全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 18 期 2013 年 9 月 ·2542·
HPLC-DAD 法同时测定苦碟子注射液中 10 种核苷类成分
刘 睿，马思萌，孙 璐，任晓亮，李遇伯，张艳军*
天津中医药大学中药学院，天津 300193
摘 要：目的 建立同时测定苦碟子注射液中 10 种核苷类成分（胞嘧啶、尿嘧啶、胞苷、鸟嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌
呤、鸟苷、胸苷、腺苷）量的 HPLC-DAD 方法。方法 采用 Diamonsil C18（2）色谱柱（200 mm×4.6 mm，5 μm），流动相
为乙腈-水，梯度洗脱。体积流量 1.0 mL/min，柱温 35 ℃，检测波长 260 nm，进样量 10 μL。结果 10 种核苷类成分线性
关系、精密度、稳定性、重复性均符合方法学测定要求，加样回收率为 98.63%～102.92%。应用所建立的方法测定了 18 批
苦碟子注射液中 10 种核苷类成分的量。结论 所建立的用于同时测定苦碟子注射液中核苷类成分的分析方法简单、重复性
好、准确可靠，可为苦碟子注射液质量控制提供依据。
关键词：HPLC-DAD；核苷类化合物；苦碟子注射液；质量控制；嘌呤；嘧啶
中图分类号：R286.02 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2013)18 - 2542 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2013.18.010
Simultaneous determination of ten nucleoside components in Kudiezi Injection
by HPLC-DAD
LIU Rui, MA Si-meng, SUN Lu, REN Xiao-liang, LI Yu-bo, ZHANG Yan-jun
College of Chinese Materia Medica, Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China
Abstract: Objective To develop a high performance liquid chromatography coupled with a photodiode array detector (HPLC-DAD)
method for the simultaneous determination of ten nucleoside components (cytosine, uracil, cytidine, guanine, uridine, thymine,
adenine, guanosine, thymidine, and adenosine) in Kudiezi Injection (KI). Methods The analyses were performed on a Diamonsil C18
(2) column (200 mm × 4.6 mm, 5 μm) eluted with water and acetonitrile in gradient mode. The flow rate was 1.0 mL/min, the detection
wavelength was 260 nm, the column temperature was set at 35 , and the injection volume was 10 μL. ℃ Results Ten nucleoside
compounds have good linear relationship, precision, stability, and repeatability according to the requirements of the methodology
determination. The recoveries were 98.63%－102.9%. Ten nucleoside components in eighteen batches of KI were determined by
HPLC-DAD method. Conclusion The developed HPLC-DAD method is simple, sensitive, and accurate, and has good repeatability.
The ten nucleoside components in KI could be rapidly and accurately quantified by HPLC-DAD. This work provides helpful
information for the comprehensive quality evaluation of KI.
