全 文 ：分离出齐墩果酸和蜕皮甾酮的斑点，表明齐墩果酸
和蜕皮甾酮是倒扣草中的重要成分。
3. 2 通过高效液相色谱法，在倒扣草中测定出较
高含量的齐墩果酸和蜕皮甾酮，为下一步对倒扣草
研究提供理论依据。
3. 3 根据本实验结果，可为倒扣草的进一步开发
利用提供依据，其含量测定专属性强，灵敏度高，重
现性好，方法可靠。
参 考 文 献
［1］萧步丹 . 岭南采药录［M］. 广州:广东科学技术出版
社，2009:87-88.
［2］《全国中草药汇编》编写组 . 全国中草药汇编［M］. 上
册 . 北京:人民卫生出版社，1982:205.
［3］潘杭君，孙红祥 . 三萜皂苷的免疫调节作用［J］. 中兽
医学杂志，2003，(1) :42-45.
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含量测定［J］. 中国药学杂志，2001，36(10) :699-700.
［5］杨春澍，主编 . 药用植物学［M］. 上海:上海科学技术
出版社，1997:337-340.
竹叶柴胡地上部分指纹图谱研究
张婷婷1，2，周颈松3，王 强4，马志国2
(1. 暨南大学中药药效物质基础及创新药物研究广东省高校重点实验室，广东 广州 510632;2. 暨南大学
药学院，广东 广州 510632;3. 广州市香雪制药股份有限公司技术开发中心，广东 广州 510663;4. 中国药
科大学中药学院，江苏 南京 211198)
摘要 目的:采用 HPLC-DAD法建立竹叶柴胡地上部分的指纹图谱。方法:使用 Shimpack ODS色谱柱，乙腈-
0. 1%甲酸水溶液为流动相梯度洗脱，流速 0. 8 mL /min，检测波长 254 nm，应用“中药色谱指纹图谱相似度评价系
统(2004A)”对指纹图谱进行分析。结果:建立了 15 批不同产地竹叶柴胡的指纹图谱，标定了 17 个共有特征峰，并
与对照品进行比较，确认了对照指纹图谱中 7 个黄酮色谱峰的归属。结论:该方法简便准确，为竹叶柴胡的质量控
制提供科学依据。
关键词 竹叶柴胡;指纹图谱;HPLC-DAD
中图分类号:R282. 5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2011)08-1203-04
收稿日期:2011-04-08
作者简介:张婷婷(1979-) ，博士，讲师，研究方向:中药及制剂分析;Tel:15918704550，E-mail:sunrat115@ 126. com。
竹叶柴胡(Bupleurum marginatum Wall. ex DC. )
为伞形科柴胡属植物，分布于浙江、福建、湖北、甘
肃、四川、云南、贵州等省，根或全草入药，已收入云、
贵、川三省药材标准［1］。竹叶柴胡性味苦寒，具有
散风退热、疏肝解郁之功效，为目前市场上柴胡药材
的三大主要来源之一。研究表明，竹叶柴胡的根主
要含柴胡皂苷类化合物［2，3］，而地上部分的主要成
分则是黄酮［4］。本实验在前期研究的基础上［5-8］，
以黄酮为指标性成分，建立了 15 批不同产地的竹叶
柴胡地上部分的指纹图谱，为合理利用竹叶柴胡资
源和药材的质量控制提供依据。
1 仪器与材料
1. 1 材料 本实验所用的竹叶柴胡药材(见表 1)
均购于中国当地的药材市场、药材公司或自采，经中
国药科大学中药学院王强教授鉴定为竹叶柴胡
Bupleurum marginatum 的地上部分。12 个黄酮对照
品为实验室前期分离得到，使用1H-NMR、13 C-NMR
及 ESI-MS 对其进行了结构验证，经 HPLC-DAD 面
积归一化法计算，纯度均在 98%以上。分别是:儿
茶素(1)、5，7，4-三羟基-芹黄素-6，8-二-C-β-D-葡萄
吡喃糖苷(2)、槲皮素-3-O-β-D-葡萄吡喃糖基-(6→
1)-α-L-鼠李吡喃糖苷(3)、山柰素-3，7-二-O-α-L-鼠
李吡喃糖苷(4)、槲皮素-3-O-α-D-阿拉伯呋喃糖苷
(5)、槲皮素-3-O-α-L-鼠李吡喃糖苷(6)、7-羟基-2，
5-二甲基色原酮(7)、金合欢素-7-O-β-D-葡萄吡喃糖
基-(1→4)-α-L-鼠李吡喃糖苷(8)、山柰素-7-O-α-L-
