全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 2 期 2012 年 2 月

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• 药材与资源 •
石豆兰属植物 rDNA ITS 序列的克隆与分析
蒋 明， 陈贝贝, 贺蔡明
台州学院生命科学学院，浙江 临海 317000
摘 要：目的 通过测定 11 种石豆兰属植物的 ITS 序列，为石豆兰属植物分子鉴定和遗传多样性研究提供依据。方法 利
用 PCR 法从叶片基因组 DNA 中克隆 ITS 序列，并借助生物信息学软件对其进行分析。结果 11 种石豆兰属植物的 ITS 全
长为 633～645 bp，5.8 S 序列长度 162 bp，ITS1 和 ITS2 序列变异位点丰富，共 168 个，其中信息位点 95 个，序列存在大
量的转换、颠换和缺失；5.8 S 序列较为保守，仅含 6 个变异位点和 2 个信息位点；11 种石豆兰属植物的遗传距离为 0.002 2～
0.212 0，其中齿瓣石豆兰与斑唇石豆兰之间的遗传距离最小，亲缘关系最为接近。序列已上传至 NCBI，登录号为 JN619409～
JN619419。结论 获得了 11 种石豆兰属植物的 rDNA ITS 序列，为石豆兰属植物分子鉴定和遗传多样性研究奠定了基础。
关键词：石豆兰属；ITS 序列；rDNA；分子鉴定；遗传多样性
中图分类号：R282.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2012)02 - 0343 - 07
Cloning and analysis of rDNA ITS sequences from plants in Bulbophyllum Thouars
JIANG Ming, CHEN Bei-bei, HE Cai-ming
College of Life Science, Taizhou University, Linhai 317000, China
Abstract: Objective To provide the evidence for molecular identification and genetic diversity studies, sequencing and comparison
of ITS sequences from 11 plants in Bulbophyllum Thouars were performed. Methods ITS sequences were cloned from leaf genomic
DNA by PCR and were analyzed using bioinformatics softwares. Results The full ITS and 5.8 S sequences of 11 plants in
Bulbophyllum Thouars were 633—645 and 162 bp in length, respectively. Variable sites were rich in ITS1 and ITS2 sequences with 168
variable sites among which 95 were parsimony information sites. Many transitions, transversions, and deletions were observed. 5.8 S
sequences were conserved and there were only six variable sites and two parsimony information ones. The genetic distance of 11 plants
in Bulbophyllum Thouars ranged from 0.002 2 to 0.212 0. The smallest genetic distance was observed between B. levinei and B.
pectenveneris revealing their closest relationship. Sequences were submitted to the NCBI database under the accession numbers of
JN619409－JN619419. Conclusion rDNA ITS sequences of 11 plants in Bulbophyllum Thouars are obtained which could provide a
foundation for molecular identification and genetic diversity studies.
Key words: Bulbophyllum Thouars; ITS sequence; rDNA; molecular identification; genetic diversity

石 豆 兰 属 Bulbophyllum Thouars 是 兰 科
（Orchidaceae）植物最大的属，全世界约有 1 200
种[1]。我国有 98 种 3 变种，主要分布在华南、西
南地区[2-3]。石豆兰属植物含菲类、联苄、苯丙素、
黄酮、甾体和挥发性成分，具有抗氧化、抗病毒
和抗肿瘤等活性，具滋阴降火、润肺化痰、行气
止痛和生津养胃等功效 [4]，如广东石豆兰 B.
kwangtungense Schltr. 是民间常用的药用植物，可
治疗风热咽痛、肺燥咳嗽、关节疼痛、跌打损伤和
小儿惊风等；齿瓣石豆兰 B. levinei Schlecnt 可用于
治疗高热口渴、乳痈疔肿和急性咽炎等[3]。目前，
对石豆兰属植物的研究主要集中在化学成分[5-9]、组
织培养[10]、生药学[11-12]和授粉生物学[13-15]等方面，
并取得了一定的进展。近年来，在石豆兰属植物的
染色体核型、遗传标记、分子进化和基因克隆等
方面也有少量的报道[16-19]。
石豆兰属植物常与石仙桃属 Pholidota Ldl.、石
斛属 Dendrobium Sw. 和金石斛属 Ephemerantha
Hunt et Summerh. 在市场上作为石斛流通，经过加
工后的药材外形相似，而且由于化学成分方面的研
究报道较少，通过形态和理化性质进行鉴别比较困
难[20-21]。分子生物学技术已成为中药材鉴定的重要
手段，采用 ISSR、RAPD、AFLP 和 ITS 等标记可快
速、准确鉴定植物物种。核糖体 DNA 内转录间隔区

