色 白色 4.16 4.13
强光照射加速
ADS-I-PLA-PVA-NaCl（1∶10∶50∶100） 浑浊 浑浊 4.05 4.06

2.4 包封率和载药量的计算
按照“2.2.3”项下方法处理样品，经 HPLC-
ELSD 测定得微球内 ADS-I 质量，计算包封率及载
药量。
包封率＝微球内 ADS-I 质量/ADS-I 投料量
载药量＝微球内 ADS-I 质量/ADS-I 微球质量
2.5 ADS-I-PLA-MS 制备工艺优化
本实验采用溶剂蒸发法制备 ADS-I-PLA-MS，
是从乳状液中除去分散相挥发性溶剂以制备微球的
方法。
2.5.1 单因素试验 在预试验基础上，以内水相质
量浓度 10 mg/mL，内水相体积与 PLA 体积比为 1∶
10，PLA 质量浓度为 50 mg/mL，连续相为含 1%
NaCl 的 0.5% PVA 水溶液，搅拌时间为 15 min，外
水相体积 200 mL 为固定条件，对 ADS-I 甲醇溶液
质量浓度、ADS-I 甲醇溶液与 PLA 二氯甲烷溶液体
积比、PLA 二氯甲烷溶液质量浓度及 PVA 体积分
别进行考察。结果见表 2。结果显示，在 ADS-I 甲
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醇溶液质量浓度为 10 mg/mL 时包封率最大，15
mg/mL 时载药量最大，但 3 水平的载药量均≤
0.20%；6、15 mg/mL 的包封率与 10 mg/mL 的差异
太大，故缩小范围进行正交试验；ADS-I 甲醇溶液

表 2 单因素试验设计与结果
Table 2 Design and results of single factor test
影响因素 水平 包封率 / % 载药量 / %
6 mg/mL 18.76 0.12
10 mg/mL 30.19 0.17
ADS-I 甲醇溶液
质量浓度
15 mg/mL 13.49 0.20
1∶ 9 27.03 0.21
1∶10 30.19 0.19
ADS-I 甲醇溶液与
PLA 二氯甲烷
溶液体积比 1∶11 31.95 0.23
30 mg/mL 9.73 0.18
50 mg/mL 30.19 0.19
70 mg/mL 36.45 0.18
PLA 二氯甲烷溶液
质量浓度
90 mg/mL 32.41 0.15
200 mL 30.19 0.19
300 mL 34.29 0.57
PVA 体积
400 mL 60.73 0.63
与 PLA 二氯甲烷溶液体积比为 1∶11 时包封率最
大，3 水平的载药量均小于 0.25%，但包封率及载药
量均相差不大，故放大范围进行正交试验；PLA 二
氯甲烷溶液质量浓度为 70 mg/mL 时包封率最大，50
mg/mL时载药量最大，故选择后 3者进行正交试验；
PVA 体积为 400 mL 时包封率及载药量均最大，故
选择 300、400、500 mL 进行正交试验。
2.5.2 正交试验设计及结果 在单因素试验结果的
基础上，对所选择的 ADS-I 甲醇溶液质量浓度（A）、
ADS-I 甲醇溶液与 PLA 二氯甲烷溶液体积比（B）、
PLA 二氯甲烷溶液质量浓度（C）及 PVA 体积（D）
4 因素，分别取其 3 水平进行正交试验，应用 L9(34)
正交表安排试验，按照“2.1”项下的制备方法进行
试验，以 HPLC-ELSD 为测定方法，包封率和载药
量的综合评分（综合评分＝包封率×0.8＋载药量×
0.2）为指标进行考察。试验设计及结果见表 3，方
差分析见表 4。
2.5.3 试验结果分析 从综合评分的直观分析结果
来看，对试验结果影响的顺序为 D＞C＞A＞B。从
方差分析看，相对于因素 B，因素 D 对试验结果有

表 3 L9(34) 正交试验设计与结果
Table 3 Design and results of L9(34) orthogonal test
试验号 A / (mg·mL−1) B C / (mg·mL−1) D / mL 包封率 / % 载药量 / % 综合评分
1 8 (1) 1∶ 9 (1) 50 (1) 300 (1) 65.48 1.15 52.61
2 8 (1) 1∶11 (2) 70 (2) 400 (2) 65.30 0.66 52.37
3 8 (1) 1∶13 (3) 90 (3) 500 (3) 89.60 0.61 71.80
4 10 (2) 1∶ 9 (1) 70 (2) 500 (3) 71.65 1.15 57.55
5 10 (2) 1∶11 (2) 90 (3) 300 (1) 64.84 0.64 52.00
6 10 (2) 1∶13 (3) 50 (1) 400 (2) 65.40 1.00 52.52
7 12 (3) 1∶ 9 (1) 90 (3) 400 (2) 70.65 1.04 56.73
8 12 (3) 1∶11 (2) 50 (1) 500 (3) 74.36 1.38 59.76
9 12 (3) 1∶13 (3) 70 (2) 300 (1) 58.04 0.76 46.58
K1 176.78 166.89 164.89 151.19
K2 162.07 164.13 156.50 161.62
K3 163.07 170.90 180.53 189.11
R 13.71 6.77 24.03 37.92