鼠李吡喃糖苷(9)、槲皮素(10)、山柰素(11)和异鼠
李素(12)。
乙腈为色谱纯，德国 MERCK公司;甲酸为色谱
纯，中国汉邦化学试剂公司;水为去离子水。
1. 2 仪器 Agilent 1100 高效液相色谱系统(包括
四元泵、DAD检测器、柱温箱、自动进样器、工作站)。
·3021·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 34 卷第 8 期 2011 年 8 月
DOI:10.13863/j.issn1001-4454.2011.08.016
表 1 15 批竹叶柴胡产地
批次 产地 批次 产地
S1 河南南阳 S9 云南蒙自
S2 云南昆明 S10 云南会泽
S3 云南大理 S11 云南会泽
S4 云南丽江 S12 贵州遵义
S5 四川重庆 S13 贵州遵义
S6 四川成都 S14 四川德阳
S7 云南会泽 S15 四川温江
S8 云南蒙自
2 方法与结果
2. 1 色谱条件 Shimpack ODS 色谱柱(150 mm ×
4. 6 mm，5 μm) ，预柱为 ZORBAXODS(4. 6 mm ×
12. 5 mm，5 μm) ;流动相:乙腈(A)-0. 1% 甲酸水
(B) ，梯度洗脱:0 ～ 10 min，10 ～ 20%A;10 ～ 20 min，
20%A;20 ～ 25 min，20 ～ 30% A;25 ～ 35 min，30 ～
33%A;35 ～ 40 min，33 ～ 40% A;40 ～ 60 min，40 ～
60%A。流速 0. 8 mL /min;进样体积为 20 μL;柱温
30℃;检测波长 254 nm。
2. 2 对照品溶液的制备 分别取各黄酮对照品适
量，精密称定，加甲醇制成每 1 mL 含 1 mg 的溶液，
即得。混合对照品图谱见图 1。
图 1 12 个黄酮混合对照品图谱
1. 儿茶素 2. 5，7，4-三羟基-芹黄素-6，8-二-C-β-D-葡萄吡
喃糖苷 3. 槲皮素-3-O-β-D-葡萄吡喃糖基-(6→1)-α-L-鼠
李吡喃糖苷 4. 山柰素-3，7-二-O-α-L-鼠李吡喃糖苷
5. 槲皮素-3-O-α-D-阿拉伯呋喃糖苷 6. 槲皮素-3-O-α-L-鼠
李吡喃糖苷 7. 7-羟基-2，5-二甲基色原酮 8. 金合欢素-
7-O-β-D-葡萄吡喃糖基-(1→4)-α-L-鼠李吡喃糖苷 9. 山柰
素-7-O-α-L-鼠李吡喃糖苷 10. 槲皮素 11. 山柰素 12.
异鼠李素
2. 3 供试品溶液的制备 精密称取竹叶柴胡药材
1. 0 g，置 250 mL锥形瓶中，加入 100 mL甲醇，超声
处理 0. 5 h，滤过，滤液减压浓缩至干，残渣用甲醇溶
解并转移至 10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤
过，取续滤液，即得。
2. 4 方法学考察
2. 4. 1 精密度试验:取竹叶柴胡(S8)配制成的供
试品溶液，按“2. 1”项下色谱条件，连续进样 6 次，
记录色谱图，计算其各共有峰相对保留时间、相对峰
面积，RSD 均小于 3%，精密度符合指纹图谱的要
求。
2. 4. 2 重复性试验:精密称取 6 份竹叶柴胡(S8)
供试品，按“2. 3”项下方法配制成 6 份供试品溶液。
按“2. 1”项下色谱条件，连续进样，记录色谱图，计
算其各共有峰相对保留时间、相对峰面积，RSD 均
小于 3%，重复性符合指纹图谱的要求。
2. 4. 3 稳定性试验:取竹叶柴胡(S8)配制成的供
试品溶液，按“2. 1”项下色谱条件，每隔 3 h 进样一
次，共 6 次记录色谱图，计算其各共有峰相对保留时
间、相对峰面积，RSD 均小于 3%，稳定性符合指纹
图谱的要求。
2. 5 样品测定 按“2. 1”项下色谱条件，对 15 批
竹叶柴胡样品进行分析测定，记录色谱图(见图 2)。
采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评
价系统(2004A版)”软件进行分析。
2. 6 指纹图谱的建立及相似度评价 15 批竹叶
柴胡指纹图谱数据经“中药色谱指纹图谱相似度评
