全 文 ：广 西 植 物 Guihaia　Nov．２０１３,３３(６):８４６－８５１　　　　　　　　　　 http://journal．gxzw．gxib．cn　
DOI:１０．３９６９/j．issn．１０００Ｇ３１４２．２０１３．０６．０２３
吴秋红,张自德,王峰．红树植物杯萼海桑SAMS基因的克隆与生物信息学分析[J]．广西植物,２０１３,３３(６):８４６－８５１
WuQH,ZhangZD,WangF．CloningandbioinformaticanalysisofSAMSgeneinamangrovetreeSonneratiaalba[J]．Guihaia,２０１３,３３(６):８４６－８５１
红树植物杯萼海桑SAMS基因的
克隆与生物信息学分析
吴秋红,张自德,王　峰∗
(暨南大学 药学院,广州５１０６３２)
摘　要:红树植物杯萼海桑是最耐盐的红树植物之一.SＧ腺苷甲硫氨酸合成酶(SＧadenosylmethioninesynＧ
thetase,SAMS)是SＧ腺苷甲硫氨酸(SＧadenosylmethionine,SAM)生物合成途径的关键酶.SAMS作为一个
逆境胁迫响应蛋白在植物的耐盐调控中发挥着极其重要的作用.本文结合杯萼海桑根的转录组注释,根据编
码区序列设计引物,通过PCR克隆杯萼海桑SAMS基因的编码区cDNA,并对其进行生物信息分析,为研究
杯萼海桑适应逆境的机制奠定理论基础.结果显示PCR扩增了一个长１１８２bp的基因片段,该片段编码由
３９３个氨基酸组成的SＧ腺苷甲硫氨酸合成酶.同源性比对及进化树分析显示杯萼海桑的SAMS 氨基酸序列
进化上相对保守.本研究首次从红树林植物杯萼海桑中克隆SＧ腺苷甲硫氨酸合成酶基因,并获得其编码区序
列,为进一步研究杯萼海桑应对逆境胁迫的分子生物学机制与胁迫相关基因调控网络奠定基础.
关键词:SＧ腺苷甲硫氨酸合成酶;杯萼海桑;基因克隆;序列分析
中图分类号:Q９４３　　文献标识码:A　　文章编号:１０００Ｇ３１４２(２０１３)０６Ｇ０８４６Ｇ０６
CloningandbioinformaticanalysisofSAMSgene
inamangrovetreeSonneratiaalba
WUQiuＧHong,ZHANGZiＧDe,WANGFeng∗
(CollegeofPharmacy,JinanUniversity,Guangzhou５１０６２,China)
Abstract:SonneratiaalbaisoneofthemostsaltＧtolerantmangroves．SＧadenosylmethioninesynthetase(SAMS)which
wasinresponsetoabioticstressesplayedanimportantroleinsalttolerance．InordertostudythebiologicalmechaＧ
nismofS．albaforadaptingstress,thecodingregionofSaSAMSgenewhichcodesakeyenzymeintheSＧadenosylＧ
methionine(SAM)biosyntheticpathwaywasisolated．BasedontheannotationofroottranscriptomeofS．alba,primＧ
erswasdesignedandcDNAofSaSAMSgenewasamplifiedbyPCR．ThecompletecodingsequenceofSaSAMS
genewas１１８２bpanditencodedaproteinof３９３aminoacids．Homologycomparisonandevolutionarytreeanalysis
showedthattheSAMSaminoacidsequenceswererelativelyconservedinplants．TheSaSAMSgenewascloned
fromamangrovetreeS．albaforthefirsttimeandthiswouldfacilitatefurtherinvestigationonmolecularmechanism
ofstresstoleranceandregulationnetworksofstressＧrelatedgenesinS．alba．
Keywords:SAMS;Sonneratiaalba;genecloning;sequenceanalysis
　　红树林是生长在热带、亚热带海岸潮间带的木
本植物群落.在各种非生物胁迫逆境中,低温胁迫、
盐胁迫对其影响较为突出,成为影响其生长发育的
主要限制因子(李玫等,２００９).杯萼海桑是红树林
收稿日期:２０１３Ｇ０３Ｇ２８　修回日期:２０１３Ｇ０６Ｇ２５
基金项目:国家自然科学基金(３０７００７０４)
作者简介:吴秋红(１９８７Ｇ),女,山东菏泽人,硕士,主要从事生物制药研究,(EＧmail)qiuhong６５０６＠１２６．com.