Key words: HPLC-DAD; nucleosides; Kudiezi Injection; quality control; purine; pyrimidine

苦碟子别名满天星，苦荬菜，主要分布于我国
东北及内蒙古等地，为菊科植物抱茎苦荬菜 Ixeris
sonchifolia (Bunge) Hance 的当年生干燥全草，性寒，
味苦、辛，具有清热解毒、排脓止痛之功效[1]。苦
碟子（碟脉灵）注射液（Kudiezi Injection，KI）是
以抱茎苦荬菜单味药材为原料提取精制而成的静脉
注射液，具有活血止痛、清热祛瘀的作用[2]，用于
瘀血闭阻的胸痹、冠心病、心绞痛、脑梗死等。该
注射液已上市多年，疗效确切，其处方为抱茎苦荬
菜 1 000 g，制成 1 000 mL 注射液，规格为每支 10
mL 装。实验研究表明，苦碟子注射液化学成分比
较复杂，而与其临床疗效相关的主要活性成分为核
苷类（nucleoside components）、有机酸类和黄酮类
成分[3]。

收稿日期：2013-03-13
基金项目：国家科技重大专项课题（2011ZX09401-305-42）；教育部高等学校博士学科点专项科研基金（20121210120001）：天津市高等学校
科技发展基金计划项目（20110215）
作者简介：刘 睿（1980—），女，博士，讲师，主要从事中药注射液安全性再评价及中药新型给药系统研究。
Tel: (022)59596221 E-mail: lr_8000@163.com
*通信作者 张艳军 Tel: (022)59596221 E-mail: zyjsunye@163.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 18 期 2013 年 9 月 ·2543·
核苷类成分是生物细胞维持生命活动的基本
组成元素，参与 DNA 代谢过程，通过激活人体中
的嘌呤受体发挥多种生理作用 [4-5] 。如胞苷
（cytidine）具有抗肿瘤和抗病毒等作用；尿苷
（uridine）参与糖原合成，有助于提高细胞的耐缺
氧能力和机体抗体水平，并可以阻断癌细胞和病毒
的基因合成；鸟苷（guanosine）具有免疫调节的生
理活性；特别是腺苷（adenosine）具有抗心肌缺血、
抗凝血、抗炎、改善心脑血液循环、防止心率失常、
抑制神经递质释放和调节腺苷酸环化酶活性等作
用，是苦碟子注射液质量控制的指标成分[6]。因此，
为了控制产品质量，对苦碟子注射液中的核苷类化
合物建立快速、简便、准确的测定方法具有重要的
实际意义。
目前，核苷类化合物定量测定方法主要有 UV
法[7]、TLC 法[8]、HPLC-MS 法[9]、毛细管电泳法[10]
等。UV 法与 TLC 法特异性较差，HPLC-MS 法与
毛细管电泳法对仪器要求较高，因此，本实验采用
HPLC-DAD 技术建立同时测定 10 种核苷类化合物
（5 种核苷：尿苷、腺苷、鸟苷、胞苷、胸苷和 5 种
碱基：尿嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧
啶）的分析方法，并应用该方法测定苦碟子注射液
中主要核苷类化合物的量，以期为注射液水溶性成
分的进一步研究奠定基础，同时为其质量控制提供
方法学参考依据。
1 仪器与材料
Waters-e2695-HPLC 系统（美国 Waters 公司，
包括四元梯度泵，在线真空脱气机，自动进样器，
2998 光电二极管阵列检测器 PDA，Empower 2 色
谱工作站，柱温箱）；Sartorius BT125D 型分析天平
［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］，KH 2200B
型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）。
对照品尿嘧啶（批号 100469-200401）、腺苷（批
号 110879-200202）购于中国药品生物制品检定所，
胞嘧啶（批号 C94998BGF0）、胸腺嘧啶（批号
T55620BGF0）、腺嘌呤（批号 A73241BGF0）、鸟苷
（批号 G24210BGQ0）、胸苷（批号 T55590BGF0）
购于天津希恩思生化科技有限公司，胞苷（批号
101056874）、尿苷（批号 1001290893）购于 Sigma