价系统”分析，以样品 S8 的指纹图谱为参照图谱，
采用中位数法，经自动匹配得到 15 批竹叶柴胡药材
的对照指纹图谱(见图 3) ，确定共有峰 17 个，根据
与对照品的比对，指认了对照指纹图谱中的 7 个黄
酮色谱峰。根据色谱峰匹配结果，计算出待测指纹
图谱与对照指纹图谱的相似度，分别为 0. 923，
0. 982，0. 985，0. 979，0. 929，0. 740，0. 980，0. 985，
0. 982，0. 960，0. 956，0. 874，0. 931，0. 743，0. 899。
结果表明，产自云南省五个地区的竹叶柴胡相似度
较高，均大于 0. 95;而采自四川成都和德阳的竹叶
柴胡与对照指纹图谱相比，相似度仅有 0. 74，与其
他竹叶柴胡差异较大;采自河南南阳、四川重庆、贵
州遵义、四川温江的竹叶柴胡与标准图谱的相似度
在 0. 87 以上。
3 讨论
3. 1 流动相的选择:流动相的组成曾分别实验过
乙腈-水和甲醇-水，证明前者对色谱的分离效果更
好。流动相中加入少量的弱酸可以改善色谱峰的分
离，减少拖尾现象，所以分别选择了 0%，0. 1%，5%
的甲酸、乙酸进行优选。试验结果表明，酸液的加入
的确可以增加峰的分离度，甲酸改善峰形的作用大
于乙酸，而酸浓度对峰形的影响不大。所以我们选
择在乙腈-水溶液中加入 0. 1%甲酸。
·4021· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 34 卷第 8 期 2011 年 8 月
图 2 15 批竹叶柴胡药材地上部分 HPLC图谱
图 3 15 批竹叶柴胡药材地上部分对照指纹图谱
1 ～ 17. 特征峰 7. 儿茶素 8. 5，7，4-三羟基-芹黄素-6，8-
二-C-β-D-葡萄吡喃糖苷 11. 槲皮素-3-O-β-D-葡萄吡喃糖
基-(6→1)-α-L-鼠李吡喃糖苷 12. 山柰素-3，7-二-O-α-L-鼠
李吡喃糖苷 13. 槲皮素-3-O-α-D-阿拉伯呋喃糖苷 14. 7-
羟基-2，5-二甲基色原酮 16. 槲皮素
3. 2 色谱柱的选择:实验中选择了四种反相柱做
对比，分别是 Diamonsil C18(150 mm × 4. 6 mm，5
μm)、汉邦 C18(150 mm × 4. 6 mm，5 μm)、Shimpack
ODS(150 mm × 4. 6 mm，5 μm)、Shimpack ODS(250
mm ×4. 6 mm，5 μm) ，试验结果表明 Shimpack 柱效
较高，而且 Shimpack ODS(150 mm ×4. 6 mm，5 μm)
在本实验中分离效果更好，确定以此柱作为实验用
柱。
3. 3 流速与柱温的选择:一般来说，在一定的限度
下升高柱温与增加流速可以增加分离度，改善峰形。
本实验选择了 20℃、25℃、30℃的不同柱温和 0. 8
mL /min、1. 0 mL /min两种流速，试验结果表明，0. 8
mL /min的流速、30℃的柱温，可以使样品色谱峰得
到最好的分离效果。
3. 4 竹叶柴胡地上部分指纹图谱的建立:本试验
首次建立了竹叶柴胡地上部分的标准指纹图谱，确
立了 15 批竹叶柴胡的共有特征峰，并指认了其中的
7 个黄酮色谱峰，为药材的定性鉴别提供依据。但
因竹叶柴胡中色谱峰面积所代表的化合物浓度有较
大差异，若以色谱峰相对保留值和峰面积为指标考
察相似度时，一些竹叶柴胡样品的指纹图谱与标准
图谱比较差异较大。试验证明，本方法操作简单、结
果准确，为合理利用竹叶柴胡资源和药材的质量控
制提供了科学依据。
参 考 文 献
［1］肖培根，李大鹏，杨世林 . 新编中药志(第一卷) ［M］.
北京:化学工业出版社，2001:793.
［2］ Ding J K，Fujino H，Kasai R，et al. Chemical evaluation of
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Pharm Bull，1986，34(3) :1158-1167.
［3］梁之桃，秦民坚，王峥涛 . 竹叶柴胡化学成分的研究
［J］. 中国药科大学学报，2003，34(4) :305-308.
