全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 9 期 2012 年 9 月

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虎皮楠生物碱 daphnioldhanin E 诱导 HepG2 细胞类凋亡研究
王 蓓，戎瑞雪，王 海，王永丽，张雷芳，曹志然*
河北大学基础医学院，河北 保定 071000
摘 要：目的 研究虎皮楠生物碱 daphnioldhanin E 诱导人肝癌 HepG2 细胞死亡的机制。方法 HepG2 细胞用 daphnioldhanin E
（10、30 μg/mL）处理后，瑞姬氏染色法观察细胞形态变化，DNA 琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡情况，MTT 法检测细胞凋亡
抑制剂 Z-VAD- FMK 对 daphnioldhanin E 抗癌活性的影响，分光光度法检测 caspase-3 酶活性的变化。结果 瑞姬氏染色显
示，HepG2 细胞经 daphnioldhanin E 处理 48 h 后，细胞体积增大，细胞核清晰可见，周围出现大量的胞浆空泡，但细胞膜仍
保持完整；DNA 琼脂糖凝胶电泳结果可见大量 50～200 bp 的片段；MTT 法检测结果显示 Z-VAD-FMK 不能阻断
daphnioldhanin E 对 HepG2 细胞增殖的抑制作用；分光光度法测定显示，daphnioldhanin E 给药组与对照组 HepG2 细胞
caspase-3 酶活性无明显变化，表明 daphnioldhanin E 对 HepG2 细胞的杀伤作用与 caspase-3 激活通路无关。结论
Daphnioldhanin E 可能通过类凋亡方式明显诱导 HepG2 细胞程序性死亡，该过程不依赖于 caspase-3 途径。
关键词：虎皮楠；daphnioldhanin E；HepG2 细胞；类凋亡；caspase-3
中图分类号：R282.710.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2012)09 - 1789 - 05
Paraptosis in HepG2 cells induced by daphnioldhanin E from Daphniphyllum oldhami
WANG Bei, RONG Rui-xue, WANG Hai, WANG Yong-li, ZHANG Lei-fang, CAO Zhi-ran
College of Basic Medicine, Hebei University, Baoding 071000, China
Abstract: Objective To investigate the mechanism of HepG2 cell death induced by daphnioldhanin E from Daphniphyllum oldhami.
Methods The HepG2 cells were treated with daphnioldhanin E (10 and 30 μg/mL), and the morphologic changes of cells were
observed by Wright-Giemsa staining. DNA agarose gel electrophoresis, MTT assay, and spectrophotometric method were conducted to
detect cell apoptosis, effect of Z-VAD-FMK on antitcancer activity of daphnioldhanin E, and activity changes of caspase-3,
respectively. Results Wright-Giemsa staining demonstrated that the volume of HepG2 cell increased after 48 h treatment with
daphnioldhanin E, the nucleus was clearly visible and surrounded by a large number of cytoplasmic vacuoles, while the cell membranes
remained intact. DNA ladder electrophoresis resulted in a large number of small fragments of 50—200 bp; MTT assay displayed that
Z-VAD-FMK could not block the inhibition of daphnioldhanin E on the proliferation of HepG2 cells; Spectrophotometric results
demonstrated that caspase-3 activity of HepG2 cells had no obvious change compared with the control group, which indicated that the
lethal effect of daphnioldhanin E on HepG2 cells was unrelated to caspase-3 activation pathway. Conclusion Daphnioldhanin E
could induce the programmed death of HepG2 cells by paraptosis and the process is not dependent on the caspase-3 pathway.
Key words: Daphniphyllum oldhami (Hemsl.) Rosenth.; daphnioldhanin E; HepG2 cell; paraptosis; caspase-3

虎皮楠科（Daphniphyllaceae）只有虎皮楠属
Daphniphyllum Bl. 1 个属，其主要特征成分是生物
碱类，这类化合物因具有多变的骨架和复杂的多
环结构而备受关注，从该科植物中分离得到的生
物碱已超过 120 种，包括牛耳枫碱、虎皮楠碱和
虎皮楠宁等[1]。研究表明，虎皮楠 Daphniphyllum
oldhami (Hemsl.) Rosenth. 中某些生物碱对肿瘤细
胞有抑制作用[2-3]。本课题组曾采用多种色谱方法
从虎皮楠茎叶乙醇提取物中分离得到 8 种生物碱
类成分，并对其化学结构和抗肿瘤活性进行了系
统研究，结果表明 daphnioldhanin E 对人肝癌
HepG2 细胞增殖具有良好的抑制作用[4]。本实验通
过细胞形态学观察、DNA 琼脂糖凝胶电泳、MTT 法
及蛋白酶学分析等方法，初步探讨 daphnioldhanin E
抗肿瘤的作用机制，为其进一步的生物活性研究
奠定实验基础。