∗通讯作者:王峰,博士,副教授,从事生物制药研究,(EＧmail)２４５４７６８０＠qq．com.
中的先锋树种,对红树林的扩散有重要作用.它适
应力强,是海桑属植物中耐盐能力最强的树种,也是
所有红树林植物中耐盐能力最强的物种之一(钟才
荣,２００４).因此对杯萼海桑应对逆境胁迫相关基因
进行研究探索具有重要的学术意义和应用价值.
SＧ腺苷甲硫氨酸合成酶(SＧadenosylmethionine
synthetase,SAMS,EC２．５．１．６)作为生物体内重要
的代谢产物,参与了多种生化反应,可以催化甲硫氨
酸和 ATP 反应得到 SＧ腺苷甲硫氨酸(SAM).
SAM有多种生理作用,可参与一些对细胞结构和功
能产生重要影响的反应如转氨丙基、转甲基和转硫
等(张建国等,２００５),另外SAM 还可以作为合成乙
烯(ethylＧene)、甜菜碱(betaine)和多胺(polyamine)
的前体或供体,这些物质在植物体内应对逆境的反
应中发挥着重要作用(周向红等,２０１１),这表明
SAMS是一个逆境胁迫响应蛋白,在植物的耐盐网
络中发挥着极其重要的作用.
近年来,各国学者在美州黑杨(Populusids)、水
稻(Oryzasativa)等多种植物上已成功克隆SAMS
基因,并开展了该基因在植物应对逆境和衰老调节
中作用的研究(冯艳飞等,２００１).但红树植物杯萼
海桑的SAMS基因尚无研究报道,它在杯萼海桑逆
境生理中的调节作用及影响并不清楚.本项目对此
进行研究并获得了SaSAMS 基因的完整编码序
列,为后续研究奠定了基础.
１　材料和方法
１．１材料
杯萼海桑采自中山大学;PCR纯化试剂盒、质
粒提取试剂盒购自北京康为世纪生物科技公司;
pMDＧ１８T、cDNASynthesisKit购自Takara公司;引
物合成于上海英骏公司;其它试剂均为国产分析纯.
１．２方法
１．２．１引物设计　根据Chenetal．(２０１１)的研究中
已获得的杯萼海桑的转录组序列,按照引物设计原
则,采用引物设计软件Primer５．０,对杯萼海桑转录
组序列中的SaSAMS 基因序列设计引物.正向
SaSAMSＧFP:５′ATGGAGAGCTTCCTATTCACＧ
CTCAG３′,反 向 SaSAMSＧRP:５′TTAAGACTＧ
GAGGCTTCTCCCACTTG３′.
１．２．２杯萼海桑叶总RNA提取及cDNA合成　采
用改良后的CTAB法进行.总RNA的完整性和纯
度通过 EBＧ琼脂糖凝胶电泳和核酸蛋白定量仪
(BioＧRad)检测.取１μg总RNA,以 Oligo(dT)为
引物,按 MＧMLVRTasecDNASynthesisKit说明
操作,通过反转录生成cDNA.
１．２．３SAMS 编码区PCR扩增　PCR反应总体系
为２０μL(体系中含有１０×PCRBuffer２μL,１０
mmol/L dNTP ２ μL,２０ μmol/L 上 游 引 物
SaSAMSＧFP１μL,２０μmol/L下游引物SaSAMSＧ
RP１μL,TaqDNA 聚合酶 ０．５μL 和 ０．５μL
cDNA,另加ddH２O补至２０μL),在PCR仪(EpＧ
pendorf)上进行,PCR条件为９５℃预变性５min,
然后３０个循环(每个循环中９５℃变性３０s,６２℃
退火３０s,７２℃延伸８０s),最后７２℃充分延伸
５min.PCR产物用０．８％琼脂糖凝胶电泳鉴定.
１．２．４SAMS 基因的克隆及序列测定　扩增产物经
０．８％琼脂糖凝胶电泳分析和胶回收纯化连接至
pMDＧ１８T载体,并转化大肠杆菌 DH５α感受态细
胞,用质粒提取试剂盒对所得转化子提取质粒
DNA,重组子经质粒PCR鉴定后送交上海英骏公
司测序.