［4］汪琼，徐增莱，王年鹤，等 . 竹叶柴胡地上部分的化学成
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［5］ Zhang Tingting，Zhou Jinsong，Wang Qiang. Flavonoids from
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［6］张婷婷，周劲松，刘英，等 . 抱茎柴胡地上部分的化学成
分研究(英文) ［J］. 中国天然药物，2008，6(6) :430-
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大叶钩藤的分子鉴定
朱 爽1，周 林1，黄晓敏1，高晓霞2，孙 悦3，曾常青3*
(广东药学院 1. 生命科学与生物制药学院;2. 药科学院;3. 中药学院，广东 广州 510006)
摘要 目的:以核糖体转录间隔区(rDNA ITS)序列为分子标记，对钩藤属的常用中药材大叶钩藤(Uncaria
macrophylla Wall.)进行遗传分析，阐明大叶钩藤的分子系统发育关系。方法:通过改良 CTAB法提取大叶钩藤植物
总 DNA，利用通用引物对 rDNA ITS序列进行 PCR扩增，经克隆、测序后，运用 Clustal X，BioEdit和 PAUP等软件进
行序列分析和构建系统发育树。结果:测序得到大叶钩藤植物的 rDNA ITS区序列长度为 718 bp，序列分析结果显
示大叶钩藤与 Genbank中已有的钩藤属植物相似，在系统发育树中与钩藤属植物 Uncaria guianensis(AJ414546)和
Unacria africana(AJ414545)聚类成为一枝，又与钩藤属的钩藤(U. rhynchophylla，AJ346900)、华钩藤(U. sinensis，
FJ980386)、毛钩藤(U. hirsute，GU937110)和无柄果钩藤(U. sessilifructus，GU937111)并排聚类成一枝。结论:基于
rDNA ITS区序列的测序分析和系统发育树构建的分子生物学方法，能够对大叶钩藤进行准确的分子鉴定分析，为
钩藤属中药材的种类鉴定和种间的分类地位提供分子生物学理论依据。
关键词 钩藤;ITS序列;分子鉴定
中图分类号:R282. 5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2011)08-1206-03
收稿日期:2011-03-29
基金项目:广东省自然科学基金资助项目(8451022401001607) ;中山市科技局资助项目(2010H017)
作者简介:朱爽(1977-) ，男，讲师，主要从事中药材分子鉴定的研究;Tel(Fax) :020-39352201，E-mail:wenchengji@ yahoo. com. cn。
* 通讯作者:曾常青，Tel(Fax) :020-39352128，E-mail:gdzcq@ 163. com。
中药钩藤为茜草科钩藤属植物，始载于《名医
别录》，其性微寒，味甘，用于头痛眩晕、感冒夹惊、
高血压症等，临床常配伍入药［1］。2010 年版中国药
典规定钩藤为茜草科植物钩藤 Uncaria rhynchophyl-
la(Miq. )Miq. ex Havil. 、大叶钩藤 Uncaria macro-
phlla Wall. 、华钩藤 Uncaria sinensis (Oliv. )Havil. 、
毛钩藤 Uncaria hirsute Havil.或无柄果钩藤 Uncaria
sessilifructus Roxb. 的干燥带钩茎枝［2］。化学成分研
究表明，钩藤药材中的主要有效成分为生物碱，但不
同种的药效成分有明显的差别［3］。目前，我国的钩
藤主要分布在广西、贵州、云南、广东等西南地区，由
于钩藤药材的广泛使用，有些地区的品种面临濒危，
导致市场上销售的钩藤种类十分混乱，出现互混、互
代、以次充好的现象，影响了用药的安全性和有效
性。为了更准确更安全地使用钩藤中药材，有必要
利用 DNA 分子标记技术进一步鉴定钩藤属植物的
种间关系。分子生物学技术已在药用植物的分子系
统发育分析中广泛利用，但对于钩藤属植物的种间
关系的分子鉴定少有报道，陶刚、朱爽等〔4、5〕曾对钩
藤属植物进行分子鉴定并归类到属。
本研究采用分子生物学技术，以核糖体转录间
隔区(rDNA ITS)序列为分子标记，对一种采集自广
东鼎湖山的大叶钩藤(U. macrophylla Wall.)rDNA
ITS序列进行分析，构建其系统发育树，从遗传本质
上对大叶钩藤的分类地位和种间鉴定提供分子证
据。
1 材料来源与鉴定
大叶钩藤材料采集于广东肇庆鼎湖山龙校鸡
尾，由广东药学院曾常青教授鉴定。该植物为攀援
状大藤本，有褐色疏粗毛，茎枝呈方柱形，每一节上
有钩，叶对生，近革质，卵形或阔椭圆形。采集新鲜
的叶片，48 h内进行钩藤总 DNA 提取，或直接放进
置含有硅胶的密封袋中快速干燥备用。
2 方法
2. 1 植物总 DNA 提取 采用改良 CTAB 法［6］提
取植物总 DNA:在预冷的灭菌研钵中，将 0. 5 g新鲜
·6021· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 34 卷第 8 期 2011 年 8 月