收稿日期：2011-09-17
作者简介：蒋 明（1973—），男，浙江嵊州人，博士，副教授，研究方向为植物发育生物学及其分子调控。E-mail: jiangming1973@139.com
网络出版时间：2011-12-20 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/12.1108.R.20111220.1346.002.html
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（internal transcribed spacer，ITS）序列是常用的分子标
记之一，其长度变异小，进化速率较快，已广泛应
用于植物属内、属间及种内不同居群间的系统发育
分析和分类鉴定[22]。本研究以分布在我国的 11 种
石豆兰属植物为材料，通过克隆、测定核糖体
ITS1-5.8 S-ITS2 的完整序列，利用生物信息学手段
比较其序列特征，为石豆兰属药用植物的分子鉴定
和遗传多样性研究奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料
11 种石豆兰属植物来自浙江、海南、云南、
广西和四川等省区，具体来源见表 1，其中的毛药
卷瓣兰为浙江新记录种。在野外采集健康、完整叶
片，置于冰盒中带回实验室，经无菌 ddH2O 冲洗
表 1 石豆兰属植物来源
Table 1 Sources of plants in Bulbophyllum Thouars
编 号 植物名称 采集地 经度 纬度 海拔 / m NCBI 登录号
1 齿瓣石豆兰 B. levinei 浙江黄岩 120°08′ 28°41′ 276 JN619409
2 黄花卷瓣兰 B. obtusangulum 海南保亭 109°41′ 18°38′ 923 JN619410
3 双叶卷瓣兰 B. wallichii 云南勐腊 101°35′ 21°31′ 1 433 JN619411
4 豹斑石豆兰 B. colomaculosum 云南勐腊 101°35′ 21°31′ 1 730 JN619412
5 芳香石豆兰 B. ambrosia 云南勐腊 101°35′ 21°31′ 1 247 JN619413
6 广东石豆兰 B. kwangtungense 浙江临海 120°58′ 28°50′ 466 JN619414
7 天贵卷瓣兰 B. tianguii 广西乐业 106°22′ 24°51′ 991 JN619415
8 麦穗石豆兰 B. orientale 云南勐海 100°20′ 21°57′ 1 329 JN619416
9 梳帽卷瓣兰 B. andersonii 四川峨眉 103°31′ 29°34′ 698 JN619417
10 斑唇卷瓣兰 B. pectenveneris 浙江黄岩 120°08′ 28°41′ 260 JN619418
11 毛药卷瓣兰 B. merandrum 浙江黄岩 120°08′ 28°41′ 289 JN619419