收稿日期：2011-10-08
作者简介：王 蓓（1978—），女，讲师，研究方向为肿瘤免疫及抗感染免疫。Tel: (0312)5075533 E-mail: wp780203@163.com
*通讯作者 曹志然 Tel: (0312)5075533 E-mail: caozhiran@163.com
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1 材料
1.1 药品与试剂
虎皮楠生物碱 daphnioldhanin E，质量分数
99.9%，河北大学生命科学学院提供。瑞姬氏染料，
Amresco 公司；细胞凋亡-DNA Ladder 抽提试剂盒、
DNA Ladder（BeyoRed）、DNA 上样缓冲液、caspase
抑制剂 Z-VAD-FMK、蛋白激酶 C（PKC）抑制剂
星形孢菌素（staurosporine）、Bradford 蛋白浓度测
定试剂盒、caspase-3 活性检测试剂盒均为碧云天生
物技术研究所产品。
1.2 细胞株
人肝癌 HepG2 细胞株，中国医学科学院药物研
究所提供。
1.3 主要仪器
CKX41 倒置相差显微镜，日本 Olympus 公司；
DYY—11B 电泳仪，北京市六一仪器厂；Fotodyne
型凝胶成像系统，美国 Image 公司。
2 方法
2.1 细胞培养
采用 RPMI 1640 完全培养液，将 HepG2 细胞
用贴壁细胞培养方法培养。取 5×105/mL HepG2 细
胞接种于 100 mL 培养瓶中，在 37 ℃、饱和湿度、
5% CO2 条件下培养，每 2 天换液 1 次，待细胞密度
达到 80%时，胰酶消化细胞，按 1∶2 比例传代，3～
4 d 传代 1 次，收集对数生长期的细胞进行实验。
2.2 瑞姬氏染色观察 HepG2 细胞形态学变化
设对照组和 daphnioldhanin E 低、高质量浓度
组。分别取对数生长期 HepG2 细胞，调整细胞密度
为 1×105/mL，接种于预置盖玻片的 24 孔板中，每
孔 1 mL，37 ℃恒温、恒湿、5% CO2的培养箱中孵
育 24 h 后，2 个给药组分别换成 daphnioldhanin E
终质量浓度为 10、30 μg/mL 的 RPMI 1640 完全培
养液，对照组加入等体积的含 0.1% DMSO 的 RPMI
1640 完全培养液。继续培养 48 h，弃去上清液后将
盖玻片取出，用 PBS 洗 2 次，室温晾干，瑞姬氏染
液染色，光镜下（×400）观察细胞形态。
2.3 DNA 琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡
设对照组和 daphnioldhanin E 低、高质量浓度
组。分别取对数生长期 HepG2 细胞 l×106 个，接种
于 100 mL 培养瓶中，置于 37 ℃恒温、恒湿、5% CO2
的培养箱孵育 24 h。弃上清液，对照组加入含 0.1%
DMSO 的 RPMI 1640 完全培养液，2 个给药组分别
加入 daphnioldhanin E 终质量浓度为 10、30 μg/mL
的 RPMI 1640 培养液，继续培养 24 h，收集细胞，
DNA ladder 抽提并进行电泳，Bio-Rod 凝胶成像系
统保存电泳结果。
2.4 MTT 法检测细胞凋亡抑制剂 Z-VAD-FMK 对
daphnioldhanin E 抗癌活性的影响
设对照组，阳性对照组，Z-VAD-FMK＋星形孢
菌素组， daphnioldhanin E 10、 30 μg/mL 组，
daphnioldhanin E（10、30 μg/mL）＋Z-VAD-FMK
组，每组均设 3 个复孔，实验重复 3 次。将 HepG2
细胞以 8×104/mL 密度接种于 96 孔板中，每孔 100
μL，37 ℃培养 24 h，细胞贴壁后，吸弃上层培养基，
对照组每孔加入含 0.1% DMSO 的 RPMI 1640 完全
培养液 100 μL，阳性对照组每孔加入星形孢菌素（5
μmol/L）10 μL 及 RPMI 1640 完全培养液 90 μL，
Z-VAD-FMK＋星形孢菌素组加入星形孢菌素（5
μmol/L）和 Z-VAD-FMK（20 μmol/L）各 10 μL 及
RPMI 1640 完全培养液 80 μL，daphnioldhanin E 10、
30 μg/mL 组分别加入相应药物各 10 μL 及 RPMI
1640 完全培养液 90 μL，daphnioldhanin E＋Z-VAD-
FMK 组分别加入 10、30 μg/mL 的 daphnioldhanin E
与 Z-VAD-FMK（20 μmol/L）10 μL 及 RPMI 1640
完全培养液 80 μL，37 ℃、5% CO2 培养 24 h。终止
培养前 4 h 每孔加入 MTT（5 mg/mL）10 μL，继续
培养 4 h，弃上清，每孔加入 DMSO 100 μL，振荡
5 min，待结晶物充分溶解后，用酶标仪（波长 490
nm）测定各孔吸光度（A）值。按照公式计算细胞
增殖抑制率（IR）。
IR＝1－A 处理组/A 对照组
2.5 Caspase-3 酶活性测定
设对照组、阳性对照组和 daphnioldhanin E 给药
组。取对数生长期 HepG2 细胞 l×106个，对照组加
入含 0.1% DMSO 的 RPMI 1640 完全培养液，阳性
对照组加入含星形孢菌素（5 μmol/L）的 RPMI 1640
完全培养液，给药组加入终质量浓度为 30 μg/mL 的
daphnioldhanin E 的 RPMI 1640 完全培养液，培养 24
h 后收集细胞，提取蛋白，Bradford 法测定蛋白的量，
分光光度法检测各组 caspase-3 酶活性。
2.6 数据处理
所有数据处理采用 SPSS 16.0 软件，采用单因
素方差分析和 t 检验，数据以 ±x s 表示。
3 结果
3.1 对 HepG2 细胞形态的影响
HepG2 细胞经 daphnioldhanin E 10 μg/mL 处理
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48 h 后，细胞体积增大，胞质内细胞核周围出现大
量空泡，但细胞膜及细胞核仍保持完整；而经
daphnioldhanin E 30 μg/mL 处理后，细胞破坏严重，
细胞膜完整性遭到破坏，胞浆内有空泡形成，细胞
核破碎且密度降低。结果见图 1。
3.2 对 HepG2 细胞凋亡的影响
Daphnioldhanin E 10 μg/mL 作用于 HepG2 细胞
后，电泳图中出现了大量 50～300 bp 小片段，而经
daphnioldhanin E 30 μg/mL 作用后，未见特征性的
DNA 梯状条带。结果见图 2。
3.3 Z-VAD-FMK 对 daphnioldhanin E 抗癌活性
的影响
阳性对照组星形孢菌素与 HepG2 细胞作用 24 h
后，IR 为（66.206±0.106）%；Z-VAD-FMK＋星形
孢菌素组 IR 为（0.187±0.015）%。与阳性对照组
相比，Z-VAD-FMK＋星形孢菌素组 A 值明显增大