表 4 方差分析
Table 4 Analysis of variance
误差来源 偏差平方和 自由度 F 值 显著性
A 45.039 2 5.830
C 99.160 2 12.835
D 255.823 2 33.112 P＜0.05
B (误差) 7.726 2
显著影响，因素 A、B、C 无显著性。试验中发现，
当 PLA 质量浓度为 90 mg/mL，ADS-I 甲醇溶液与
PLA 二氯甲烷溶液体积比为 1∶13 时结果为最佳，
且从单因素试验和正交试验观察，发现二者比例若
再增大，载药量则会减小；而 PVA 体积若再增大，
则收集微球困难。综合以上分析结果，选择 ADS-I-
PLA-MS 最佳制备工艺为 A1B3C3D3。
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2.6 ADS-I-PLA-MS 的形态观察
电子扫描显微镜观察（图 2）可知，所得微球
球形圆整，球面光滑无突起，微球整体分散度好，
大小较均匀。微球无空隙或裂纹，表面未见药物结
晶，证明药物包埋在 PLA 内部，ADS-I-PLA-MS 制
备成功。

图 2 ADS-I-PLA-MS 扫描电镜图
Fig. 2 SEM of ADS-I-PLA-MS

2.7 验证试验
按照上述优选的制备工艺重复制备 3批ADS-I-
PLA-MS，按“2.1”项下色谱条件进行测定，结果
包封率分别为 80.99%、84.47%、84.36%，载药量分
别为 0.54%、0.57%、0.57%。结果显示该工艺重复
性较好。
3 讨论
近年来，关于可生物降解聚合物的载药微球制
备方法的报道较多，但多为可与聚合物共溶于二氯
甲烷或其他有机试剂中的药物，如紫杉醇和 BCNU
等[6-7]。而关于水溶性药物的聚乳酸载药微球报道较
少，ADS-I 的聚乳酸载药微球更是首次尝试。《中国
药典》2010 年版中对微球的包封率做了明确规定，故
本实验使用 W/O/W 溶剂蒸发法，采用 HPLC-ELSD
进行 ADS-I 的定量分析，通过考察药物包封率和载
药量对 ADS-I-PLA-MS 的制备工艺进行优选。
复乳化法是在传统乳化工艺上进行改良的微球
制备工艺，但多存在药物突释的现象[8]。由于 NaCl
减少 PLA 分子间的电屏障而作为絮凝剂；而亲水聚
合物 PVA 与电解质 NaCl 的共同存在，使 PLA 分子
间布满了 PVA 和 NaCl，形成均匀疏松的 PLA 微球
结构，可有效解决突释现象[9]。因此在预试验时考
察了外水相 PVA 水溶液中 NaCl 的质量浓度对包封
率及载药量的影响。考察过程中发现NaCl为 1%时，
由于 NaCl 使得微球内外相之间“通道”的物质交
换减少，而包封率最高，但对于载药量几乎无影响。
继而考察外水相 PVA 水溶液质量浓度、超声分散时
间及搅拌时间，发现 PVA 水溶液质量浓度为 0.5%、
1%、2%、3%时包封率及载药量均无差异；在超声
分散至澄清（约 55 s）后，超声分散时间对包封率
和载药量均无显著影响；搅拌时间为 5、10、15、
20 min 时，包封率和载药量亦均无差异，但搅拌时
间为 15 min 后，乳化液中泡沫不再变化，故最终确
定外水相为含 1% NaCl 的 0.5% PVA 水溶液，超声
分散时间为 60 s，搅拌时间为 15 min，以此条件进
行正交实验。通过对正交实验结果的分析和方差分
析，最终确定最佳制备工艺为 ADS-I 甲醇溶液质量
浓度为 8 mg/mL、ADS-I 甲醇溶液与 PLA 二氯甲烷
溶液体积比 1∶13、PLA 二氯甲烷溶液质量浓度为
90 mg/mL、PVA 体积为 500 mL。该工艺合理可行，
为今后将其制成缓释植入剂，实现原位给药提供了
依据。
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10.0 μm