后于−80 ℃低温冰箱中保存备用。
1.2 基因组 DNA 的提取
DNA的制备采用 SDS法[23]，称取约 0.5 g叶片，
经液氮研磨成粉末后用于 DNA 的提取。
1.3 ITS 序列的克隆、转化和测序
ITS 序列克隆所用的上、下游引物分别为 P1：
5’-AACAAGGTTTCCGTAGGTGA-3’和 P2：5’-TAT-
GCTTAAATTCAGCGGGT-3’。反应在 BIO-RAD
C1000 型 PCR 仪上进行，采用 20 μL 的反应体系，
包括 2 μL 10×PCR 缓冲液（含 20 mmol/L Mg2+），
0.4 μL 0.2 μmol/L dNTP（上海生工生物工程有限公
司），0.5 μL Taq DNA 聚合酶（北京鼎国有限公司），
0.25 μmol/L 的上、下游引物各 0.5 μL，35 ng DNA
模板，ddH2O 补至 20 μL。扩增条件为 95 ℃预变性
5 min，94 ℃变性 30 s，55 ℃退火 45 s，72 ℃延
伸 70 s；循环 32 次；72 ℃延伸 7 min。
PCR 产物用 DNA 凝胶回收试剂盒回收、纯化，
操作按其提供的说明书进行。各取 5 μL PCR 回收产
物，克隆到 p-GEM T-easy 载体于室温连接 2 h。将
连接产物转入 DH5α 大肠杆菌感受态细胞，经涂布
培养、蓝白斑筛选和菌液 PCR 验证，各取 2 个阳性
克隆双向测序。
1.4 序列分析
ITS1、5.8 S 和 ITS2 序列根据 NCBI 发布的 ITS
序列确定，Dnastar 5.01 软件用于统计 GC 值；利用
ClustalX 1.81 软件进行序列比对，用 MEGA 3.1 软
件计算遗传距离和构建系统发育树，进化树的构建
采用邻近法，经 1 000 次自举检测。
2 结果与分析
2.1 ITS 序列长度和 GC 值
根据 NCBI 数据库发布的 ITS 序列，确定 11 种
石豆兰属植物 ITS1、5.8 S 和 ITS2 的序列范围。结
果表明，11 种石豆兰属植物的 ITS 全长为 633～645
bp，其中芳香石豆兰的序列最短，毛药卷瓣兰、双
叶卷瓣兰和广东石豆兰的序列最长。5.8 S 序列的长
度相同，均为 162 bp；ITS1 的长度为 232～244 bp，
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其中豹斑石豆兰的序列最短，双叶卷瓣兰最长，两
者相差 12 bp；ITS2 的长度为 231～246 bp，芳香石
豆兰的序列最短，毛药卷瓣兰的序列最长，两者相
差 15 bp。11 种石豆兰属植物 5.8 S、ITS1 和 ITS2
序列的 GC 值分别为 59.2%～61.1%、60.6%～67.9%
和 58.4%～67.1%，见表 2。
2.2 5.8 S 序列的比较分析
用 ClustalX 1.81 软件对 11 种石豆兰属植物的
ITS 序列进行对齐， 并利用 MEGA 3.1 软件获得
5.8 S、ITS1 和 ITS2 的变异位点及信息位点。结果
表明，5.8 S 序列比较保守，仅含 6 个变异位点，其
中信息位点 2 个，分别位于＋128 bp 和＋138 bp 处，
单核苷酸位点 4 个，分别位于＋85 bp、＋119 bp、
＋151 bp 和＋161 bp 处。毛药卷瓣兰、梳帽卷瓣兰、
天贵卷瓣兰和豹斑石豆兰的 5.8 S 序列完全相同，
齿瓣石豆兰、芳香石豆兰和斑唇卷瓣兰与毛药卷瓣
兰仅 1 个碱基的差别，其余 3 种植物的 5.8 S 序列
与毛药卷瓣兰之间存在 2 个碱基的差别（图 1）。
2.3 ITS1 和 ITS2 序列的比较分析
与 5.8 S 相比较，11 种石豆兰属植物的 ITS1 和
ITS2 序列变异较大，存在大量的转换、颠换和缺失
等现象（图 2、3）。ITS1 有 85 个变异位点，其中信
息位点 47 个，单核苷酸位点 37 个；ITS2 序列有 83
个变异位点，其中信息位点 48 个，单核苷酸位点
表 2 石豆兰属植物 ITS 序列长度及 G＋C 量
Table 2 Length and G + C contents of ITS sequences of plants in Bulbophyllum Thouars
5.8 S ITS1 ITS2 编 号 ITS 全长 / bp 长度 / bp (G＋C) / % 长度 / bp (G＋C) / % 长度 / bp (G＋C) / %
1 643 162 61.1 237 67.9 244 65.9
2 639 162 60.4 233 63.9 244 63.1
3 645 162 59.2 244 60.6 239 61.1
4 639 162 60.4 232 62.1 245 58.4
5 633 162 61.1 240 65.0 231 62.7
6 645 162 60.5 239 64.9 244 64.0
7 644 162 60.4 237 62.0 245 66.6
8 639 162 59.8 233 63.9 244 63.5
9 644 162 60.4 237 66.2 245 66.6
10 644 162 61.1 237 67.9 245 65.7
11 645 162 60.4 237 64.6 246 67.1


