全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 16 期 2013 年 8 月

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红树林植物杯萼海桑法呢基焦磷酸合酶的基因克隆及序列分析
王 峰 1, 2，吴秋红 1，高 辉 1，张自德 1，李秀英 1，张 光 1*
1. 暨南大学药学院 基因组药物研究所，广东 广州 510632
2. 中药药效物质基础及创新药物研究广东省高校重点实验室，广东 广州 510632
摘 要：目的 对杯萼海桑 Sonneratia alba 萜类化合物生物合成途径的关键酶法呢基焦磷酸合成酶（Farnesyl pyrophosphate
synthase，FPS）基因的编码 cDNA 序列进行克隆，为研究杯萼海桑萜类化合物生物合成与基因调控奠定基础。方法 结合
杯萼海桑根的转录组注释，根据编码区序列设计引物，通过 PCR 方法克隆杯萼海桑 FPS（SaFPS）基因的编码区 cDNA。结
果 PCR 扩增了一个长 1 029 bp 的基因片段，该片段编码由 342 个氨基酸组成的 SaFPS。同源性比对结果显示基因编码蛋
白与甘草的 FPS 具有氨基酸一致性达 86%。其具有异戊烯基转移酶的 2 个典型保守功能域。进化树分析结果显示，与甘草
Glycyrrhiza uralensis、苜蓿 Medicago truncatula 、羽扇豆 Lupinus albu 具有较近的亲缘关系。实时荧光定量 PCR 结果显示
SaFPS 基因在花中表达量较高，果实、茎、叶中表达量相对较低。结论 首次从红树林植物杯萼海桑中克隆 FPS 基因获得
其编码区序列，SaFPS 基因具有组织表达特异性。本研究为分析基因表达特性及其在生物合成中的功能奠定基础。
关键词：法呢基焦磷酸合成酶；杯萼海桑；基因克隆；PCR；序列分析
中图分类号：R282.6 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2013)16 - 2294 - 06
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2013.16.020
Cloning and sequence analysis of Farnesyl pyrophosphate synthase gene
in a mangrove tree Sonneratia alba
WANG Feng1, 2, WU Qiu-hong1, GAO Hui1, ZHANG Zi-de1, LI Xiu-ying1, ZHANG Guang1
1. Institute of Genomic Medicine, College of Pharmacy, Jinan University, Guangzhou 510632, China
2. Guangdong Province Key Laboratory of Pharmacodynamic Constituents of TCM and New Drugs Research, Jinan University,
Guangzhou 510632, China
Abstract: Objective To clone the full length cDNA encoding Farnesyl pyrophosphate synthase (FPS) which played an important role
in terpenoid biosynthesis pathway in Sonneratia alba and to provide the basis for the further studies on biosynthesis and gene
regulation of terpenoid. Methods According to the annotation of root transcriptome in S. alba, primers were designed and cDNA of S.
alba Farnesyl pyrophosphate synthase (SaFPS) gene was cloned from S. alba by PCR. Results The complete coding sequence of
SaFPS gene was 1 029 bp and encoded a protein of 342 amino acids. The deduced SaFPS amino acid sequence exhibited 86% identity to
the FPS of Glycyrrhiza uralensis. The predicted SaFPS shared two conserved functional domains. Phylogenetic analysis on the amino acid
sequence of SaFPS with those of other plants showed that SaFPS was closely related to G. uralensis, Medicago truncatula, and Lupinus
albus. It showed that SaFPS was highly expressed in flowers while lowly expressed in fruits, stems, and leaves by real-time PCR analysis.
Conclusion The SaFPS gene is cloned from a mangrove tree S. alba for the first time and the expression of SaFPS is tissue specific. This
research lays a foundation for studying the gene expression pattern and regulating the functions of SaFPS in terpenoid biosynthesis.
Key words: Farnesyl pyrophosphate synthase; Sonneratia alba J. Smith; gene cloning; PCR; sequence analysis