图 1 各组 HepG2 细胞瑞姬氏染色形态学观察
Fig. 1 Morphology of HepG2 cells in each group by Wright-Giemsa staining

图 2 Daphnioldhanin E作用24 h HepG2细胞DNA电泳结果
Fig. 2 DNA electrophoresis of HepG2 cells treated
by daphnioldhanin E for 24 h
（P＜0.05)，而与对照组相比则无明显差异，表明
Z-VAD-FMK 对星形孢菌素细胞凋亡诱导作用产生
抑制。在 daphnioldhanin E 存在的情况下，加入或
不加入 Z-VAD-FMK，对 daphnioldhanin E 的 IR 无
明显影响，表明 daphnioldhanin E 对 HepG2 细胞的
杀伤作用与 caspase 激活通路无关。结果见表 1。
3.4 对 caspase-3 酶活性的影响
对照组、daphnioldhanin E 30 μg/mL 组和星形孢
菌素组 HepG2 细胞 caspase-3 酶活力分别为 0.038 0、
0.048 7 、 0.200 9 U/μg 。结果见图 3 。表明
daphnioldhanin E 对 HepG2 细胞 caspase-3 酶活力无
显著影响。
表 1 Z-VAD-FMK 对 daphnioldhanin E 抗癌活性的影响 ( ± = 3x s , n )
Table 1 Effects of Z-VAD-FMK on anticancer activities of daphnioldhanin E ( ± = 3x s , n )
组 别 给药量 / (μmol·L−1) A 值 IR / %
对照 － 0.349±0.011
星形孢菌素 5 0.117±0.002▲ 66.206±0.106
星形孢菌素＋Z-VAD-FMK 5＋20 0.349±0.013* 0.187±0.015*
daphnioldhanin E＋Z-VAD-FMK 10＋20 0.140±0.011▲ 59.276±0.111
30＋20 0.126±0.004▲ 63.266±0.110
daphnioldhanin E 10 0.133±0.001▲ 61.296±0.112
30 0.126±0.005▲ 63.306±0.113
与星形孢菌素组比较：*P＜0.05；与对照组比较：▲P＜0.05
*P < 0.05 vs staurosporine group; ▲P < 0.05 vs control group