公司，鸟嘌呤（批号 HCCTH-BG，上海化成工业发
展有限公司），所有对照品经 HPLC 峰面积归一化
法计算质量分数均大于 99%。
苦碟子注射液（通化华夏药业有限责任公司提
供，批号 120311T、120312T、120314T、120315T、
120316T、120317T、129318T、120319T、120312、
120532、120109、110601、111011、120438、120625、
120209、111105、111218）。乙腈（色谱纯，Sigma
公司），甲醇（色谱纯，天津康科德科技有限公司），
超纯水，其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 混合对照品溶液的配制
分别精密称取胞嘧啶、尿嘧啶、胞苷、鸟嘌呤、
尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鸟苷、胸苷、腺苷对照
品适量，加水超声溶解，摇匀，制成含胞嘧啶 0.50
μg/mL、尿嘧啶 1.20 μg/mL、胞苷 17.50 μg/mL、鸟
嘌呤 20.00 μg/mL、尿苷 40.00 μg/mL、胸腺嘧啶 2.50
μg/mL、腺嘌呤 10.00 μg/mL、鸟苷 50.00 μg/mL、
胸苷 10.00 μg/mL、腺苷 20.00 μg/mL 的混合对照品
溶液。
2.2 供试品溶液的配制
取苦碟子注射液，采用 0.45 μm 微孔滤膜滤过，
作为供试品溶液，待测。
2.3 色谱条件
色谱柱为 Diamonsil C18（2）（200 mm×4.6 mm，
5 μm）；检测波长 260 nm；体积流量 1 mL/min；柱
温 35 ℃；进样量 10 μL；流动相为乙腈-水，梯度
洗脱条件：0～5 min，2%乙腈；5～9 min，2%～9%
乙腈；9～15 min，9%～11%乙腈；15～25 min，
11%～40%乙腈。
2.4 专属性试验
在“2.3”项色谱条件下，胞嘧啶、尿嘧啶、胞
苷、鸟嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鸟苷、胸
苷、腺苷的混合对照品溶液和苦碟子注射液供试品
溶液的 HPLC 谱图见图 1，混合对照品溶液及苦碟
子注射液供试品溶液中 10 种核苷类成分达到基线
分离。
2.5 线性关系考察
分别精密吸取混合对照品溶液适量，加水稀释
至不同质量浓度，摇匀，制得系列混合对照品溶液，
HPLC 测定。以峰面积积分值为纵坐标（Y），对照
品质量浓度为横坐标（X）进行线性回归，得回归
方程：胞嘧啶 Y＝33 450 X＋409.28，r＝0.999 6；
尿嘧啶 Y＝22 040 X＋1 162，r＝0.999 5；胞苷 Y＝
18 925 X＋2 042.4，r＝0.999 9；鸟嘌呤 Y＝6 926.8
X＋280.65，r＝0.999 3；尿苷 Y＝24 749 X－4 250.2，
r＝0.999 9；胸腺嘧啶 Y＝30 395 X＋818.91，r＝
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1-胞嘧啶 2-尿嘧啶 3-胞苷 4-鸟嘌呤 5-尿苷 6-胸腺嘧啶
7-腺嘌呤 8-鸟苷 9-胸苷 10-腺苷
1-cytosine 2-uracil 3-cytidine 4-guanine 5-uridine 6-thymine
7-adenine 8-guanosine 9-thymidine 10-adenosine

图 1 混合对照品 (A) 和苦碟子注射液 (B) HPLC 色谱图
Fig. 1 HPLC chromatograms of mixed reference
substances (A) and KI (B)

0.999 0；腺嘌呤 Y＝54 625 X－7 279.1，r＝0.999 9；
鸟苷 Y＝20 168－7 737.1，r＝0.999 7；胸苷 Y＝
20 646 X－1 227.4，r＝0.999 8；腺苷 Y＝32 173 X－
12 900，r＝0.999 5；结果表明胞嘧啶在 15.63～
500.00 ng/mL、尿嘧啶在 0.037 5～1.20 μg/mL、胞
苷在 0.546 9～17.50 μg/mL、鸟嘌呤在 0.625～20.00
μg/mL、尿苷在 1.25～40.00 μg/mL、胸腺嘧啶在