红树林是生长在热带、亚热带海岸潮间带的木
本植物群落[1]。杯萼海桑 Sonneratia alba J. Smith 为
海桑科（Sonneratiaceae）海桑属 Sonneratia L. f. 红
树林植物，分布广泛，是整个海桑属 8 个种中分布
最广的一个种。由于其独特的生长环境，如处于高
盐度的水陆临界处，根部长期缺氧，常年接受热带、
亚热带高强光照射等，常常能够产生一些化学结构
新颖，生物活性多样的先导化合物，为新药研究与
开发提供资源。民间利用海桑成熟的浆果生产软饮
料，海桑的果实捣烂成糊状，可以治疗扭伤，其叶、

收稿日期：2013-03-23
作者简介：王 峰（1979—），博士，副研究员，主要从事生物技术药物研究。
*通信作者 张 光，实验师，主要从事生物技术药物研究。Tel: (020)38375022 E-mail: 24547680@qq.com
网络出版时间：2013-07-05 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/12.1108.R.20130705.1530.005.html
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花和果实作为内科用药[2]。
萜类化合物是植物初生代谢产物和次生代谢产
物的重要成分，影响植物生长发育和品质形成，同时
萜类化合物在植物自身免疫和防御反应中起重要作
用，具有重要的药用价值。而在红树林植物中萜类化
合物是其中量较高、种类较多的一类化合物[3]。法呢
基焦磷酸合酶（Farnesyl pyrophophate synthase，FPS，
EC21511110）是一种异戊烯基转移酶，是类异戊二烯
途径的一个关键酶，它催化五碳原子的异戊烯基焦磷
酸（IPP）和二甲基丙烯基焦磷酸（DMAPP）以 1～
4 头尾连续缩合反应，形成 15 碳的法呢基焦磷酸
（FPP）[4-5]，目前已经从三七[6]、罗汉果[7]、棉花[8]等
40 多种植物中分离并克隆了 FPS 的 cDNA 序列。
目前对红树林植物中萜类化合物的提取分离多
有报道，但对萜类化合物生物合成途径的相关酶的
克隆未见国内文献报道。实验克隆了杯萼海桑 FPS
（SaFPS）基因，并通过生物信息学方法初步分析了
酶的生物功能，为进一步研究重组 SaFPS 的体外活
性以及后期的转基因研究和萜类化合物生物合成与
基因调控奠定了基础。
1 材料与试剂
杯萼海桑 Sonneratia alba J. Smith 取自中山大学，
由笔者鉴定；PCR 纯化试剂盒、质粒提取试剂盒购自
北京康为世纪生物科技公司；Taq 聚合酶、pMD-18T、
cDNA Synthesis Kit 购自 Takara 公司；抗生素购自鼎
国公司；引物合成于上海英骏公司；其他试剂均为国
产分析纯。
2 方法
2.1 引物设计
根据 Chen 等[9]的研究中已获得的杯萼海桑的
转录组序列，按照引物设计原则，采用引物设计软
件 Primer 6.0，对杯萼海桑转录组序列中的 FPS 基
因序列设计引物。正向 FP：5’-ATGGCGGATCTCA-
AATCGAAGT-3’，反向 RP：5’-CTACTTCTGCCT-
CTTGTAGATTTTGCT-3’。
2.2 RNA 提取及反转录
采用改良后的 CTAB 法进行。总 RNA 的完整
性和纯度通过 EB-琼脂糖凝胶电泳和核酸蛋白定量
仪（Bio-Rad）检测。取 1 μg 总 RNA，以 Oligo（dT）
为引物，按 M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit 说明
操作，反转录生成 cDNA。
2.3 PCR 扩增及克隆
PCR 反应体系为 10×缓冲液 8 μL，10 mmol/L
dNTP 8 μL，20 μmol/L FP 2 μL，20 μmol/L RP 2 μL，
cDNA模板 1 μL，Ex Taq聚合酶 4 μL，加水至 80 μL。
PCR 反应条件如下：94 ℃预变性 5 min 后，进行