图 1 11 种石豆兰属植物 5.8 S 序列的比对
Fig. 1 Comparison on 5.8 S sequences of 11 plants in Bulbophyllum Thouars
1
5
10
2
3
8
4
7
9
11
6
1
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2
3
8
4
7
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81
81
81
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81
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81



162
162
162
162
162
162
162
162
162
162
162
﹡ 20 ﹡ 40 ﹡ 60 ﹡ 80
﹡ 100 ﹡ 120 ﹡ 140 ﹡ 160
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图 2 11 种石豆兰属植物 ITS1 序列的比对
Fig. 2 Comparison on ITS1 sequences of 11 plants in Bulbophyllum Thouars

图 3 11 种石豆兰属植物 ITS2 序列的比对
Fig. 3 Comparison on ITS2 sequences of 11 plants in Bulbophyllum Thouars

1
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2
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80
80
80
80
84



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163
165
164
162
162
162
162
169
237
237
233
233
240
239
237
237
237
232
244
2
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6
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4
3



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3


2
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3


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3




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7
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4
3
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80
80
80
67
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81
81
81
81
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163
163
163
163
160
163
164
164
164
164
158
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245
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245
239
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35 个。序列比对结果表明，双叶卷瓣兰与其他 10
种植物的 ITS1 和 ITS2 序列相差较大，存在大量的
转换、颠换和插入现象，如 ITS1 序列的＋60 位、
＋151 位和＋249 位分别有 3、1、5 bp 的插入。尽
管芳香石豆兰与广东石豆兰 ITS 序列之间存在一定
的差异，如在 ITS1 中＋118 位和 ITS2 中＋26 位分
别缺失 4 bp 和 12 bp，但与其他物种比较，两者的
差异相对较小。
2.4 进化分析
利用 ClustalX 1.81 软件对 ITS1 和 ITS2 进行排
序和比对，并用 MEGA 3.1 软件计算遗传距离，结
果表明，11 种石豆兰属植物的遗传距离在 0.002 2～
0.212 0，齿瓣石豆兰与斑唇石豆兰之间的遗传距离
最小，亲缘关系最为接近；其次是黄花卷瓣兰与
麦穗石豆兰，遗传距离为 0.004 4；双叶卷瓣兰与
广东石豆兰的遗传距离最大，为 0.212 0，两者关
系最远，与芳香石豆兰的遗传距离稍近，为 0.203 7
（表 3）。
采用邻接法（neighbor-joining，NJ）法构建系
统发育树，经 1 000 次自举检测。结果表明，11 种
石豆兰属植物可分为 2 簇，双叶卷瓣兰单独成 1 簇，
另 10 种植物归为 1 簇，并可分为若干组，即齿瓣石
豆兰与斑唇卷瓣兰、芳香石豆兰与广东石豆兰、梳
帽卷瓣兰、天贵卷瓣兰与毛药卷瓣兰、黄花卷瓣兰
与麦穗石豆兰聚为一组，而豹斑石豆兰单独成为一
组（图 4）。
表 3 11 种石豆兰属植物的遗传距离
Table 3 Genetic distances of 11 plants in Bulbophyllum Thouars
编 号 2 8 1 10 5 6 7 11 9 4 3
2
8 0.004 4
1 0.122 3 0.117 2
10 0.124 8 0.119 7 0.002 2
5 0.133 9 0.128 7 0.132 0 0.134 6
6 0.132 5 0.127 3 0.118 9 0.121 4 0.115 3
7 0.116 8 0.111 8 0.114 7 0.117 2 0.137 6 0.124 8
11 0.138 8 0.133 7 0.131 1 0.128 6 0.143 0 0.135 7 0.051 0
9 0.124 6 0.119 5 0.103 5 0.106 0 0.131 6 0.113 5 0.050 7 0.065 3
4 0.123 9 0.121 2 0.129 7 0.132 2 0.139 4 0.137 2 0.102 9 0.113 5 0.116 0
3 0.149 0 0.143 8 0.166 8 0.169 5 0.203 7 0.212 0 0.138 8 0.150 1 0.158 6 0.162 4