0.078 13～2.50 μg/mL、腺嘌呤在 0.312 5～10.00
μg/mL、鸟苷在 1.562 5～50.00 μg/mL、胸苷在
0.312 45～10.00 μg/mL、腺苷在 0.625～20.00 μg/mL
线性关系良好。
2.6 精密度试验
精密吸取混合对照品溶液，其中胞嘧啶、尿嘧
啶、胞苷、鸟嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鸟
苷、胸苷、腺苷的浓度分别为 0.125、0.300、4.375、
5.000、10.00、0.625、2.500、12.50、2.500、5.000
μg/mL，在“2.3”项色谱条件下，连续进样 6 次，
记录峰面积。结果胞嘧啶、尿嘧啶、胞苷、鸟嘌呤、
尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鸟苷、胸苷、腺苷峰面
积的 RSD 分别为 1.5%、1.7%、0.3%、0.1%、0.1%、
0.5%、0.2%、0.2%、0.2%、0.2%。结果表明仪器精
密度良好。
2.7 稳定性试验
取苦碟子注射液（批号 120319T），制备供试品
溶液，室温放置，分别于 0、2、4、6、8、12 h 进
样测定，在“2.3”项色谱条件下，进样分析，记录
峰面积。结果胞嘧啶、尿嘧啶、胞苷、鸟嘌呤、尿
苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鸟苷、胸苷、腺苷峰面积
的 RSD 分别为 3.2%、2.8%、3.4%、3.9%、1.9%、
3.3%、2.1%、2.0%、2.9%，结果表明供试品溶液在
12 h 内稳定。
2.8 重复性试验
取苦碟子注射液（批号 120319T），按“2.2”
项下方法制成供试品溶液，平行测定 6 次，在“2.3”
项色谱条件下分别测定，计算每种对照品的色谱峰
面积。结果胞嘧啶、尿嘧啶、胞苷、鸟嘌呤、尿苷、
胸腺嘧啶、腺嘌呤、鸟苷、胸苷、腺苷的质量浓度
分别为 0.763、0.131、2.831、0.438、6.138、1.911、
7.123、0.903、4.598 μg/mL；RSD 分别为 3.0%、4.2%、
2.3%、4.3%、1.8%、3.7%、0.8%、3.1%、2.2%。
结果表明，该方法的重复性良好。
2.9 回收率试验
精密量取已测定的苦碟子注射液（批号
120319T）5.0 mL，平行 6 份，分别置 10 mL 量瓶
中，分别精密加入一定质量浓度的混合对照品溶液
5.0 mL，其中胞嘧啶 0.14 μg/mL、尿嘧啶 0.27
μg/mL、胞苷 3.10 μg/mL、鸟嘌呤 4.60 μg/mL、尿
苷 6.00 μg/mL、胸腺嘧啶 1.20 μg/mL、腺嘌呤 2.90
μg/mL、鸟苷 7.2 μg/mL、胸苷 1.60 μg/mL、腺苷 5.00
μg/mL，摇匀，在“2.3”项色谱条件下进样分析，
记录峰面积，计算加样回收率。结果胞嘧啶、尿嘧
啶、胞苷、鸟嘌呤、尿苷、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鸟
苷、胸苷、腺苷的平均回收率分别为 99.61%、
101.08%、101.54%、100.95%、101.53%、102.92%、
99.12%、102.14%、98.63%、102.96%，RSD 分别
为 2.55%、2.10%、2.61%、2.33%、2.57%、2.27%、
1.98%、2.27%、2.54%、0.69%。结果表明，平均回
收率在 98.63%～102.96%，RSD≤2.61%。
2.10 样品测定
取苦碟子注射液适量，按“2.2”项下方法制备
供试品溶液，在“2.3”项色谱条件下进样分析，记
录峰面积，用回归方程计算 10 种核苷类化合物的
量，测定结果见表 1。结果表明，苦碟子注射液中
包含除胸腺嘧啶外的其他 9 种核苷类成分，但是与
临床疗效相关的苦碟子注射液质量控制的指标成分
腺苷的批间差异较小，且量较高的鸟苷和尿苷的批
间差异不大。
1 2
3
4
5
6
7
8
9
10
A
B
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3
4
5
7 8
9
10
0 4 8 12 16 20
t / min
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表 1 不同批次苦碟子注射液中核苷类成分测定结果