１．２．５序列的生物信息学分析　分析测序结果,推导
开放读码框架(openreadingframe,ORF)及编码蛋
白的氨基酸序列,利用 ProtParam、ProtScale和
DASTMfilter进行编码蛋白的各种基本理化特性、
疏水性分析和跨膜结构域,利用 NCBI(www．ncbi．
nih．gov)的BLAST在线分析工具分别对GenBank
的非冗余核酸数据库和非冗余蛋白数据库序列进行
比对分析.采用Clustalx和PhylipＧ３．６９进行序列
多重比较及系统进化树构建.并用 SOPMA 和
SWISSＧMODEL对该蛋白进行二级结构和三维结
构预测.
２　结果与分析
２．１总RNA的质量
总RNA核酸凝胶电泳后用核酸蛋白定量仪检
测,可以观察到两条清晰明亮的条带２８SrRNA和
１８SrRNA,另外总RNA的A２６０/A２８０＝２．０６,A２６０/
A２３０＝２．１５,这表明获得的总RNA片段纯度较高,
而且质量能满足后续实验要求.
２．２SaSAMS基因的克隆
RTＧPCR扩增产物经电泳后呈现出１条长约
１２００bp的单一的特异性片段(图２),其长度与预期
７４８６期　　　　　　　吴秋红等:红树植物杯萼海桑SAMS基因的克隆与生物信息学分析
图１　杯萼海桑总 RNA的电泳结果
Fig．１　Electrophoresisresultofextractedtotal
RNAfromSonneratiaalba
大小相符,杯萼海桑SAMS基因的编码序列经双向
测序获得(图３),并将其序列提交至GenBank,获其
登录号是JX５１３３９９.
２．３序列生物信息学分析
测序所得到的杯萼海桑SAMS 基因的编码序
列长１１８２bp,其编码的SaSAMS蛋白包含３９３个
氨基酸残基,分子量为４３．１kDa,含量最丰富的氨基
图２　SaSAMS基因的PCR扩增
M．DL２０００分子标记;１．SaSAMSPCR扩增产物.
Fig．２　PCRamplificationofSAMSgeneinSonneratia
alba　M．DL２０００marker;１．SaSAMSPCRamplificationproduct．
酸是Gly,占９．４％,含量最少的占１．０％,理论等电
点是５．５９.用疏水性分析结果表明:SaSAMS在３５
位Asp亲水性最强(Ｇ２．１６),第３０６位的Val疏水性
最强(１．７８９).分值较高的是亲水性区域,其均匀地
图３　SaSAMS的编码区序列和氨基酸序列
Fig．３　CodingsequenceandaminoacidsequenceofSaSAMS
分布于整个肽链中,分值性较低的是疏水性区域,其
含量较少,说明SaSAMS在一级结构上亲水性为
主,该结果与SaSAMS无跨膜结构域分析相符.信
号肽分析表明SaSAMS不存在信号肽酶切位点,可
以推测,SaSAMS在细胞质中合成后继续留在细胞
质基质中直接作用于代谢产物,并不进行蛋白转运.
将SaSAMS的氨基酸序列与蓖麻(Ricinus
communis),长春花(Catharanthusroseus)等多种
８４８ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３３卷
生物的SAMS进行多序列比对(图４),结果显示一
些与酶活性密切相关的氨基酸残基在这些物种中高
度保守.如 ATP结合位点中的保守的P环基序
(motifploop)GGGAFSGKD(２６９~２７７),以及特
征性的六肽GAGDQG(１２２~１２７)(Kamarthapuet
al．,２００８;Yoonetal．,２００６).另外,SaSAMS除包
含上述高度保守的活性位点之外,还在氨基酸水平
上与 其 它 物 种 的 SAMS 具 有 一 致 性.说 明
SaSAMS与其它物种的SAMS一样,在杯萼海桑的
SAM的生物合成过程中扮演重要的角色,是细胞内
影响生命活动的关键基因.另外发现SaSAMS序
列中除含有多个保守的脯氨酸外,还在一些特殊位
置如３２位、３３４位独有脯氨酸,这可能与它较强的
抗盐性相关.
图４　不同物种SAMS氨基酸序列对比　▲ 特征性六肽;★ 表示ATP结合位点;◆ 表示SaSAMS特有的脯氨酸.