32 个循环，程序为：94 ℃变性 30 s，61 ℃退火
30 s 和 72 ℃延伸 1 min。扩增产物经 0.8%琼脂糖
凝胶电泳分析和胶回收纯化连接至 pMD-18T 载体，
并用 CaCl2法转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞，涂
布于含有氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）的 LB 培
养基平板，37 ℃培养过夜。所得转化子用质粒提取
试剂盒提取质粒 DNA，重组子经质粒 PCR 鉴定后
送交上海英骏公司测序。
2.4 FPS 序列生物信息学分析
分析测序结果，推导开放读码框架（open
reading frame，ORF）及编码蛋白的氨基酸序列，
利用 ProtParam、DAS TMfilter 和 ProtScale 进行编
码蛋白的各种基本理化特性、跨膜结构域和疏水性
分析，利用 NCBI（www.ncbi.nih.gov）的 BLAST
在线分析工具分别对 GenBank 的非冗余核酸数据
库和非冗余蛋白数据库序列进行比对分析。采用
Clustalx 和 Phylip-3.69 进行序列多重比较及系统进
化树构建。并用 SOPMA 和 SWISS-MODEL 对该蛋
白进行二级结构和三维结构预测。
2.5 杯萼海桑不同组织中 FPS mRNA 水平表达分析
应用 IQTM Multicolor Real-Time PCR 仪，以
Actin 为内参基因，检测样品中 FPS 基因的相对表
达量。以杯萼海桑叶、茎、花、果 cDNA 为模板，
利用 Primer Primer 6.0 设计序列特异的 Real-Time
PCR 引物，进行 PCR 扩增。Actin RT-FP：5’-GAG-
GTTCCGATGTCCAGAAGTCC-3’，Actin RT-RP：5’-
GCCTCCACTGAGCACGATGTTAC-3’ ， FPS RT-
FP：5’-TTGGTGATCCCACGACTATTGG-3’，FPS
RT-RP：5’-CGACATTTGAAGCGTCAGGTTT-3’。
利用 SYBR Green I PCR Master Mix 配制 Real-Time
PCR 反应体系：cDNA 9 μL，上下游引物各 0.5 μL，
SYBR Mix 10 μL，总体积 20 μL。反应程序：95 ℃、
30 s；95 ℃、5 s，60 ℃、20 s，40 个循环。通过分
析溶解曲线考察 Real-Time PCR 反应的特异性，利
用 2−ΔΔCt 相对定量的方法来检测 FPS 基因在不同组
织中的表达水平。
3 结果与分析
3.1 总 RNA 的质量
取 2 μL 提取的样品 RNA 用 RNase-free 水稀释
10 倍，用蛋白核酸分析仪测定，A260/A280＝1.977，
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该比值接近于 2.0，说明提取的 RNA 纯度较高。总
RNA 经电泳检测后可观察到清晰明亮的 28 S rRNA
和 18 S rRNA 条带以及一些细胞器 rRNA 条带，条
带都无拖尾，RNA 提取效果较好。
3.2 SaFPS 基因的克隆
RT-PCR 扩增产物经电泳后呈现出 1 条长约 1.1
kb 左右的单一特异性片段（图 1），其长度与预期大
小相符，经过测序得到了 SaFPS 基因的编码序列
（图 2），测序结果已提交至 GenBank，登录号为
JX681145。
3.3 序列生物信息学分析
测序所得到的 SaFPS基因编码序列长 1 092 bp，

M-Marker 1-箭头所指处为 SaFPS PCR 扩增产物
M-Marker 1-arrow indicates SaFPS PCR amplification product
图 1 SaFPS 基因的 PCR 扩增
Fig. 1 PCR amplification of SaFPS gene