Table 1 Determination of nucleoside components in KI from different batches
质量浓度 / (μg·mL−1) 批 号
胞嘧啶 尿嘧啶 胞苷 鸟嘌呤 尿苷 腺嘌呤 鸟苷 胸苷 腺苷 胸腺嘧啶 总和
120311T 0.09 0.26 2.78 4.94 6.78 3.47 8.05 1.01 5.05 － 32.43
120312T 0.11 0.25 2.74 6.95 6.28 2.33 7.65 0.74 4.39 － 31.44
120314T 0.08 0.23 2.57 4.47 6.11 2.41 7.65 0.75 5.42 － 29.69
120315T 0.11 0.30 2.56 4.83 6.43 2.44 9.16 1.14 4.90 － 31.87
120316T 0.11 0.22 2.91 5.06 7.38 2.90 8.95 1.34 4.87 － 33.74
120317T 0.09 0.29 2.76 6.69 5.53 2.55 7.49 0.84 4.26 － 30.50
129318T 0.11 0.34 2.72 4.66 6.77 2.34 7.64 1.64 4.87 － 31.09
120319T 0.10 0.24 3.32 4.93 6.34 2.42 7.30 1.00 4.46 － 30.11
120312 0.07 1.92 6.62 0.20 4.66 1.28 5.21 0.80 4.34 － 25.10
120532 0.12 2.69 5.86 0.41 6.10 2.05 7.18 1.15 3.87 － 29.43
120109 0.11 2.11 12.20 0.25 5.57 1.55 6.91 0.89 5.51 － 35.09
110601 0.08 1.76 7.75 0.22 4.90 1.38 6.53 0.86 4.28 － 27.76
111011 0.07 1.73 6.15 0.21 4.42 1.04 5.73 0.73 4.06 － 24.16
120438 0.10 2.40 6.23 0.40 5.31 1.96 7.26 0.95 4.33 － 28.93
120625 0.10 1.92 12.51 0.30 4.68 1.34 6.31 0.91 4.89 － 32.96
120209 0.09 1.89 11.68 0.27 5.35 1.69 6.49 0.92 5.30 － 33.69
111105 0.09 1.71 10.08 0.16 4.82 1.18 5.55 0.84 4.32 － 28.75
111218 0.06 1.75 9.89 0.18 4.43 1.14 5.38 0.76 3.97 － 27.55
“－”未检出
“－” undetected

3 讨论
采用 DAD 检测器进行全波长扫描（200～400
nm），分析 10 种核苷类化合物的紫外光谱，结果
表明，检测波长为 260 nm 时，10 种化合物均有较
强吸收，且分离效果良好。综合考虑检测时各色谱
峰的响应和干扰因素，最终选择 260 nm 为本实验
的检测波长。
核苷类成分呈弱碱性，极性大，较难分离。实
验中分别对甲醇-水和乙腈-水作为流动相系统进行
考察。结果表明，核苷类成分在乙腈-水梯度洗脱
系统的分离效果更好，且 HPLC-DAD 法操作简便，
核苷类成分在适宜的色谱条件下可以获得理想的
分离效果，在本文选定的色谱条件下，苦碟子注射
液中核苷类物质的色谱峰 15 min 内既可完成分析，
分离效果良好，该法测定快速、结果准确，稳定性
良好，是一种测定苦碟子注射液中核苷类成分的可
靠方法，可为苦碟子注射液品质评价体系提供实验
依据。
通过对 18 批苦碟子注射液中核苷类成分的分
析，结果表明，该注射液中含有 9 种核苷，其中含
量较高的有鸟苷、尿苷、腺苷、鸟嘌呤及胞苷等，
不同批次注射液中各核苷的量具有一定的差异，但
与临床疗效相关的腺苷批间差异较小[11]。说明以核
苷为指标的注射剂生产工艺较为稳定，也提示应对
其他核苷类成分开展相关研究，以期对苦碟子注射
液的质量及安全性进行更加全面的评价。
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