对照 daphnioldhanin E 10 μg·mL−1 daphnioldhanin E 30 μg·mL−1

对照 10 30 marker
daphnioldhanin E / (μg·mL−1)
100 bp
500 bp
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与对照组比较：*P＜0.05
*P < 0.05 vs control group
图 3 Daphnioldhanin E 对HepG2 细胞 caspase-3 活性的影响
( 3=± n , sx )
Fig. 3 Effect of daphnioldhanin E on caspase-3 activity
in HepG2 cells ( 3=± n , sx )
4 讨论
牛耳枫、交让木和虎皮楠 3 种虎皮楠科植物为
我国传统的民间药用植物，常以根、叶入药，其味
苦涩，入药后内服外敷，具有清热解毒、活血化瘀、
清肿止痛的功效。虎皮楠科生物碱类化合物对多种
肿瘤细胞有抑制作用，但有关其抗肿瘤作用机制的
研究较少。本实验结果表明，人肝癌 HepG2 细胞经
低质量浓度的 daphnioldhanin E 处理后，细胞体积增
大，细胞核清晰可见，周围出现了大量的胞浆空泡，
但细胞膜仍保持完整；而随着其质量浓度的增加与
作用时间的延长，细胞膜完整性受到破坏，最终导
致细胞核破碎，且伴随着整个细胞的密度大幅降低，
从形态学观察结果推断daphnioldhanin E诱导HepG2
细胞死亡的方式与类凋亡（paraptosis）相似。类凋亡
是近年来发现的一种新的程序性细胞死亡方式[5-7]，
其典型特征是细胞肿胀以及由于线粒体和内质网肿
胀所造成的胞浆空泡化，但细胞膜仍保持完整。类
凋亡在形态学上与凋亡的区别是缺少染色质的新月
形凝集和凋亡小体，而与坏死的区别是细胞膜未遭
到破坏[8-10]。通过琼脂糖凝胶电泳观察染色质 DNA
降解情况，认为细胞凋亡的 DNA 降解片段规则，
呈特征性的 DNA 梯形分子条带（片段大小 180～
200 bp）；细胞坏死的 DNA 降解片段较大，且不甚
规则，未见典型的梯状 DNA 条带；而类凋亡的降
解片段不规则，可能出现 50～300 bp 的 DNA 片段，
亦未见典型的梯状 DNA 条带[11-12]。在本实验中琼
脂糖凝胶电泳表明，daphnioldhanin E 10 μg/mL 作
用 HepG2 细胞 24 h 后，电泳中出现了大量 50～200
bp 小片段，这表明 daphnioldhanin E 更可能是以类
凋亡方式诱导 HepG2 细胞死亡。
根据激活 caspase 的启动因素不同，细胞凋亡激
活途径分为 3 种，第一种是内源性途径或线粒体途
径，主要由细胞色素 C 启动，导致 caspase-9 的激活；
第二种是外源性途径或死亡受体途径，主要由细胞
表面死亡受体启动，导致 caspase-8 的激活；第三种
是内质网途径，主要是内质网应激反应，导致
caspase-12 的活化，后者再激活 caspase-9。上述 3 种
途径均通过激活 caspase-3 最终导致细胞凋亡[13-14]。
Caspase 蛋白酶抑制剂可抑制细胞经凋亡途径死亡，
而类凋亡细胞则不受凋亡抑制剂的影响。Z-VAD-
FMK 是一种最常用的细胞凋亡抑制剂，可以穿透细
胞膜，抑制由 caspase 激活而导致的细胞凋亡。星
形孢菌素是一种广谱的细胞凋亡诱导剂，可以通过
细胞膜，抑制蛋白激酶 C，从而诱导细胞凋亡[15-16]。
本实验结果显示，daphnioldhanin E 的细胞凋亡诱导
作用未受 Z-VAD-FMK 的影响，对 HepG2 细胞的杀
伤作用明确；同时，daphnioldhanin E 处理组与对照
组 HepG2 细胞 caspase-3 酶活力无明显差异，表明
细胞死亡过程中 caspase-3 未被活化。这些都进一步
证明了 daphnioldhanin E 可能通过类似类凋亡的方
式，而非 caspase-3 依赖途径诱导 HepG2 细胞程序
性死亡。Daphnioldhanin E 的抗肿瘤机制是否与其
类凋亡方式诱导肿瘤细胞程序性死亡有关，还有待
进一步深入研究。
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0.10
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