图 2 SaFPS 的编码区序列和氨基酸序列
Fig. 2 Coding sequence and amino acid sequence of SaFPS
其编码的 SaFPS 蛋白包含 342 个氨基酸残基，相对
分子质量为 4.31×104，其中量最丰富的氨基酸是亮
氨酸（Leu），占 13.5%，量最少的氨基酸是色氨酸
（Trp），占 1.5%，理论等电点为 5.56。用 DAS TMfilter
在线工具对氨基酸序列的跨膜结构域进行预测，结
果表明 SaFPS 不存在跨膜结构域。结合转运肽的预
测推断，SaFPS 在细胞质中合成前体蛋白后，不进
入其他亚细胞器，而是留在细胞质中，经过翻译后
蛋白质加工成为成熟蛋白质发挥催化作用，而不与
膜脂结合。用疏水性分析结果表明，SaFPS 在 309
位 Arg 亲水性最强（−2.778），第 202 位 Glu 疏水性
最强（2.444）。整个多肽链表现为亲水性，没有明
显的疏水区域。综合前述跨膜结构域的预测结果，
可以推断 SaFPS 不存在明显的疏水区域，与植物
FPS 不存在跨膜结构域相一致。
用 ClustalX 程序对 SaFPS 的氨基酸序列与甘草
Glycyrrhiza uralensis、苜蓿 Medicago truncatula L.、
羽扇豆 Lupinus albu L.、苹果 Malus pumila Mill. 等
多种植物 FPS 的氨基酸序列进行多序列比对，结果
表明（图 3）各物种 FPS 氨基酸序列高度保守，SaFPS
与甘草 FPS 的氨基酸一致性达 86%。FPS 具有 2 个
富含天冬氨酸 Asp 保守域（DDXXD），这 2 个天冬
氨酸保守域（Asp-motif）被认为是烯丙基转移酶与底
物异戊烯基焦磷酸相结合的位点[10]。由 SaFPS 基因

2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
1 M
扩增产物

1
91
181
271
361
451
541
631
721
811
901
991
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▲表示天冬氨酸保守域
▲indicates Asp-motif
图 3 不同物种 FPS 氨基酸序列对比
Fig. 3 Alignment of FPS amino acid sequences for different species
推测肽链中含有 93～97 氨基酸残基（DDIMD）和
232～236 氨基酸残基（DDYLD），这一结果暗示功
能结构域在分子进化中具有较高的稳定性。为了进
一步研究杯萼海桑与其他植物FPS基因的亲缘关系，
用 Phylip-3.69 软件采用邻接距离（neighbour joining，
NJ）法构建系统发生进化树（图 4），可以看出 SaFPS
与甘草、苜蓿、羽扇豆 FPS 亲缘关系较近。
运用 SOPMA 软件预测 SaFPS 蛋白的二级结
构，表明该蛋白含有 219 个 α 螺旋（alpha helix），
占 64.04%；18个延伸链（extended strand），占 5.26%；
18 个 β 折叠（beta turn），占 5.26%；87 个无规则蜷
曲（random coil），占 25.44%。利用 SWISS-MODEL
提交 FPS 蛋白序列，在蛋白质结构库中搜寻模板，
最终 SaFPS 基因的第 2～342 残基与人的 FPS 蛋白
晶体结构（4demF）序列一致性达到 46.36%，以
4demF 为模板预测了 SaFPS 的三维模型（图 5），可

图 4 不同生物的 FPS 系统进化树
Fig. 4 Phylogenetic tree based on FPS sequences
from different organisms
玉米
银杏
葡萄
甘草
苜蓿
羽扇豆
杯萼海桑
苹果
人参
万寿菊


玉米
银杏
葡萄
甘草
苜蓿
羽扇豆
杯萼海桑
苹果
人参
万寿菊


玉米
银杏
葡萄
甘草
苜蓿
羽扇豆
杯萼海桑
苹果
人参
万寿菊


玉米
银杏
葡萄
甘草
苜蓿
羽扇豆
杯萼海桑
苹果
人参
万寿菊
316
390
341
342
342
342
342
342
342
395
8
78
30
30
30
30
30
30
30
84