Fig．４　AlignmentofaminoacidsequencesofSAMSforSonneratiaalbaandotherspecies　▲Characteristicsixpeptide;
★ ATPbindingsite;◆characteristicprolineofSaSAMS．
　　用邻接距离法(neighbourjoining,NJ)构建系
统发生进化树(图５).从图５可以看出,除了莱茵
衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)的SAMS单独
成簇外,其它高等植物的SAMS聚类成２大簇,与
Schroderetal．(１９９７)的研究结果相符,这种聚类关
系与植物的分类地位无关.与SaSAMS在亲缘关
系上最接近的是大戟科蓖麻的SAMS,其序列一致
性高达９７％,另外拟南芥长春花等其他高等植物也
与其有较高的序列一致性,介于９０％~９６％,与其
关系最远的莱茵衣藻其序列一致性也达８１％.在
蛋白质水平上SaSAMS与其它生物的SAMS也表
现出较高的一致性,并且种间一致性随着种属关系
的变远稍有降低,充分说明SAMS在进化上相对保
守,其功能对个体生存是必不可缺的.
为了 进 一 步 揭 示 编 码 蛋 白 的 功 能,利 用
SOPMA软件对SaSAMS氨基酸序列进行了二级
结构分析,可以看出该蛋白含有比较丰富的二级结
构,以αＧ螺旋和无规卷曲为主,其中无规卷曲(cc)由
１４６个氨基酸残基组成,占３７．１５％;αＧ螺旋(Hh)由
１４３个氨基酸残基组成,占３６．３９％;βＧ折叠由３７个
９４８６期　　　　　　　吴秋红等:红树植物杯萼海桑SAMS基因的克隆与生物信息学分析
图５　不同生物SAMS系统进化树　用 NJ法构建进化
树,节点前数字表示自举支持率(１０００个复制序列),登录号显
示在括号中.
Fig．５　AphylogenetictreebasedonSAMSsequences　
NJmethodwasusedtoconstructthephylogenetictree．Thenumber
beforethenodeindicatesbootstrapapprovalrating(１０００replicating
sequence)．Accessionnumbersaredisplayedinparentheses．
氨基酸残基组成,占９．３１％.利用SWISSＧMODEL
提交SAMS蛋白序列,在蛋白质结构库中搜寻模
板,最终 SAMS 蛋白的第 ３~３８８ 残基与人的
SAMS蛋白晶体结构 (２P０２)序列一致性达到
６５．５％,以２P０２为模板预测了SaSAMS的三维模
型(图６).
３　结论与讨论
SAMS催化合成的SAM 是甜菜碱、乙烯和多
胺等多种生物合成的甲基供体.近年来研究发现,
多胺与乙烯在植物体内存在较为广泛并发挥重要生
理作用的两类生长调节物质,并且在植物抵抗逆境
(水分胁迫、温度胁迫、盐胁迫等)的反应中扮演重要
角色(师晨娟等,２００６).因此推断SAMS基因在植
物耐胁迫方面可能也发挥一定作用.通过对不同种
属来源的植物SAMS序列分析发现:植物的SAMS
氨基酸序列具有高度的保守性,并且含有多个保守
的脯氨酸.有文献报道,脯氨酸是盐胁迫下易于积
累的一种氨基酸,是盐生植物调节渗透压的一种溶
质(林栖凤等,２０００),这就暗示该基因对植物的生存
尤其是逆境下调节相关基因的表达以适应环境的变
化具有重要意义(Tsutomuetal．,２００３;Johnet
al．,２００３).但脯氨酸的积累究竟是由于盐胁迫引
起植物损伤的征兆,还是耐盐的原因,目前尚不清
楚.由此可见,SAMS中脯氨酸的积累与耐盐性状
的关系还有待进一步研究.
本研究首次克隆出杯萼海桑的SAMS 基因完
整编码序列并用生物信息学预测和分析了SaSAMS
的氨基酸序列、理化性质、疏水性/亲水性、分子系统
进化关系以及二级、三级结构,这为后期的实验研究
提供了一定的理论参考依据,同时对于研究杯萼海
桑以及红树林植物的的逆境胁迫相关生理的分子生
物学机制奠定了基础,另外对进一步研究胁迫相关
基因调控网络来说具有重要的研究价值.
致谢　感谢中山大学生命科学学院周仁超副教
授在实验材料和文章修改方面提供帮助!
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