图 4 基于 NJ 法构建的系统发育树
Fig. 4 Phylogenetic tree constructed on NJ method
3 讨论
分子标记技术在中药鉴定中得到了广泛应用，
这些标记包括 ISSR、AFLP、SSR、RAPD 和 ITS
等。ISSR、AFLP、SSR 和 RAPD 在兰科药用植物
鉴定中已有报道，主要集中在台湾金线莲、石斛属
和铁皮石斛等植物[24-28]。ITS 序列位于 18 S 和 26 S
rDNA 基因之间，由 5.8 S 基因分成 ITS1 和 ITS2 两
段，在核基因组中高度重复，变异速度较快，具有
丰富的信息位点，可用于科以下分类单位的系统发
育分析和分子鉴定[29]。由于操作简单，结果正确，
近年来，ITS 序列在药用植物分子系统学和鉴定方
面得到了广泛应用。通过测定隔山消 Cynanchum
wilfordii、耳叶牛皮消 C. auriculatu 和泰山白首乌
C. bunge 的 ITS 序列，发现样品间存在多个变异位
点，可用于白首乌种质资源的鉴定[22]；对重齿当归
1
10
5
6
9
7
11
4
2
8
3
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Angelica biserrata、紫花前胡 A. decursiva 和骨缘当
归 A. cartilaginomarginata var. foliosa 等当归属植物
的 ITS 进行测定，结果与功效差异基本吻合[30]；比
较川乌、草乌及市场流通的混淆种类 ITS 序列，结
果表明 ITS 序列可准确鉴定这些乌头类药材[31]；通
过测定、比较牛蒡子 Arctium lappa 和伪品毛头牛蒡
A. tomentosum、大翅蓟 Onopordum acanthium、水飞
蓟 Silybum marianum 及紫穗槐 Amorpha fruticosa 的
ITS 序列，结果表明，根据 ITS 序列可有效分辨牛
蒡子及伪品[32]。
ITS 序列在兰科药用植物鉴定方面也有一些报
道，但主要集中在石斛属植物。通过测定线叶石斛
Dendrobium aurantiacum、长苏石斛 D．brymerianum、
细叶石斛 D．hartcockii 和金钗石斛 D．nobile 等的
ITS 序列，发现该序列在种内十分保守，种间则有较
大变异，可作为中药黄草石斛 D. chrysanthum 分子鉴
定的标记[20]；通过测定 17 种药用石斛的 rDNA ITS
序列，结果表明，ITS1 和 ITS2 序列的变异位点/信
息位点分别为 167/106 和 165/115 个，可以用于石斛
属药用植物的分子鉴定[33]。通过比较浙江乐清铁皮
石斛 D. officinale 与其他 34 种石斛属植物的 ITS 序
列，发现乐清铁皮石斛与黄石斛 D. tosaense 的关系
最为接近，与其他石斛的差异稍大[34]。
本研究从 11 种石豆兰属植物中克隆到了各自
的 ITS 序列，研究结果表明，序列中存在大量的转
换、颠换和缺失现象，ITS 序列的信息位点与单核
苷酸位点十分丰富，分别占总碱基的 18.8%和
13.6%，位点数量在 ITS1 和 ITS2 之间的差异不大，
利用这些位点，可将 11 种植物完全区分，因此可用
作该属植物鉴定的分子标记。11 种石豆兰属植物的
遗传距离在 0.002 2～0.212 0，在系统发育树上分为
两簇，二叶类型的双叶卷瓣兰单独成为 1 簇，10 种
单叶类型的石豆兰属植物聚为 1 簇。齿瓣石豆兰与
斑唇石豆兰之间的遗传距离最小，亲缘关系最为接
近，在进化树上归为一组，支持率达 100%；黄花
卷瓣兰与麦穗石豆兰的遗传距离次之，为 0.004 4，支
持率也为 100%，揭示了它们之间较近的亲缘关系。
11 种石豆兰属植物的 ITS 序列的克隆与比较，为
分子鉴定、遗传多样性研究和系统发育分析提供了
依据。
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