110
184
135
136
136
136
136
136
136
189


216
290
241
242
242
242
242
242
242
295
20 40 60 80 100
120 140 160 180 200
220 240 260 280 300
320 340 360 380 400
697 596
878
413
1 000
704
732
376 867
405
932
424
185
633
苹果 (AAM08927.1)
葡萄 (AAX76910.1)
东方泽泻 (ADV03674.1)
短柄草 (XP_003569616.1)
玉米 (ACN27686.1)
马尾杉 (AFO53558.1)
红豆杉 (AAS19931.1)
银杏 (AAR27053.1)
黄花蒿 (AAD17204.1)
万寿菊 (AEY78646.1)
人参 (AAY87903.1)
杜仲 (AAN62522.1)
杯萼海桑
羽扇豆 (P49352.1)
苜蓿 (XP_003594327.1)
甘草 (ADE18770.1)
毛果杨 (ABK95166.1)
黄龙胆 (BAA88844.1)
大戟 (ACN63187.1)
橡胶树 (ABR09548.1)
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见 FPS 在空间布局上是由 α 螺旋形成的“大空穴”
立体结构，其酶促反应是在空穴中进行。
3.4 不同组织中 SaFPS mRNA 水平表达分析
Real-Time PCR 结果显示（图 6），FPS 基因在
杯萼海桑各组织中均有表达，其中在花中表达量较
高，果实、茎、叶中表达量相对较低。该结果与
Cunillera 等研究结果相符，说明该基因具有组织表
达特异性[11-12]。

图 5 SaFPS 的三维模型
Fig. 5 3D model of SaFPS

图 6 不同组织 SaFPS mRNA 水平表达分析
Fig. 6 Expression of SaFPS mRNA in different tissues
4 讨论
FPS 是植物萜类物质合成过程中的一个关键
酶，在类异戊二烯合成途径中发挥着极其重要的作
用，其活性与量的高低决定后续产物量的高低。类
异戊二烯途径是植物体内一条重要的次生物质代谢
途径，多种与生长发育相关的激素（赤霉素、脱落
酸、细胞分裂素）以及类胡萝卜素、质体醌、甾体
和皂苷等各种萜类次生物质的生物合成都与该途径
密切相关[13]。随着植物萜类合成途径中相关酶的分
离鉴定，利用酶表达改变萜类物质组成或量已成为
改变作物及中药品质的一种新手段[14]。
近年来FPS基因在植物中克隆表达以及转基因
的研究非常多，比如在转基因青蒿中过量表达亚洲
棉或青蒿的 FPS 基因，转基因株系中青蒿素量均有
一定提高[15-16]；转入薄荷 FPS 基因的转基因烟草对
赤星病抗性明显提高[17]。以上的研究报道表明将
FPS 基因进行克隆对于提高中药活性成分的量或作
物品质具有十分重要的作用。
本研究首次从红树林植物杯萼海桑中成功分离
克隆 FPS 基因，生物信息学分析序列的结果表明，
该基因的氨基酸序列具有植物 FPS 的 2 个保守核心
区 DDIMD 和 DDYLD，在氨基酸水平与甘草的 FPS
基因具有最高的同源性，一致性为 86%，推测 SaFPS
基因与其他作物的FPS基因可能行使相同或相似的
生物学功能，参与体内重要萜类化合物的生物合成
过程。研究结果为后期的实验研究提供了一定的理
论参考，并为萜类化合物生物合成与基因调控奠定
基础。然而，克隆所得到的基因能否通过植物转基
因技术提高萜类化合物的有效成分还有待于进一步
研究。
志谢：中山大学生命科学学院周仁超副教授在
实验材料和文章修改方面提供帮助！
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Asp-motif

1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0 花 叶 茎 果实
Sa
FP
S
相
关
表
达

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